The Culture of Primary Motor und sensorischen Neuronen in definierten Medien auf Elektrogesponnene Poly-L-Lactid Nanofiber Gerüste

Zusammenfassung

Ausgerichtet elektroversponnenen Fasern direkt das Wachstum von Neuronen in vitro und stellen eine potentielle Komponente der Nervenregeneration Gerüsten. Wir beschreiben ein Verfahren zur Herstellung elektrogesponnenen Fasersubstrate und das Serum-freie Kultur von primären Ratten-E15 sensorischen (DRG) und motorischen Neuronen. Visualisierung von Neuronen durch Immunzytochemie ist ebenfalls enthalten.

Zusammenfassung

Elektrospinnen ist eine Technik zur Herstellung von Mikro-bis Nano-Fasern. Fasern können mit unterschiedlichem Grad der Ausrichtung von hoch zu völlig zufällig ausgerichtet elektrogesponnenen werden. Darüber hinaus können Fasern aus einer Vielzahl von Materialien, einschließlich biologisch abbaubare Polymere wie Poly-L-Milchsäure (PLLA) gesponnen werden. Diese Eigenschaften machen elektroversponnenen Fasern geeignet für eine Vielzahl von Gerüsten Anwendungen im Tissue Engineering. Unser Fokus liegt auf den Einsatz von ausgerichtet elektrogesponnenen Fasern für die Regeneration von Nerven. Wir haben bereits gezeigt, dass ausgerichtet elektrogesponnenen PLLA-Fasern das Auswachsen von primären sensorischen und motorischen Neuronen in vitro zu lenken. Wir behaupten, daß die Verwendung eines primären Zellkultur-System unerlässlich ist bei der Beurteilung Biomaterialien zu modellieren realen Neuronen in vivo so eng wie möglich zu finden. Hier beschreiben wir Techniken, die in unserem Labor verwendet werden, um faserigen Gerüste und Kultur Spinalganglien Explantate sowie dissoziiert sensorischen und motorischen Neuronen, auf elektrogesponnenen Gerüste electrospin. Allerdings sind die Elektrospinnen und / oder Kultur hier vorgestellten Verfahren leicht für die Verwendung in anderen Anwendungen angepasst.

Protokoll

1. Poly-L-Milchsäure (PLLA) Spinning-Lösung

1. Lösen Sie 0,4 g PLLA in 9 mL Chloroform unter Rühren bei schwacher Hitze.
2. 1 ml Dimethylformamid auf die Lösung, womit sich die Endkonzentration der Lösung auf 4% PLLA (w / v) in Chloroform: DMF 9:1 (v / v).
3. Legen Sie die Lösung in einem Polypropylen oder Glas-Spritze mit einer stumpfen 23ga Metallspitze.

2. Spinning Substrat Vorbereitung ¹

1. Machen Sie einen 8% (w / v) Lösung von 85:15 PLGA (Poly-Milchsäure-co-Glycolsäure) in Chloroform unter Rühren bei schwacher Hitze.
2. Coat sauber Glasdeckgläschen in PLGA durch Abdecken der Oberfläche jedes Deckglas mit der PLGA-Lösung. Lassen Sie die PLGA zu einem dünnen Film (ca. 30 min) trocknen lassen.

3. Elektrospinnen ²

1. Sichere PLGA beschichtet Glasdeckgläschen zum Kollektor mit leitfähigem Kohlenstoff Band. Für ausgerichteten Fasern, ist der Kollektor einer motorisch angetriebenen Rades. Für Wirrfasern, ist der Kollektor eine stationäre Platte.
2. Legen Spritze in Pumpe mit Spitze 20 cm vom Kollektor Rad. Set Pumpe auf ca. 2 ml / h und bei Verwendung eines Rades, die den Motor auf 300-400 RPM. Wenn möglich, tragen Sie eine -2 kV DC-Vorspannung an den Kollektor und +15 kV auf Metallspitze. In Abwesenheit des Zugangs zu einer bipolaren Spannungsversorgung, Masse des Kollektors.
3. Fasern Strahl aus der Spritze und sammeln auf dem rotierenden Rad. Weiter dreht, bis die gewünschte Dichte der Fasern erreicht wird. Swipe der Metall-Spitze mit einem Papiertuch angebracht, um eine nicht-leitenden Stab in regelmäßigen Abständen zur Vermeidung von Verstopfungen an der Spitze.

