Bryostatin의 1/Ionomycin에 의해 종양 반응 T 세포의 생체내 전 확장 및 일반 감마 체인 크린 시토킨 제제

요약

에 대한 효율적인 프로토콜 예 생체내 확장을 설명합니다. 이 프로토콜은 선택 유방암의 입양 immunotherapy에 사용하기 위해 종양 특정 T 세포를 확장합니다.

초록

이것은 유방암 환자들은 종양의 ^1,2에 대한 기존의 면역 반응을보고했다. 그러나, 이러한 면역 반응은 유방암의 개발이나 재발에 대한 완벽한 보호를 제공하기 위해 실패합니다. 종양 반응 T 세포의 빈도를 증가하여이 문제를 극복하기 위해 입양 immunotherapy가 채용되었습니다. 프로토콜의 다양한 종양 관련 T 세포의 확장을 위해 사용되었습니다. 이러한 프로토콜은, 그러나, 항원에 특정한 T 세포의 활성화를위한 종양 항원의 전의 생체내의 사용을 제한하고 있습니다. 아주 최근에, 이러한 IL - 2, IL - 7, IL - 15, IL - 21과 같은 일반 감마 체인 크린 시토킨는 안티 종양 면역 반응 ^3의 강화를 위해 단독으로 또는 조합하여 사용되었습니다. 그러나 제제는 종양 반응 T 세포의 확장에 가장 적합한 것이 무엇인지에 대해서는 아직 알려진 바가 없다. 여기서 우리는 선택 활성화 및 유방암의 입양 T 세포 치료에 사용하기 위해 HER-2/neu 양성 유방 암종의 FVBN202 유전자 변형 마우스 모델에서 종양 반응 T 세포의 확장을위한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 16 시간 동안 종양 항원의 부재에서 bryostatin-1/ionomycin (B / I)와 IL - 2와 T 세포의 활성화를 포함하고 있습니다. B / I 활성화 세포내 신호를 모방 것을 각각 ^4, 단백질 키나제 C의 활동과 세포 내 칼슘을 증가시켜 T 세포 활성화의 결과. 없는 T 세포를 죽이는 동안이 프로토콜은 특히 종양 특정 T 세포를 활성화한다. B / I - 활성 T 세포는 24 시간 동안 IL - 7과 IL - 15과 교양 그리고 IL - 2 펄스입니다. 24 시간 후에, T 세포가와 분할을 씻어하고, 양식 아르 IL - 7 + 추가 4 일간 IL - 15. 전 생체내 확대 T 세포의 종양 - 특이성 및 안티 종양 효능이 결정됩니다.

프로토콜

1. Lymphocytes ⁵ 분리

1. 격리 종양 - 배수 림프절이나 종양 - 베어링 FVBN202 유전자 변형 생쥐의 spleens과 얼음처럼 차가운 RPMI1640에서 단일 세포 현탁액을 준비 10 % FBS와 함께 보충. 큰 T 세포 수율 50 - ML 폴리 프로필렌 원뿔 튜브 결과에서 B / I 활성화 폴리스티렌 튜브에 비해. 마취제와 Xylazine는 마취에 대한 IP를 주입하고 있습니다. 자궁 경부 전위는 안락사의 방법으로 사용됩니다.
2. 문화 16 H.에 대한 IL - 2 (Peprotech) 80 U / ML과 함께 bryostatin - 1 (5 NM)와 ionomycin (1 μm의)와 15% FBS를 포함하는 완전한 매체 전지 (10 ⁶ 세포 / ML)
3. 24 H에 대한 IL - 7 (10 NG / ML)와 IL - 15 (10 NG / ML) (Peprotech)와 완전한 매체 10 ⁶ 세포 / ML에서 따뜻한 매체 (37 ° C)와 문화 셀에 세 번 씻어 .
4. 24 H.에 대한 IL - 2 (40 U / ML)와 세포 펄스
5. 4 일간 IL - 7과 IL - 15 세포와 문화를 (10 NG / ML) 분할. 매체 변경 2 일마다 필요한 경우 세포를 분리.

2. 셀 카운트 및 유동세포계측법 분석 ⁵ T 세포의 폴드 확장 결정

1. 가벼운 현미경으로 세포 카운트
   1. trypan 파란색으로 적절한 세포 희석 (1:100)을 준비하고 hemocytometer로 몇 μL를 추가
   2. 9 사각형을 계산하고 희석 계수를 곱한 챔버의 숫자로 셀 계산을 나누어 총 휴대폰 번호를 확인합니다. 결과는 숫자 X 10 ⁴ 셀 / ML를 제공합니다.
2. 유동세포계측법하여 확장 세포의 CD8 +와 CD4 + T 세포의 비율을 결정
   1. 얼음 20 분 anti-CD16/CD32 항체 (Biolegend)과 culturing에 의해 FC 수용체에 항체가 아닌 특정 바인딩 세포를 차단하고 얼음처럼 차가운 PBS 2 ML있는 셀에 두 번 씻어 1 %의 나트륨 azide와 보충 .
   2. 얼음 20 분 FITC - CD4 및 CD8 PE - 항체와 culturing하여 세포를 얼룩 후 1% FBS와 0.1 %의 나트륨 azide와 보충 얼음처럼 차가운 PBS 2 ML있는 셀에 두 번 씻는다.
   3. 1 % paraformaldehyde로 세포를 고정하고 베크맨 쿨터 FC 500 샘플을 실행하고 서밋 버전 4.3 소프트웨어를 사용하여 분석할 수 있습니다.

