Expansion ex vivo des cellules tumorales T-réactive par le moyen de 1/Ionomycin Bryostatine et la chaîne gamma commune cytokines Formulation

Résumé

Un protocole efficace pour la Ex vivo Extension de cellules T réactives tumeur des ganglions lymphatiques drainant la tumeur ou d'autres tissus lymphoïdes secondaires porteurs de tumeurs hôtes est décrite. Ce protocole étend sélectivement les cellules T spécifiques de la tumeur pour une utilisation en immunothérapie adoptive du cancer du sein.

Résumé

Il a été rapporté que les patients du cancer du sein ont pré-existante des réponses immunitaires contre leurs tumeurs ^1,2. Cependant, ces réponses immunitaires ne parviennent pas à fournir une protection complète contre le développement ou la réapparition du cancer du sein. Pour surmonter ce problème en augmentant la fréquence des cellules T réactives tumeurs, immunothérapie adoptive a été employé. Une variété de protocoles ont été utilisés pour l'expansion des cellules T spécifiques de la tumeur. Ces protocoles, cependant, sont limités à l'utilisation d'antigènes tumoraux ex vivo pour l'activation des cellules T spécifiques de l'antigène. Très récemment, la chaîne gamma commune des cytokines comme l'IL-2, IL-7, l'IL-15 et IL-21 ont été utilisés seuls ou en association pour l'amélioration de l'anti-tumorale des réponses immunitaires ^3. Toutefois, il n'est pas clair ce que la formulation serait le mieux pour l'expansion des cellules T réactives tumeur. Nous présentons ici un protocole pour l'activation sélective et l'expansion de la tumeur des cellules T réactives à partir du modèle de souris transgénique FVBN202 de carcinome mammaire HER-2/neu positifs pour une utilisation en thérapie cellulaire adoptive T du cancer du sein. Le protocole inclut l'activation des cellules T avec bryostatin-1/ionomycin (B / I) et l'IL-2 en l'absence d'antigènes tumoraux pour les 16 heures. B / Je activation imite signaux intracellulaires qui aboutissent à l'activation des cellules T en augmentant la protéine kinase C et de l'activité intracellulaire de calcium, respectivement ^4. Ce protocole active spécifiquement les cellules T spécifiques de la tumeur tout en tuant les cellules T non pertinentes. Les cellules B / I-T activées sont cultivées avec de l'IL-7 et IL-15 pendant 24 heures puis pulsé avec de l'IL-2. Après 24 heures, les cellules T sont lavés, split, et cultivé avec de l'IL-7 + IL-15 pour les 4 jours supplémentaires. L'efficacité de tumeur spécificité et anti-tumorale des cellules T ex vivo élargi est déterminé.

Protocole

1. Isolement des lymphocytes ⁵

1. Isoler les ganglions lymphatiques drainant la tumeur ou de rates de porteurs de tumeurs FVBN202 souris transgéniques et de préparer la suspension cellulaire unique glacée RPMI1640 complété avec 10% de FBS. B / I d'activation dans 50 ml résultats polypropylène tubes coniques en un rendement de plus de cellules T par rapport à des tubes en polystyrène. Kétamine et de xylazine sont injectés ip pour l'anesthésie. La dislocation cervicale est utilisée comme une méthode d'euthanasie.
2. Culture des cellules (10 ⁶ cellules / mL) dans un milieu complet contenant 15% de FBS avec bryostatine-1 (5 nM) et de l'ionomycine (1 uM) avec 80 U / ml d'IL-2 (Peprotech) pendant 16 h.
3. Laver les cellules trois fois avec du milieu chaud (37 ° C) et la culture à 10 ⁶ cellules / ml dans un milieu complet avec de l'IL-7 (10 ng / ml) et de l'IL-15 (10 ng / ml) (Peprotech) pendant 24 h .
4. Impulsion des cellules avec de l'IL-2 (40 U / ml) pendant 24 h.
5. Fractionner les cellules et la culture entre eux avec de l'IL-7 et IL-15 (10 ng / ml) pour 4 jours de plus. Changement moyen et fractionner les cellules si nécessaire tous les 2 jours.

2. Déterminer l'expansion des cellules T Pliez dénombrement des cellules et cytométrie en flux ⁵

1. Numération des cellules par microscopie optique
   1. Préparer une dilution appropriée de cellules (1:100) dans le bleu trypan et ajouter quelques uL sur hématimètre
   2. Chef 9 places et de déterminer le nombre total de cellules en divisant numération cellulaire au nombre de chambres, multiplié par le facteur de dilution. Les résultats seront présents un nombre x 10 ⁴ cellules / mL.
2. Déterminer la proportion de cellules CD8 + et cellules T CD4 + dans les cellules élargi par cytométrie en flux
   1. Bloc de fixation non spécifique des anticorps aux récepteurs Fc par culture des cellules avec des anticorps anti-CD16/CD32 (Biolegend) pendant 20 min sur la glace, puis laver les cellules deux fois avec 2 ml de PBS glacé complété par de l'azide de sodium à 1% .
   2. Colorer les cellules en culture avec FITC-CD4 et CD8-PE pendant 20 min sur la glace, puis laver les cellules deux fois avec 2 ml de PBS glacé supplémenté avec 1% de FBS et de l'azide de sodium à 0,1%.
   3. Fixer les cellules avec du paraformaldéhyde à 1% et exécuter des échantillons sur un FC 500 de Beckman Coulter et d'analyser en utilisant la version 4.3 du logiciel du Sommet.