4. Moating ¹

1. Nach Spinnen, "Graben" der elektrogesponnenen Proben durch Pipettieren einer Reihe von PLGA um den Umfang des Deckglases. Lassen Sie die PLGA, um zu trocknen. Dies erhält die Ausrichtung der Fasern während der Kultur.

5. Protein-Beschichtung

1. Elektrogesponnene Fasern und Glas Kontrollen müssen in Protein vor Zellkultur beschichtet werden. Decken Sie die Substrate in einem Protein-Lösung für mindestens eine Stunde und dann absaugen überschüssige Lösung und weiterhin Absaugen, bis die Substrate trocken sind. Mögliche Protein-Lösungen gehören: PLL _{(Poly-L-Lysin)} (100 pg / mL), Laminin (25 ug / mL) oder Fibronektin (50 ug / mL). Wenn PLL verwendet wird, sollte Substrate in sterilem Wasser gespült und getrocknet werden zweimal nach der ersten Beschichtung.

6. Erhalten E15 Rattenembryonen ³

* Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den NIH Leitfaden für Pflege und Verwendung von Labortieren durch die University of Michigan Ausschuss für Verwendung und Pflege von Tieren zugelassen getan.

1. Zubereitung: Prüfen Sie, ob das Tier schwanger ist. Thaw 3 ml Trypsin, 3 ml FBS und warm eine Flasche L15. Feuer Politur einer Pasteurpipette. Desinfizieren Sie alle chirurgischen Instrumente in 70% Ethanol für 30 min.
2. Vorbereiten und warmen plating Medien (siehe Tabelle 1).
3. Euthanasie: Führen Sie eine IP-Injektion von Ketamin / Xylazin. Warten Sie 10-15 Minuten und überprüfen Sie die fehlenden Hornhaut-und Pedal-Rücktritt Reflexe. Sobald Reflexe fehlen, führen Sie eine IC Injektion von Pentobarbital (FatalPlus).
4. Tent die Haut des Bauches. Schnitt durch die Haut-und Muskelschichten der Bauchhöhle aussetzen. Suchen Sie die Gebärmutter und lösen sie auf den Gebärmutterhals und Eierstöcken.
5. Entfernen Sie die Embryonen aus der Gebärmutter mit einer Schere und legen Sie sie sofort in warmes L15. (Alle folgenden Verfahren werden unter einem Binokular und Embryonen abgeschlossen und seziert Kabel sollten in warmen L15 jederzeit getaucht werden.) Enthaupten die Embryonen durch die Schließung einer Pinzette um das Kinn und unter dem Hinterhauptbein des Schädels.

7. Dissection ³

1. Setzen Sie den Embryo auf einer Seite. Schützen Sie das Rückenmark mit einem Satz von Zangen, während Sie den anderen Satz zu abstreifen Gliedmaßen und Bauchorgane.
2. Drehen Sie den Embryo und hält es fest mit einem Satz von Zangen. Snip entlang der Länge des Embryos, aus dem Hals bis zum Schwanz, bis das gesamte Kabel ausgesetzt ist.
3. Fassen Sie das Ende des Kabels vorsichtig und ziehen ihn über sich selbst auf den Schwanz zu entfernen. Die Schnur ziehen wird kostenlos mit Membran und Spinalganglien (DRG) befestigt.
4. Wenn DRG Explantation oder dissoziierte sensorischen Neuronen Kultur durchgeführt werden soll, snip der DRG ohne Kabel und deren Verlegung an einen frischen Teller warme L15.
   1. Für DRG Explantation Kultur, überspringen auf 10,2 Schritt
   2. Für dissoziiert sensorischen Neuronen Kultur, fahren Sie mit Schritt 9
   3. Für Motoneuronen Kultur, wird der DRG mit der Membran in Schritt 7,5 entfernt werden
5. Entfernen Sie die Membran aus dem Rückenmark, indem Sie es am oberen Ende der Schnur und Peeling it down, ähnlich wie das Entfernen einer langen Socke. Wiederholen Sie dies für alle Embryonen und dann hacken Sie die Kabel in kleine (2-3 mm) Stück.

