Ex vivo Expansion von Tumor-reaktiven T-Zellen mittels Bryostatin 1/Ionomycin und der Gemeinsamen gamma-Kette Zytokine Formulation

Zusammenfassung

Ein effizientes Protokoll für die Ex vivo Ausbau der Tumor-reaktiven T-Zellen aus Tumor-drainierenden Lymphknoten oder anderen sekundären lymphatischen Gewebe des tumortragenden Gastgeber beschrieben. Dieses Protokoll selektiv erweitert tumor-spezifische T-Zellen für den Einsatz in adoptiven Immuntherapie von Brustkrebs.

Zusammenfassung

Es wurde berichtet, dass Brustkrebs-Patientinnen bereits bestehende Immunantworten gegen ihren Tumoren ^1,2 haben. Allerdings scheitern solche Immunantwort auf einen vollständigen Schutz gegen die Entwicklung oder Wiederauftreten von Brustkrebs bieten. Zur Lösung dieses Problems durch die Erhöhung der Häufigkeit von Tumor-reaktiven T-Zellen hat adoptiven Immuntherapie eingesetzt. Eine Vielzahl von Protokollen für die Expansion von Tumor-spezifischen T-Zellen verwendet wurden. Diese Protokolle sind jedoch die Verwendung von Tumor-Antigenen ex vivo für die Aktivierung von Antigen-spezifischen T-Zellen beschränkt. Vor kurzem haben gemeinsame gamma-Kette Zytokine wie IL-2, IL-7, IL-15 und IL-21 wurden allein oder in Kombination zur Verbesserung der Anti-Tumor-Immunantwort ³ verwendet. Es ist jedoch nicht klar, was Formulierung am besten für die Expansion von Tumor-reaktiven T-Zellen. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die selektive Aktivierung und Expansion von Tumor-reaktiven T-Zellen aus dem FVBN202 transgenen Mausmodell der HER-2/neu positiven Mammakarzinoms für den Einsatz in adoptiven T-Zell-Therapie von Brustkrebs. Das Protokoll umfasst die Aktivierung von T-Zellen mit bryostatin-1/ionomycin (B / I) und IL-2 in Abwesenheit von Tumor-Antigenen für 16 Stunden. B / I Aktivierung imitiert intrazelluläre Signale, die sich in T-Zell-Aktivierung durch die Erhöhung Proteinkinase C Aktivität und den intrazellulären Kalzium-, bzw. ^4. Dieses Protokoll ausdrücklich aktiviert tumor-spezifische T-Zellen, während das Töten irrelevant T-Zellen. Die B / I-aktivierten T-Zellen werden mit IL-7 und IL-15 für 24 Stunden kultiviert und anschließend mit IL-2 gepulst. Nach 24 Stunden, T-Zellen werden gewaschen, halbiert und mit kultivierten IL-7 + IL-15 für weitere 4 Tage. Tumor-Spezifität und anti-Tumor-Wirksamkeit des ex vivo expandierten T-Zellen bestimmt.

Protokoll

1. Isolierung von Lymphozyten ⁵

1. Isolieren Tumor-drainierenden Lymphknoten oder Milz von tumortragenden FVBN202 transgenen Mäusen und bereiten einzelne Zellsuspension in eiskaltem RPMI1640 mit 10% FBS. B / I-Aktivierung in 50-ml-Polypropylen-konische Gefäße führt zu einer größeren T-Zell-Ausbeute auf Polystyrol-Röhrchen verglichen. Ketamin und Xylazin injiziert ip für die Anästhesie. Genickbruch ist als eine Methode der Euthanasie verwendet.
2. Kultur der Zellen (10 ⁶ Zellen / ml) in Vollmedium mit 15% FBS mit Bryostatin-1 (5 nM) und Ionomycin (1 pM) zusammen mit 80 U / ml IL-2 (PeproTech) für 16 h.
3. Waschen Sie die Zellen dreimal mit warmem Medium (37 ° C) und die Kultur bei 10 ⁶ Zellen / ml in komplettem Medium mit IL-7 (10 ng / ml) und IL-15 (10 ng / mL) (PeproTech) für 24 h .
4. Pulse der Zellen mit IL-2 (40 U / mL) für 24 h.
5. Split der Zellen und Kultur sie mit IL-7 und IL-15 (10 ng / mL) für 4 Tage. Ändern Sie mittel-und spaltete die Zellen, wenn jeder benötigt 2 Tage.

