La cultura del motore principale e neuroni sensoriali in Media definiti in elettrofilate Poli-L-lactide Ponteggi nanofibre

Riepilogo

Allineati fibre elettrofilate diretta la crescita dei neuroni in vitro e sono una componente potenziale di ponteggi rigenerazione nervosa. Abbiamo descritto una procedura per la preparazione di substrati di fibre elettrofilate e il siero senza cultura di primaria ratto E15 sensoriali (DRG) e neuroni motori. Visualizzazione dei neuroni mediante immunocitochimica è anche incluso.

Abstract

Electrospinning è una tecnica per la produzione di micro-a nano-scala fibre. Fibre possono essere elettrofilate con vari gradi di allineamento, da altamente allineati a completamente casuale. Inoltre, le fibre possono essere filata da una varietà di materiali, compresi i polimeri biodegradabili come il poli-L-lattico (PLLA). Queste caratteristiche rendono le fibre elettrofilate adatto per una varietà di applicazioni di ponteggi in ingegneria dei tessuti. Il nostro obiettivo è l'uso di fibre elettrofilate allineati per la rigenerazione dei nervi. Abbiamo precedentemente dimostrato che allineare le fibre elettrofilate PLLA la conseguenza diretta di entrambi i neuroni sensoriali e motorie primarie in vitro. Riteniamo che l'uso di un sistema primario di coltura cellulare è essenziale per la valutazione dei biomateriali ai neuroni modello reale trovato in vivo il più possibile. Qui, descriviamo le tecniche utilizzate nel nostro laboratorio di electrospin ponteggi fibroso e cultura espianti gangli dorsali, così come dissociata neuroni sensoriali e motori, su ponteggi elettrofilate. Tuttavia, il electrospinning e / o tecniche di coltura qui presentate possono essere facilmente adattati per essere utilizzati in altre applicazioni.

Protocollo

1. Poli-L-lattico (PLLA) Spinning Soluzione

1. Sciogliere 0,4 g PLLA in 9 ml di cloroformio, mescolando a fuoco basso.
2. Aggiungere 1 ml di dimetilformammide alla soluzione, portando la concentrazione finale della soluzione al 4% PLLA (w / v) in cloroformio: DMF 9:1 (v / v).
3. Mettere la soluzione in un polipropilene o siringa di vetro con una punta metallica smussata 23ga.

2. Filatura di preparazione del substrato ¹

1. Preparare una soluzione 8% (w / v) di 85:15 PLGA (poli-lattico-co-glicolico acido) in cloroformio, agitando a fuoco basso.
2. Cappotto pulito copertura in vetro scivola in PLGA coprendo la superficie di ogni vetrino con la soluzione di PLGA. Lasciare che il PLGA asciugare per un film sottile (ca. 30 min).

3. Electrospinning ²

1. Assicurare copertura in vetro rivestito PLGA scivola al collettore con nastro di carbonio conduttivo. Per le fibre allineate, il collettore è un motore ruota. Per le fibre di casuale, il collettore è un piatto fisso.
2. Luogo in pompa siringa con punta 20 cm dalla ruota collettore. Set pompa per circa 2 ml / ora e se si utilizza una ruota, impostare il motore a 300-400 giri al minuto. Se possibile, applicare un -2 kV polarizzazione CC al collettore e 15 kV a punta in metallo. In assenza di accesso ad una alimentazione bipolare, a terra il collettore.
3. Le fibre si getto dalla punta della siringa e raccogliere sulla ruota in movimento. Continuare a girare solo quando la densità desiderata delle fibre si ottiene. Strisciare la punta di metallo con un tovagliolo di carta, apposto su un non conduttivo asta periodicamente per evitare l'intasamento sulla punta.

4. Moating ¹

1. A seguito di filatura, 'fossato' i campioni elettrofilate pipettando una linea di PLGA intorno al perimetro dello slip cover. Lasciare che il PLGA ad asciugare. Esso deve mantenere l'allineamento delle fibre durante cultura.