8. Motor Neuron (MN) Verarbeitung ^5,6,7

1. Gießen Sie die gehackte Schnüre und L15 in eine konische und Spin bei 1000 RPM für 2-3 min zur Pelletierung der Stücke.
2. Abgießen des Überstandes und 3 ml Trypsin auf die pelletierten Schnüre. Inkubieren bei 37 ° C Wasserbad für 20 min.
3. Add 3 mL FBS, konische und Spin bei 1000 RPM für 2-3 min wieder Pellet.
4. Abgießen des Überstandes und Mantel ein Feuer poliert Pasteurpipette mit FBS.
5. Fügen Sie eine Pasteurpipette voll von L15 die konische und dann sanft verreiben, bis die Lösung homogen ist ohne sichtbare Klumpen. Vermeiden Sie Luftblasen.
6. Bereiten Sie einen 9% igen Optiprep in L15. Bereiten Sie ein Rohr mit 3 mL der Optiprep Lösung für alle zwei Embryonen (wenn es eine ungerade Anzahl von Embryonen, bis Runde).
7. Löschen Sie die homogenisierte Lösung auf die Optiprep Lösung, teilt sie gleichmäßig unter allen Rohren. Drehen Sie das Röhrchen bei 2000 RPM für 15 min.
8. Sorgfältig sammeln die Besten 2 mL von jeder Röhre und Pool in einem 50 ml konischen. Füllen Sie den konisch mit L15 und Spin bei 1000 RPM für 5 min auf die Zellen des Optiprep spülen.
9. Abgießen des Überstandes und Resuspendieren der Zellen in eine kleine Menge von plating Medien (250-500 ul). Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau-Ausschluss auf lebende Zellen zu identifizieren. Direkt auf 10,1 Schritt

9. Sensory Neuron (SN) Ihnen ⁷

1. Gießen Sie die DRG aus dem Rückenmark und L15 in einem konischen Rohr und Spin entfernt bei 1000 RPM für 2-3 min zur Pelletierung der Stücke.
2. Abgießen des Überstandes und 3 ml Trypsin auf die pelletierten DRG. Inkubieren bei 37 ° C Wasserbad für 10 min.
3. Add 3 mL FBS, konische und Spin bei 1000 RPM für 2-3 min wieder Pellet.
4. Abgießen des Überstandes und Mantel ein Feuer poliert Pasteurpipette mit FBS.
5. Fügen Sie eine Pasteurpipette voll von L15 die konische und dann sanft verreiben, bis die Lösung homogen ist ohne sichtbare Klumpen. Vermeiden Sie Luftblasen.
6. Drehen Sie das Homogenat bei 1000 rpm für 5 min. Abgießen des Überstandes und Resuspendieren der Zellen in eine kleine Menge von SN Beschichtung Medien (250-500 ul). Zählen Sie die Zellen mit Trypanblau-Ausschluss auf lebende Zellen zu identifizieren. Weiter auf 10,1 Schritt

10. Plating und Kultur

1. Für dissoziiert SN oder MN Kultur:
   1. Decken Sie die Substrate, die mit ein paar Tropfen Medien fügen Sie dann ein geeignetes Volumen der Zellsuspension. Dissoziierten Zellen sollte bei einer geringen Dichte (25-50 Zellen / mm ²⁾ beschichtet werden. Lassen Sie die Zellen für mindestens eine Stunde vor Überschwemmungen die Brunnen mit den Medien zu halten.
2. Für DRG Explantation Kultur:
   1. Decken Sie die Substrate, die mit ein paar Tropfen Medien fügen Sie dann an die Medien DRG. Ordnen Sie die DRG, so dass sie gleichmäßig auf dem Substrat (ca. 4 DRG wird auf einem 22x22 mm Deckglas fit) verteilt werden. Lassen Sie die DRG für mindestens 4 Stunden vor Überschwemmungen die Brunnen mit den Medien zu halten.
3. Kulturen können beibehalten werden bis zu 4 Tage ohne Medienbruch zu ändern. Für längere Kulturen, sollte die Hälfte Medien ändert sich mit feed Medien durchgeführt werden. Feed Medien ist die gleiche Zusammensetzung wie plating Medien abzüglich der L-Glutamin.