3. 예 VIVO의 종양 - 특이성 결정 T 세포를 확대

1. 문화 예 생체내 24 H. ⁵ 반구 뉴 긍정 MMC 종양 세포와 10시 1분 비율 (15,000 방사선)에서 완전한 매체 lymphocytes 확대
2. 사용하기 전까지 -80 ° C에서 수확 supernatants 및 저장합니다. ^5,6
3. 검색 IFN - γ 제조 업체의 프로토콜에 따라 마우스 IFN - γ 엘리사 세트 (BD Pharmingen)를 사용합니다. ^5,6

4. 전 VIVO 확장 T 셀 ^5,6의 안티 종양 기능을 결정

1. 3 ML 전체 매체 (RPMI - 1640 페니실린의 100U / ML, 100μg / ML 스트렙토 마이신, 글루타민 및 β 10% FBS와 보충에 완전한 매체 48 시간 동안 대상 비율 : 10시 1분 이펙터에 종양 세포와 함께 품어 T 세포 - 메르 캅 토 에탄올) 6 잘 문화 요리 37 ° C / 5 % CO _2에서 IL - 2 (Peprotech)의 20U / ML.
2. 제조 업체의 프로토콜에 따라 PE - 방지 마우스 IgG, Annexin V - FITC와 Propidium의 이우 (PI) (BD Pharmingen) 다음 뉴 세 컬러 항체 얼룩 (anti-c-Erb2/c-neu, 클론 - 4, Calbiochem)을 수행
3. 종양 세포의 뉴 긍정적인 종양 세포에서 게이트 및 분석 생존 (Annexin V-/PI-)

5. 유방암의 마우스 모델

FVBN202 형질 여성 생쥐 (찰스 리버 연구소)는 종양 반응 T 세포의 출처에 사용될 수 있습니다. 이 마우스는 MMTV업자의 규정에 따라 unactivated 쥐 뉴 transgene을 overexpress 그 결과 연령 ⁷ 40~10개월 간의 자발적인 내유 암종을 개발합니다. 이 마우스는 자연 carcinoma8 개발하기 전에 원래의 장소에 ductal 암종 (DCIS)과 비슷 premalignant 내유 증식을 개발합니다. 자발적인 종양 - 베어링 생쥐는 T 세포의 기증자으로 사용됩니다.

6. 대표 결과 :

생체내에있는 종양에 sensitized 없습니다 나이브 T 세포의 살해 16 시간 결과에 대한 B / I와 T 세포의 활성화. 그들은 감마 체인 크린 시토킨 (그림 1)과 함께 6 일 문화 이내에 2.8 배까지 확대 종양 반응 T 세포의 B / I 선택성 후. CD8 +와 CD4 + T 세포가 균일하게 감마 체인 크린 시토킨 (그림 2)로 확장되는 모두. 전 생체내 - 확장 T 세포는 뉴 긍정적인 마우스 내유 암종 (MMC) 종양 세포 (그림 3)의 면전에서 IFN - γ의 생산에 의해 평가 등 기증자 쥐가에 sensitized다고 종양에 대한 높은 반응을 보여줍니다. 전 생체내는 확장 T 세포는 뉴 긍정 MMC 종양의 셀에 apoptosis을 일으킬 수종양 세포의 생존과 같은 것을인가 92 %에서 48 시간 이내 61% (그림 4) 방울.

그림 1. B / I 활성화 (1 일) 및 감마 체인 크린 시토킨로 전직 생체내 확장 (일 3, 5, 7) 다음과 같은 서로 다른 시간 시점에서 lymphocytes의 폴드 확장

그림 2. CD4 +와 CD8 + T 세포의 총 비율 전에 감마 체인 크린 시토킨와 함께 7 일 이후에 확장.

그림 3. IFN - γ를 사용하기 전에 감마 체인 크린 시토킨와 함께 7 일 확장과 후 종양 베어링 생쥐에서 분리된 T 세포에 의해 생산, IFN - γ 엘리사 종양 자극

그림 4. 뉴 긍정적인 마우스 내유 암종 (MMC) 종양 세포에 대한 감마 체인 크린 시토킨와 T 세포를 확장 전 생체내 세포 독성의 기능

토론

효과기 안티 종양 기능으로 종양 반응 T 세포의 선택적 확장은 B를 사용하여 제안된 프로토콜에 의해 얻을 수있는 I / 활성화 및 감마 체인 크린 시토킨 IL - 2, IL - 7과 IL - 15 예 생체내 확장. IL - 2 항원에 특정한 T 세포의 분화와 확장을 지원할 수 T 세포 성장 인자이지만, IL - 7은 T 세포의 apoptosis를 억제하고 확장하는 동안 그들의 생존을 지원할 수 있습니다. IL - 15은 T 세포 입양 요법 ^9-11시...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bryostatin 1	Sigma-Aldrich	B7431-10ug
Ionomycin	Calbiochem	407950
Mouse IL-7	PeproTech Inc	217-17
Mouse IL-15	PeproTech Inc	210-15
Human IL-2	PeproTech Inc	200-02
RPMI1640	Invitrogen	11875
FBS	Gemini Bio Products	100-106
Penicillin/Streptomycin	Cellgro	30-002-CI
L- glutamine	Invitrogen	25030081
β- mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M7522
anti-CD16/32 antibody	Biolegend	101302
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit	BD Biosciences	556547
FITC-CD4	Biolegend	100406
PE-CD8	Biolegend	100708
anti-c-Erb2/c–Neu	Calbiochem	OP16
PE- anti mouse IgG	Biolegend	405307
formaldehyde	Polysciences, Inc.	04018
Hemocytometer	Hycor	87144
Light microscope	VWR international	V200073
Mouse IFN-γ ELISA set	BD Biosciences	555138
Cell culture flasks	Greiner Bio-One	658175