5. Proteina di rivestimento

1. Elettrofilate fibre di vetro e controlli devono essere rivestiti di proteine ​​prima di colture cellulari. Coprire i substrati in una soluzione proteica per almeno un'ora e poi aspirare la soluzione in eccesso e proseguire fino a quando i substrati aspirazione sono a secco. Le soluzioni possibili sono le proteine: PLL _{(poli-L-lisina)} (100 mg / ml), laminina (25 mg / ml) o fibronectina (50 mg / mL). Se il PLL è usato, i substrati devono essere risciacquati in acqua sterile e asciugati due volte dopo il rivestimento iniziale.

6. E15 ottenere embrioni di ratto ³

* Tutti gli esperimenti sono stati fatti in conformità con la Guida NIH per la cura e dell'uso degli animali da laboratorio come approvato dalla University of Michigan Commissione Uso e cura degli animali.

1. Preparazione: Verificare se l'animale è incinta. Scongelare 3 mL tripsina, 3 FBS ml e una bottiglia di caldo L15. Fuoco lucidare una pipetta Pasteur. Disinfettare tutti gli strumenti chirurgici in etanolo al 70% per 30 min.
2. Preparare e caldo terreni in piastra (vedi tabella 1).
3. Eutanasia: eseguire un'iniezione IP di ketamina / xylazina. Attendere 10-15 minuti e controllare per mancanza di riflessi corneale e pedale ritiro. Una volta che i riflessi sono assenti, eseguire una iniezione di pentobarbital IC (FatalPlus).
4. Tenda la pelle dell'addome. Tagliare attraverso la pelle e dei muscoli per esporre la cavità addominale. Individuare l'utero e staccarlo al collo dell'utero e delle ovaie.
5. Rimuovere gli embrioni dall'utero con le forbici e metterli immediatamente in caldo L15. (Tutte le procedure che seguono sono maturati nell'ambito di un microscopio da dissezione e gli embrioni ei cavi sezionato deve essere immerso in acqua calda L15 in ogni momento.) Decapitare il embrioni chiudendo pinza intorno al mento e sotto l'osso occipitale del cranio.

7. Dissezione ³

1. Posizionare l'embrione su un lato. Proteggere il midollo spinale con un set di pinze mentre si utilizza l'altro insieme a spogliare arti e organi addominali.
2. Girare l'embrione e tenerla ferma con un set di pinze. Snip per tutta la lunghezza dell'embrione, dal collo alla coda, fino a quando il cavo tutto è esposto.
3. Afferrare l'estremità del cavo con attenzione e tirarlo su se stesso verso la coda da rimuovere. Il cavo tirerà libero con membrana e dei gangli spinali (DRG) allegato.
4. Se DRG espianto o dissociati cultura neuroni sensoriali deve essere eseguita, snip DRG il cordone e trasferirli in un piatto fresco di caldo L15.
   1. Per i DRG cultura espianto, passare alla fase 10,2
   2. Per dissociato cultura neuroni sensoriali, passare al punto 9
   3. Per la cultura del motoneurone, il DRG verrà rimosso con la membrana al passo 7,5
5. Rimuovere la membrana dal midollo spinale afferrandolo all'estremità superiore del cavo e peeling verso il basso, simile a rimuovere un calzino lungo. Ripetere l'operazione per tutti gli embrioni e poi tagliare le corde in piccoli (2-3 mm) pezzi.