11. Immunocytochemistry ^1,5,8

1. Fixierung von Zellen: Absaugen Medien und ersetzen mit warmem 4% PFA (Paraformaldehyd) für 30 min. Führen Sie dann 3x 5 min 1x PBS gewaschen.
2. Blocking / Permeabilisierung: Bereiten block / perm Lösung (1,25% Rinderserumalbumin in 1X PBS, 0,05% Triton X-100 und 2,0% normalem Ziegenserum). Absaugen PBS und gelten block / perm Lösung, um Proben für 30 Minuten. Führen Sie dann 1x 5 min 1x PBS gewaschen.
3. Primärer Antikörper: Bereiten primärer Antikörper-Arbeitslösung (10% normales Ziegenserum, 1,25% Rinderserumalbumin, 0,1% Na-Azid, 0,05% Triton X-100 und zu 10 ml mit 1x PBS). Fügen Sie die entsprechende Menge des primären Antikörpers (siehe Tabelle 2). Linie verschiedene Gerichte mit Parafilm. Legen Sie eine 200 ul Perle der primären Antikörper-Lösung auf dem Parafilm für jeden Untergrund. Kehren Sie die Substrate, schwimmende ihnen Zelle nach unten auf dem primären Antikörper funktionierende Lösung über Nacht (wenn der Raum ist klimatisiert oder besonders trocken ist, kann ein Stück Wasser gesättigt Papier in eine Ecke der Schale hinzugefügt werden, um Verdunstung des funktionierende Lösung zu verhindern) .
4. Sekundäre Antikörper: Entfernen Sie die Substrate aus dem primären (die funktionierende Lösung können gesammelt werden, bei 4 ° C und wiederverwendet werden) und führen 2x 5 min 1x PBS gewaschen. Apply 200 ul sekundären Antikörper verdünnt 1:200 in PBS (auch auf Parafilm gesäumt Gericht invertiert) für 4 Stunden.
5. Entfernen Sie aus sekundären führen Sie dann 2x 5 min 1x PBS gewaschen. Berg Substrate auf Objektträgern mit Prolong goldhaltigen DAPI oder einem anderen geeigneten nuklearen Gegenfärbung.

12. Repräsentative Ergebnisse:

Die typische Morphologie ausgerichtet und zufällige electrospun Fasern sind in Abbildung 1 dargestellt. Wir in der Regel erhalten MN Reinheit von> 90% Neuronen ^7,8 mit diesem Protokoll und wir haben gewartet DRG Kulturen so lange wie 1 Woche ohne nennenswerte Fibroblasten-Wachstumsfaktor. Abbildung 2 zeigt typische MN Auftritt auf Glas und Fasern nach 24 Stunden Kultur-und Immunfärbung. Immungefärbte DRG für drei Tage auf Glas und Fasern kultiviert werden in Abbildung 3 dargestellt.

Abbildung 1. Fiber Alignment wird durch die Wahl des Kollektors manipuliert. A.) Fasern auf einem rotierenden Rad Sammler und B. gesponnen Aligned) random Fasern versponnen auf eine stationäre Platte Sammler. Maßstabsbalken = 20 um.

Abbildung 2. Representative Motoneuronen für TuJ1 (grün) und DAPI (blau) nach 24 Stunden der Kultur auf PLL beschichteten A. gebeizt) Fasern und B.) Glas. Maßstabsbalken = 20 um.

Abbildung 3. Representative DRG gefärbt Neurofilament (grün) nach 3 Tagen Kultur auf PLL beschichteten A.) Glas und B.) Fasern. Maßstabsbalken = 200 um.

Stammlösung:	MN Medien:	DRG / SN Medien:
10 mg mL -1 Albumin	12,5 ul	-
10 mg mL -1 apo-Transferrin	50 pl	40 ul
50 ug mL -1 β-Estradiol	2,7 ul	2,2 ul
0,1 mg mL -1 Biotin	50 pl	-
16 mg mL -1 Katalase	8 ul	-
15 mg mL -1 D-Galaktose	50 pl	-
50 ug mL -1 Hydrocortison	3,7 ul	2,9 ul
0,63 mg mL -1 Progesteron	0,5 ul	-
16 mg mL -1 Putrescin	50 pl	-
50 ug mL -1 Selen	3,4 ul	4,1 ul
2,5 mg mL -1 Superoxiddismutase	50 pl	-
* 500 ng mL -1 nerve growth factor	-	1 mL
* 100X PSN	0,5 ml	0,5 ml
* B27	1 mL	1 mL
* 2 mM L-Glutamin	35 ul	35 ul
* Neurobasal	auf 50 mL	auf 50 mL

Tabelle 1. Hinzufügen Stern (*)-Komponenten zu den Medien kurz vor dem Gebrauch. Die restlichen Komponenten kann als Stammlösung hergestellt werden und bei -20 ° C bis zum Gebrauch ^6,7.