3. Déterminer Tumor-spécificité de l'ex vivo élargi cellules T

1. Culture de l'ex vivo les lymphocytes élargi dans un milieu complet à un ratio 10:1 avec irradiés neu positifs cellules tumorales MMC (15 000 rad) pendant 24 h. ⁵
2. Surnageants récolte et conserver à -80 ° C jusqu'à leur utilisation. ^5,6
3. Détecter l'IFN-γ en utilisant une souris IFN-γ ELISA Set (BD Pharmingen) selon le protocole du fabricant ^5,6.

4. Déterminer la fonction anti-tumorale des cellules T ex vivo élargi ^5,6

1. Incuber les cellules T avec des cellules tumorales dans un effecteur 10h01: ratios cibles pendant 48 heures dans un milieu complet à 3 mL de milieu complet (RPMI-1640 complété par 100U / mL de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 10% de FBS, la glutamine et β - mercaptoéthanol) et 20U / mL d'IL-2 (Peprotech) dans 6 boîtes de culture ainsi 37 ° C CO / 5% _2.
2. Effectuer trois coloration des anticorps couleur pour neu (anti-c-Erb2/c-neu, clone-4, Calbiochem), suivie par PE anti-IgG de souris, l'annexine V-FITC et l'iodure de propidium (PI) selon le protocole du fabricant (BD Pharmingen)
3. La viabilité porte sur les cellules tumorales positives neu et d'analyser (annexine V-/PI-) des cellules tumorales

5. Modèle murin de cancer du sein

FVBN202 souris transgéniques femelles (Charles River Laboratories) peut être utilisé pour la source de cellules T réactives tumeur. Ces souris surexprimant une non activé chez le rat neu transgène sous le contrôle du promoteur MMTV et par conséquent développer des carcinomes mammaires spontanées entre 4-10 mois d'âge ^7. Ces souris développent précancéreuses hyperplasie mammaire semblable à un carcinome canalaire in situ (CCIS) avant le développement de carcinoma8 spontanée. Spontanée souris porteuses de tumeurs sont utilisés comme donneurs des cellules T.

6. Les résultats représentatifs:

L'activation des cellules T avec B / I pour les résultats heures 16 en tuant des cellules T naïves qui ne sont pas sensibilisés à la tumeur in vivo. Après la sélectivité B / I des lymphocytes T tumoraux réactive ils étendent jusqu'à 2,8 fois dans une culture de 6 jours avec les cytokines chaîne gamma (figure 1). Les deux CD8 + et cellules T CD4 + sont également élargi avec les cytokines chaîne gamma (figure 2). L'ex vivo des cellules T-élargi montrent une grande réactivité contre les tumeurs que les souris ont été sensibilisées aux donateurs, tel qu'évalué par la production d'IFN-γ, en présence d'un carcinome mammaire de neu souris positives (MMC) des cellules tumorales (figure 3). L'expansion ex vivo des cellules T peut induire l'apoptose dans les tumeurs neu cel positifs MMCls tels que la viabilité des cellules tumorales baisses de 92% à 61% dans les 48 heures (figure 4).

Figure 1. Pliez l'expansion des lymphocytes à différents moments suivants B / I d'activation (jour 1) et l'expansion ex vivo avec des cytokines chaîne gamma (jours 3, 5 et 7)

Figure 2. Pourcentage total de lymphocytes CD4 + et CD8 + T avant et après une expansion de 7 jours avec les cytokines chaîne gamma.

Figure 3. Tumorale stimulée par la production d'IFN-γ par les lymphocytes T isolés de souris porteuses de tumeurs avant et après une expansion de 7 jours avec les cytokines chaîne gamma, IFN-γ en utilisant ELISA

Figure 4. Fonction cytotoxique de l'expansion ex vivo des cellules T avec les cytokines chaîne gamma contre le carcinome mammaire de neu souris positives (MMC) des cellules tumorales

Discussion

L'expansion sélective des cellules T tumeur réactive avec effecteur la fonction anti-tumorale peut être réalisé en utilisant le protocole proposé B / I d'activation et l'expansion ex vivo avec des cytokines chaîne gamma IL-2, IL-7 et IL-15. Alors que l'IL-2 est un facteur de croissance des cellules T qui peuvent soutenir la différenciation et l'expansion des cellules T spécifiques de l'antigène, l'IL-7 peut inhiber l'apoptose des cellules T et le soutien de leur viabili...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bryostatin 1	Sigma-Aldrich	B7431-10ug
Ionomycin	Calbiochem	407950
Mouse IL-7	PeproTech Inc	217-17
Mouse IL-15	PeproTech Inc	210-15
Human IL-2	PeproTech Inc	200-02
RPMI1640	Invitrogen	11875
FBS	Gemini Bio Products	100-106
Penicillin/Streptomycin	Cellgro	30-002-CI
L- glutamine	Invitrogen	25030081
β- mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M7522
anti-CD16/32 antibody	Biolegend	101302
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit	BD Biosciences	556547
FITC-CD4	Biolegend	100406
PE-CD8	Biolegend	100708
anti-c-Erb2/c–Neu	Calbiochem	OP16
PE- anti mouse IgG	Biolegend	405307
formaldehyde	Polysciences, Inc.	04018
Hemocytometer	Hycor	87144
Light microscope	VWR international	V200073
Mouse IFN-γ ELISA set	BD Biosciences	555138
Cell culture flasks	Greiner Bio-One	658175