8. Motor Neuron (MN) Elaborazione ^5,6,7

1. Versare i cavi tritato e L15 in una forma conica e far girare a 1000 RPM per 2-3 minuti per far sedimentare i pezzi.
2. Eliminare il sopranatante ed aggiungere 3 mL di tripsina alle corde pellet. Incubare in un bagno d'acqua a 37 ° C per 20 min.
3. Aggiungere 3 ml di FBS conica e far girare a 1000 RPM per 2-3 min a ri-pellet.
4. Eliminare il sopranatante e un cappotto lucido fuoco pipetta Pasteur con FBS.
5. Aggiungere una pipetta Pasteur-pieno di L15 alla conica e poi triturare delicatamente fino a quando la soluzione è omogeneo senza grumi visibili. Evitare bolle.
6. Preparare una soluzione al 9% di Optiprep in L15. Preparare un tubo con 3 ml di soluzione Optiprep per ogni due embrioni (se c'è un numero dispari di embrioni, arrotondare per eccesso).
7. Goccia la soluzione omogeneizzato sulla soluzione Optiprep, divide equamente tra tutti i tubi. Spin le provette a 2000 RPM per 15 minuti.
8. Raccogliere accuratamente la parte superiore da 2 ml ciascuna provetta e piscina in una conica da 50 ml. Riempire il conico con L15 e far girare a 1000 RPM per 5 minuti per sciacquare le cellule del Optiprep.
9. Eliminare il sopranatante e risospendere le cellule in una piccola quantità di terreni in piastra (250-500 mL). Contare le cellule utilizzando esclusione blu trypan per identificare le cellule vive. Passare al punto 10,1

9. Sensoriale Neuron (SN) Elaborazione ⁷

1. Versare il DRG rimosso dal midollo spinale e L15 in un tubo conico e girare a 1000 RPM per 2-3 minuti per far sedimentare i pezzi.
2. Eliminare il sopranatante ed aggiungere 3 mL di tripsina al DRG pellet. Incubare in un bagno d'acqua a 37 ° C per 10 min.
3. Aggiungere 3 ml di FBS conica e far girare a 1000 RPM per 2-3 min a ri-pellet.
4. Eliminare il sopranatante e un cappotto lucido fuoco pipetta Pasteur con FBS.
5. Aggiungere una pipetta Pasteur-pieno di L15 alla conica e poi triturare delicatamente fino a quando la soluzione è omogeneo senza grumi visibili. Evitare bolle.
6. Spin l'omogeneizzato a 1000 rpm per 5 min. Eliminare il sopranatante e risospendere le cellule in una piccola quantità di terreni in piastra SN (250-500 mL). Contare le cellule utilizzando esclusione blu trypan per identificare le cellule vive. Continuare a passo 10,1

10. Placcatura e Cultura

1. Per dissociato SN o MN cultura:
   1. Coprire i substrati con alcune gocce di media quindi aggiungere un volume adeguato di sospensione cellulare. Cellule dissociate dovrebbe essere placcato a bassa densità (25-50 cellule / mm ^2). Consentire alle cellule di aderire per almeno un'ora prima di allagare i pozzetti con i media.
2. Per i DRG cultura espianto:
   1. Coprire i substrati con alcune gocce di media quindi aggiungere DRG ai media. Disporre i DRG in modo che siano distribuiti uniformemente in tutto il substrato (circa 4 DRG si inserisce su un foglio 22x22 copertina mm). Lasciare che il DRG di aderire per almeno 4 ore prima di allagare i pozzetti con i media.
3. Culture può essere mantenuta per un massimo di 4 giorni senza cambiare supporto. Per i più culture, la metà cambiamenti dei media dovrebbe essere fatto con mezzi di feed. Alimentazione dei supporti è la stessa composizione di terreni in piastra meno la L-glutammina.

