Iniezione di An. Gli embrioni stephensi per generare la malaria resistenti zanzare

Riepilogo

Zanzare anofele stephensi sono vettori per la malaria che abitano l'India e tutta l'Asia. Questo video mostra la tecnica per l'esecuzione di microiniezioni di questa specie con transgeni che conferiscono resistenza alla malaria alla zanzara. Gran parte della metodologia ha dimostrato in questo video è applicabile alle tecniche di microiniezione di altre specie di zanzare.

Abstract

L'introduzione di geni esogeni nel genoma delle zanzare richiede tecniche di microiniezione su misura per le specie di interesse specifico. Questo protocollo video dimostra un metodo utilizzato dal laboratorio di James a microinject costrutti di DNA in embrioni Anopheles stephensi per la generazione di zanzare trasformato. Tecniche di preparazione aghi microiniezione, la raccolta e la preparazione degli embrioni e l'esecuzione della microiniezione sono illustrati.

Protocollo

Preparazione in anticipo di microiniezione:

1. Zanzare alimentazione del sangue: per iniezione da Lunedi a alimentare femmine Mercoledì sul precedente Venerdì. Per iniettare Giovedi e Venerdì, le femmine si nutrono di Lunedi della stessa settimana.
   
   
2. Preparare gli aghi quarzo utilizzando il programma 2 e tampone isotonica (vedi Materiali).
   
   
3. "Posa tubo" per gli embrioni è la regolare fiala cultura Drosophila. Cotone idrofilo bagnato in fondo, con un disco di carta da filtro umida che lo ricopre.
   
   
4. Preparare antiscivolo in plastica di copertura da attaccare a doppio lato del nastro ad una estremità. Tagliare il nastro per coprire scivolare in modo che termina al bordo del vetrino.
   
   
5. Preparare l'olio per essiccamento.
   
   
6. Preparare una capsula di Petri con tampone isotonica di trasferire embrioni per la cova.

Messa a punto di posa forzata:

1. Raccogliere 6-10 sangue femmine alimentate con l'uso di un aspiratore e di trasferirli al flaconcino cultura Drosophila con cotone e carta da filtro bagnata con tampone isotonica.
   
   
2. Le zanzare vengono poi rimessi in condizioni insectery al buio e ha permesso di deporre le uova per 1 ora e 15 min.
   
   
3. Lasciate che gli adulti volare nella gabbia e rimuovere il disco filtro di carta con gli embrioni.
   
   
4. Per allineare le uova, lo fanno nell'ambito di applicazione dissezione. Raccogliere grappoli di uova con un pennello fine (Sable, n. 0000) e trasferimento in una piazza preparato di carta Whatman 3MM imbevuto di tampone isotonica. Tenere la carta sempre bagnato. Non lasciate che le uova si essiccato. Rimuovere il exochorion con il pennello, aiuta a bastone meglio le uova al nastro.
   
   
5. Utilizzando bene pinza n. 5 o un pennello fine, raccogliere gli embrioni grigio scuro e dispongono in linea sui quadrati di Whatman 3MM bagnato con tampone isotonica. Allineare 20-30 embrioni. Tutti gli embrioni devono essere nello stesso orientamento come l'iniezione deve essere al polo posteriore. L'estremità anteriore degli embrioni è leggermente più larga della posteriore. Poi, usando strisce di carta Whatman 3MM, asciugare il filtro in cui sono allineate le uova premendo duro su entrambi i lati della linea di uovo, non toccare le uova.
   
   
6. Per trasferire le uova, invertire la diapositiva che contiene il nastro biadesivo (Medicina), e premere delicatamente contro le uova. L'estremità posteriore delle uova devono essere molto vicino al bordo del nastro biadesivo. L'umidità della carta è fondamentale per questo, se è troppo bagnato che non si attacchi. Faccio essiccazione degli embrioni dal secondo 5-10, ma il tempo di essiccazione dipende dalla umido e la temperatura in camera microiniezione.
   
   
7. Essiccazione è di fondamentale importanza per le uova: po 'troppo e gli embrioni non si schiuderà. Senza DNA essiccazione non sta andando in embrione.
   