2. Bestimmen Sie falten Expansion von T-Zellen durch Zellzahlen und Durchflusszytometrie Analyse ⁵

1. Die Zellzahlen mittels Lichtmikroskopie
   1. Bereiten Sie entsprechende Zelle Verdünnung (1:100) in Trypanblau und fügen einige ul auf Hämozytometer
   2. Count 9 Felder und bestimmen gesamte Zellzahl, indem Zellzahl, die Anzahl der Kammern mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert. Die Ergebnisse präsentieren Anzahl x 10 ⁴ Zellen / ml.
2. Bestimmen Anteil der CD8 + und CD4 + T-Zellen in der expandierten Zellen mittels Durchflusszytometrie
   1. Block nicht-spezifische Bindung von Antikörpern an Fc-Rezeptoren durch Kultivierung der Zellen mit anti-CD16/CD32 Antikörper (Biolegend) für 20 min auf Eis und dann waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml eiskaltem PBS mit 1% Natriumazid .
   2. Stain die Zellen durch Kultivierung mit FITC-CD4 und PE-CD8-Antikörper für 20 min auf Eis und dann waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml eiskaltem PBS mit 1% FBS und 0,1% Natriumazid ergänzt.
   3. Fix die Zellen mit 1% Paraformaldehyd und laufen Proben auf einem Beckman Coulter FC 500 und analysieren mit Summit Version 4.3 Software.

3. Bestimmen Tumor-Spezifität der ex vivo expandierte T-Zellen

1. Kultur der ex vivo expandierten Lymphozyten in Vollmedium bei einem Verhältnis von 10:1 mit bestrahlten neu positive MMC Tumorzellen (15.000 rad) für 24 h. ⁵
2. Ernte Überstände und bei -80 ° C bis zur Verwendung. ^5,6
3. Detect IFN-γ mit einem Maus-IFN-γ ELISA-Set (BD Pharmingen) nach dem Protokoll des Herstellers. ^5,6

4. Bestimmen Sie Anti-Tumor-Funktion des ex vivo expandierte T Cells ^5,6

1. Inkubieren T-Zellen mit Tumorzellen in einem 10:1 Effektor: Target-Verhältnis für 48 Stunden in Vollmedium bei 3 ml Vollmedium (RPMI-1640 ergänzt mit 100U / ml Penicillin, 100 &mgr; g / ml Streptomycin, 10% FBS, Glutamin und β - Mercaptoethanol) und 20U / ml IL-2 (PeproTech) in 6-Well Kulturschalen 37 ° C / 5% CO _2.
2. Führen Sie drei Farb-Antikörper-Färbung für neu (anti-c-Erb2/c-neu, Klon-4, Calbiochem) von PE-anti-Maus IgG, Annexin V-FITC und Propidiumiodid (PI) nach dem Protokoll des Herstellers (BD Pharmingen), gefolgt
3. Gate auf neu positive Tumorzellen und zu analysieren Lebensfähigkeit (Annexin V-/PI-) der Tumorzellen

5. Mausmodell für Brustkrebs

FVBN202 transgenen weiblichen Mäusen (Charles River Laboratories) für die Quelle von tumor-reaktiven T-Zellen verwendet werden. Diese Mäuse überexprimieren ein nicht aktiviertes Ratte neu Transgen unter der Kontrolle eines MMTV-Promotor und als Folge entwickeln spontane Mammakarzinom zwischen 4-10 Monaten ab ⁷ Jahren. Diese Mäuse entwickeln prämalignen Mamma Hyperplasie ähnlich duktales Carcinoma in situ (DCIS) vor der Entwicklung des spontanen carcinoma8. Spontane tumortragenden Mäusen als Spender von T-Zellen verwendet.