11. Immunocitochimica ^1,5,8

1. Fissaggio delle cellule: i media Aspirare e sostituirlo con caldo al 4% PFA (paraformaldeide) per 30 minuti. Quindi eseguire 3X 5 min 1x lavaggi PBS.
2. Blocco / permeabilizzazione: Preparare blocco / perm soluzione (1,25% siero albumina bovina in PBS 1X, 0,05% Triton X-100 e il 2,0% di siero normale di capra). Aspirare il PBS e applicare blocco / perm soluzione ai campioni per 30 minuti. Quindi eseguire 1X 5 min 1x lavaggi PBS.
3. Anticorpo primario: Preparare la soluzione primaria di anticorpi di lavoro (10% siero di capra normale, 1,25% di sieroalbumina bovina, 0,1% Na azide, 0,05% Triton X-100 e a 10 ml con PBS 1x). Aggiungere la quantità appropriata di anticorpo primario (vedi tabella 2). Linea di piatti diversi con parafilm. Mettere una goccia 200μl di soluzione dell'anticorpo primario sul parafilm per ciascun substrato. Invertire la substrati, galleggiante loro lato della cella verso il basso la soluzione di anticorpo primario di lavoro durante la notte (se la stanza è dotata di aria condizionata o particolarmente secchi, un pezzo di carta saturi d'acqua può essere aggiunta in un angolo del piatto per evitare l'evaporazione della soluzione di lavoro) .
4. Anticorpo secondario: Rimuovere i substrati dal primario (la soluzione di lavoro può essere raccolto, conservato a 4 ° C e riutilizzati) ed eseguire 2X 5 min 1x lavaggi PBS. Applicare 200 microlitri anticorpo secondario diluito 1:200 in PBS (anche rovesciato su un piatto rivestito parafilm) per 4 ore.
5. Togliere dal secondario quindi eseguire 2X 5 min 1x lavaggi PBS. Substrati montaggio su vetrini con Prolungare oro contenente DAPI o un altro contatore adatto nucleare macchia.

12. Rappresentante dei risultati:

La morfologia tipica della allineate e casuale elfibre ectrospun sono mostrati in Figura 1. Noi di solito ottenere la purezza MN di> neuroni del 90% ^7,8 con questo protocollo e abbiamo mantenuto DRG culture per tutto il tempo una settimana, senza alcun significativa crescita dei fibroblasti. La figura 2 mostra l'aspetto tipico MN su vetro e fibre dopo 24 ore di cultura e immunocolorazione. DRG immunostained colto per tre giorni su vetro e fibre sono rappresentate nella figura 3.

Figura 1. Allineamento fibra viene manipolata per scelta del collezionista. A.) Allineati fibre filate su un collettore ruota in movimento e B.) fibre casuale filato su un collettore piano fisso. Barre di scala = 20 micron.

Figura 2. Motoneuroni rappresentante colorate per TuJ1 (verde) e DAPI (blu) dopo 24 ore di cultura sul PLL A. patinata) fibre e B.) di vetro. Barre di scala = 20 micron.

Figura 3. DRG macchiato rappresentante per neurofilamenti (verde) dopo 3 giorni di coltura su PLL rivestito A.), vetro e B.) fibre. Barre di scala = 200 micron.

Soluzione:	MN media:	DRG / SN media:
10 mg ml -1 albumina	12,5 microlitri	-
10 mg ml -1 apo-transferrina	50 microlitri	40 microlitri
50 mg ml -1 β-estradiolo	2,7 microlitri	2,2 microlitri
0,1 mg ml -1 biotina	50 microlitri	-
16 mg ml -1 catalasi	8 microlitri	-
15 mg ml -1 D-galattosio	50 microlitri	-
50 ml di idrocortisone mcg -1	3,7 microlitri	2,9 microlitri
0,63 mg ml -1 progesterone	0,5 microlitri	-
16 mg ml -1 putrescina	50 microlitri	-
50 mg ml -1 selenio	3,4 microlitri	4,1 microlitri
2,5 mg ml -1 superossido dismutasi	50 microlitri	-
* 500 ng mL -1 fattore di crescita nervosa	-	1 ml
* 100X PSN	0,5 ml	0,5 ml
* B27	1 ml	1 ml
* 2 mM L-glutammina	35 microlitri	35 microlitri
* Neurobasal	a 50 mL	a 50 mL

Tabella 1. Aggiungi protagonista (*) i componenti per i media al momento dell'uso. I restanti componenti possono essere preparati come una soluzione di riserva e conservato a -20 ° C fino al momento ^6,7.