Primary (Konzentration)	Neurons:	Glia:	Fibroblasten:
anti-β-Tubulin (TuJ1) (1:1000)	✓	X	X
Anti-Neurofilament (1:1000)	✓	X	X
Anti-S-100 (1:250)	X	✓	✓
Anti-NGFR p75 (1:500)	✓	✓	X

Tabelle 2. Die Auswahl des primären Antikörpers ist abhängig von den Zielen der Ermittler. Die oben genannten sind mehrere Antikörper und die Konzentrationen wir mit Erfolg in unserem Labor verwendet wurden. S-100 ist besonders nützlich, um Schwann-Zellen zu identifizieren und / oder schau auf kontaminierende Fibroblasten, aber beachten Sie, dass es in Kombination muss mit NGFR p75 verwendet werden, um zwischen Gliazellen und fibroblasts4 unterscheiden. Wir haben auch bemerkt, dass NGFR p75 Flecken sehr leicht Neuriten während Neurofilament oder TuJ1 ausgezeichnete Wahl sind, wenn das Ziel ist es, individuelle Neuriten zu visualisieren.

Diskussion

Dieses Protokoll hat mehrere wichtige Schritte. Die erste umfasst die ordnungsgemäße Herstellung des elektrogesponnenen Fasersubstrate. In flüssigen Medien wird die PLLA-Fasern, PLGA Film-und PLGA Graben aus dem Deckglas als eine Einheit zu trennen. Wenn die PLGA weggelassen wird, wird die PLLA-Fasern nicht eine flache Platte bleiben - sie werden curl up in einem unbrauchbaren Gewirr. So ist die PLGA-Film als ein geeignetes Substrat zur Faserausrichtung während der Kultur pflegen enthalten. Der Graben ist nach dem Schleudern sowohl um sicherzustellen, dass die Fasern fest an den PLGA-Film fixiert und strukturelle Steifigkeit, um den Film add hinzugefügt. Der Graben dient auch als ein nützliches Griff, wenn die Substrate während der Fixierung, Färbung und Montage sind manipuliert. Trituration ist der zweite entscheidende Schritt. Es sollten alle Anstrengungen, um die Bildung von Blasen zu vermeiden. Darüber hinaus haben wir viel höhere Ausbeuten erhalten, wenn ein feuerpolierte Pipette für diesen Schritt verwendet wird. Um Feuer polieren, leichte einem Bunsenbrenner und fügen Sie eine Lampe, um die Pipette. Pass die Spitze der Pipette schnell durch die Flamme 2-3 Mal während kontinuierlich Quetschen und Loslassen der Glühbirne - Luftstrom durch die Pipette wird verhindern, dass die Spitze von ganz geschlossen sein. Untersuchen Sie die Spitze der Pipette, um sicherzustellen, das Loch ist noch offen, und dass die Kanten erscheinen kurz vor Gebrauch abgerundet.

Elektrospinnen ist ein sehr vielseitiger Prozess, der Elektrospinnen Parameter können geändert werden, um Fasern mit einer Vielzahl von Morphologien zu erzeugen. Tan et al. (2005) Details einer systematischen Untersuchung von Parametern, die den Durchmesser von PLLA elektrogesponnenen Fasern. Wang et al. (2009) präsentiert eine detaillierte Studie über die Einflussgrößen auf die Ausrichtung der elektrogesponnenen PLLA-Fasern.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
PLLA	Boehringer Ingeheim	Resomer L210
PLGA 85:15	Sigma-Aldrich	43471
L15	GIBCO, by Life Technologies	11415
Albumin	Sigma-Aldrich	A2289
Apo-transferrin	Akorn Inc	AK8227
Biotin	Fisher Scientific	AC 23009-0010
Galactose	Sigma-Aldrich	G0625
Progesterone	Sigma-Aldrich	P7556
Putrescine	Sigma-Aldrich	P5780
Selenium	Sigma-Aldrich	S9133
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E 1132
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0396
Catalase	Sigma-Aldrich	C40
Superoxide dismutase	Sigma-Aldrich	S4636
Neurobasal	GIBCO, by Life Technologies	21103-049
PSN	GIBCO, by Life Technologies	15640
L-glutamine	Nalge Nunc international	1680149
Trypsin	Nalge Nunc international	1689149
Fetal bovine serum	GIBCO, by Life Technologies	26140
Optiprep	Accurate Chemical & Scientific Corporation	2011
PLL	Sigma-Aldrich	P4832
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F 4759
Laminin	Invitrogen	23017-015
B27	GIBCO, by Life Technologies	17504-044
BSA	Sigma-Aldrich	A7906
Anti-TuJ1	BD Biosciences	556321
Anti-neurofilament	EMD Millipore	AB1987
Anti-S100	Sigma-Aldrich	S2532
Anti-NGFR p75	Sigma-Aldrich	N3908
Normal goat serum	Sigma-Aldrich	G6767
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032
Carbon tape	Ted Pella, Inc.	13073-1
Prolong Gold +DAPI	Invitrogen	P36931