6. Repräsentative Ergebnisse:

Die Aktivierung von T-Zellen mit B / I für 16 Stunden Ergebnisse bei der Abtötung von naiven T-Zellen, die nicht sensibilisiert mit dem Tumor in vivo. Nach dem B / I-Selektivität von tumor-reaktiven T-Zellen, die sie erweitern bis zu 2,8-fache innerhalb eines 6-Tages-Kultur mit der gamma-Kette Zytokine (Abbildung 1). Beide CD8 + und CD4 + T-Zellen sind ebenfalls mit der gamma-Kette Zytokine (Abbildung 2) erweitert. Die ex vivo expandierten T-Zellen zeigen eine hohe Reaktionsfähigkeit gegen die Tumoren, die Spender Mäuse sensibilisiert wurden, als durch die Produktion von IFN-γ in Gegenwart von neu positive Maus Mammakarzinom (MMC) Tumorzellen (Abbildung 3) ausgewertet. Die ex vivo expandierten T-Zellen kann die Apoptose in den neu positive MMC Tumor cel induzierenls, so dass die Lebensfähigkeit der Tumorzellen Tropfen von 92% auf 61% innerhalb von 48 Stunden (Abbildung 4).

Abbildung 1. Falten Expansion von Lymphozyten zu verschiedenen Zeitpunkten nach B / I-Aktivierung (Tag 1) und ex vivo Expansion mit der gamma-Kette Zytokine (Tage 3, 5 und 7)

Abbildung 2. Gesamter CD4 + und CD8 + T-Zellen vor und nach einer 7-Tage-Expansion mit der gamma-Kette Zytokine.

Abbildung 3. Tumor-stimulierten IFN-γ Produktion von T-Zellen aus tumortragenden Mäusen vor und nach einer 7-tägigen Expansion mit der gamma-Kette Zytokine isoliert, mit IFN-γ ELISA

Abbildung 4. Zytotoxische Funktion der ex vivo expandierten T-Zellen mit der gamma-Kette Zytokine gegen neu positive Maus Mammakarzinom (MMC) Tumorzellen

Diskussion

Selektiver Ausbau von Tumor-reaktiven T-Zellen mit Effektorfunktionen Anti-Tumor-Funktion kann durch das vorgeschlagene Protokoll mit B erreicht werden / I Aktivierung und ex vivo Expansion mit der gamma-Kette Zytokine IL-2, IL-7 und IL-15. Während IL-2 ist ein T-Zell-Wachstumsfaktor, der die Differenzierung und Expansion von Antigen-spezifischen T-Zellen unterstützt, können IL-7 inhibiert die Apoptose von T-Zellen und unterstützen ihre Lebensfähigkeit während der Expansion. IL-15 unterstützt Memory T-Ze...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bryostatin 1	Sigma-Aldrich	B7431-10ug
Ionomycin	Calbiochem	407950
Mouse IL-7	PeproTech Inc	217-17
Mouse IL-15	PeproTech Inc	210-15
Human IL-2	PeproTech Inc	200-02
RPMI1640	Invitrogen	11875
FBS	Gemini Bio Products	100-106
Penicillin/Streptomycin	Cellgro	30-002-CI
L- glutamine	Invitrogen	25030081
β- mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M7522
anti-CD16/32 antibody	Biolegend	101302
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit	BD Biosciences	556547
FITC-CD4	Biolegend	100406
PE-CD8	Biolegend	100708
anti-c-Erb2/c–Neu	Calbiochem	OP16
PE- anti mouse IgG	Biolegend	405307
formaldehyde	Polysciences, Inc.	04018
Hemocytometer	Hycor	87144
Light microscope	VWR international	V200073
Mouse IFN-γ ELISA set	BD Biosciences	555138
Cell culture flasks	Greiner Bio-One	658175