   
8. Coprire embrioni essiccati con olio Halocarbon per prevenire l'essiccamento ulteriormente.

Microiniezione degli embrioni:

L'aspetto più importante di iniezione buona è la qualità dell'ago (vedi nota).

1. Riempire un ago con la soluzione di DNA da iniettare utilizzando un microloader (Eppendorf # 5242 956,003). Molto poco soliution iniezione è necessaria, da 1 a 2 ml.
   
   
2. Collegare l'ago al Transjector Eppendorf, che controlla il tempo di iniezione e la pressione, così come la contropressione. Microiniezione viene eseguita utilizzando un microscopio con un palco in movimento (Leica) in x 10 ingrandimenti e micromanipolatore (Leica). Se necessario, una fase microscopio sollevato può essere preparata impilando vetrini da microscopio 4-5. Posizionare il vetrino porta la embrioni sul palco rialzato. Gli embrioni vengono iniettati con un angolo di 150 °; penetrazione dovrebbe essere al polo posteriore. Per l'iniezione, tengo l'ago fermo e spostare lo stadio del microscopio. Quando l'ago è nuovo, la punta è sigillato e si rompe di solito la prima iniezione. Ho sempre lavorato la pressione necessaria per espellere una piccola goccia di DNA in olio fra ogni iniezione.
   
   
3. Ho impostato il tempo di iniezione di 0,2-0,9 sec e 1000 hPa quando l'ago è nuovo. Ho variare la pressione e tempo fino una piccola goccia si vede che esce dal l'ago nel petrolio. La contropressione deve essere impostato circa 100. Come la punta dell'ago viene consumato, la pressione di iniezione deve essere ridotta per mantenere il basso volume di iniezione (circa 300 hPa). Dopo questo, la punta dell'ago è troppo grande e sta uccidendo la maggior parte delle embrioni.
   
   
4. Dopo l'iniezione, togliete l'olio con carta velina e coprire il vetrino con embrioni e posto nella scatola di Petri con tampone isotonica. Porre le capsule nella insectory e lasciarli lì fino a quando gli embrioni portello. Cominciano a schiudono dopo 2-6 giorni. Trasferire le larve di acqua distillata con il pizzico di cibo a terra di pesce.

Note

DNA per iniezione: soluzione di DNA plasmidi iniettabile è stato isolato utilizzando EndoFree kit plasmide.Costruire plasmide e mescolare Helper plasmide insieme in giusta concentrazione, precipitato con isopropanolo. Il pellet è stato lavato con etanolo al 70% prima di risospendere nel buffer di iniezione. Prima dell'iniezione, il DNA pulito utilizzando Millex-GV colonna.

Tampone Izotonic:

1,68 M NaCl - 88,3 ml 1,68 M NaCl - 2,9 m 1 M Hepes -10,7 ml 1,12 M CaCl 2-2,2 ml dH 2 O - 896 ml

O

5 M NaCl - 29,67 ml 1 M KCl - 4,87 ml 1 Hepes M - 10,7 ml 1,12 M CaCl 2-2,2 ml dH 2 O - 952,56 ml

Aggiustare a pH 7,2

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Injection Quartz needles		Sutter Instrument Co.		O.D.- 1.0 mm, I.D.-0.70, 10 cm length, are prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 mm micropipette puller.
Quartz puller	Tool	Sutter Instrument Co.	P-2000	Set-up: Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141
EndoFree plasmid kit		Qiagen
Isopropanol
Millex-GV column			SLGV RO4 NL	for DNA cleaning
Construct DNA				0.5 mg/ml
Helper plasmid				0.3 mg/ml
Injection solution	Buffer			1x solution: 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8
Isotonic buffer				see recipe in the protocol section
Dessication oil				Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1). Mix well. Prepare in advance of microinjection.
Blood				to feed mosquitos
Anopheles stephensi	Animal			Mosquitos, male and female.
Drosophila culture vial				for egg laying
Petri dishes				with isotonic buffer, for embryo hatching
Fine paintbrush				Sable # 0000
3MM Whatman paper
Forceps #5
double sided tape
Microloader		Eppendorf	5242 956.003
Transjector		Eppendorf
Microscope		Leica Microsystems		with moving stage and micromanipulator, set at 10x magnification