Primaria (concentrazione)	Neuroni:	Glia:	Fibroblasti:
anti-β-tubulina (TuJ1) (1:1000)	✓	X	X
anti-neurofilamenti (1:1000)	✓	X	X
anti-S-100 (1:250)	X	✓	✓
NGFR anti-p75 (1:500)	✓	✓	X

Tabella 2. La selezione dei anticorpo primario dipende gli obiettivi del ricercatore. Quanto sopra sono anticorpi diversi e le concentrazioni che abbiamo usato con successo nel nostro laboratorio. S-100 è particolarmente utile per identificare le cellule di Schwann e / o verificare la presenza di contaminanti fibroblasti, ma nota che esso deve essere usato in combinazione con NGFR p75 di distinguere tra cellule gliali e fibroblasts4. Abbiamo anche notato che NGFR p75 macchie neuriti molto leggermente, mentre neurofilamenti o TuJ1 sono una ottima scelta, se l'obiettivo è quello di visualizzare neuriti individuali.

Discussione

Questo protocollo ha diversi punti critici. La prima riguarda la corretta produzione di substrati in fibra di elettrofilate. Nei liquidi, le fibre PLLA, PLGA film e fossato PLGA separerà dal coupon vetro di copertura come una singola unità. Se il PLGA viene omesso, le fibre PLLA non rimarrà un foglio - che si arricciano in un groviglio inutilizzabile. Così, il film PLGA è incluso come un substrato adatto per mantenere l'allineamento delle fibre durante cultura. Il fossato viene aggiunto dopo spinning sia per garantire che le fibre siano saldamente fissate al film PLGA e di aggiungere la rigidità strutturale del film. Il fossato funge anche da manico utile quando i substrati sono manipolati durante il fissaggio, colorazione e montaggio. Triturazione è il secondo passo fondamentale. Ogni sforzo dovrebbe essere fatto per evitare la formazione di bolle. Inoltre, abbiamo ottenuto rendimenti molto più alti quando un incendio lucidato pipetta viene utilizzata in questa fase. Al fuoco lucido, la luce un becco Bunsen e allegare una lampadina per la pipetta. Passo la punta della pipetta rapidamente attraverso la fiamma 2-3 volte, mentre continua spremitura e rilasciando la lampadina - flusso d'aria attraverso la pipetta aiuterà a prevenire la punta di chiudere completamente. Esaminare la punta della pipetta assicurando così il buco è ancora aperto e che i bordi appaiono leggermente arrotondati prima dell'uso.

Electrospinning è un processo molto versatile; i parametri electrospinning può essere modificata per produrre fibre con una varietà di morfologie. Tan et al. (2005) i dettagli di uno studio sistematico di parametri che influenzano il diametro del PLLA fibre elettrofilate. Wang et al. (2009) presenta uno studio dettagliato dei parametri che influenzano l'allineamento delle fibre elettrofilate PLLA.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
PLLA	Boehringer Ingeheim	Resomer L210
PLGA 85:15	Sigma-Aldrich	43471
L15	GIBCO, by Life Technologies	11415
Albumin	Sigma-Aldrich	A2289
Apo-transferrin	Akorn Inc	AK8227
Biotin	Fisher Scientific	AC 23009-0010
Galactose	Sigma-Aldrich	G0625
Progesterone	Sigma-Aldrich	P7556
Putrescine	Sigma-Aldrich	P5780
Selenium	Sigma-Aldrich	S9133
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E 1132
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0396
Catalase	Sigma-Aldrich	C40
Superoxide dismutase	Sigma-Aldrich	S4636
Neurobasal	GIBCO, by Life Technologies	21103-049
PSN	GIBCO, by Life Technologies	15640
L-glutamine	Nalge Nunc international	1680149
Trypsin	Nalge Nunc international	1689149
Fetal bovine serum	GIBCO, by Life Technologies	26140
Optiprep	Accurate Chemical & Scientific Corporation	2011
PLL	Sigma-Aldrich	P4832
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F 4759
Laminin	Invitrogen	23017-015
B27	GIBCO, by Life Technologies	17504-044
BSA	Sigma-Aldrich	A7906
Anti-TuJ1	BD Biosciences	556321
Anti-neurofilament	EMD Millipore	AB1987
Anti-S100	Sigma-Aldrich	S2532
Anti-NGFR p75	Sigma-Aldrich	N3908
Normal goat serum	Sigma-Aldrich	G6767
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S8032
Carbon tape	Ted Pella, Inc.	13073-1
Prolong Gold +DAPI	Invitrogen	P36931