In-vivo-Imaging von der Maus Spinal Cord mit Zwei-Photonen-Mikroskopie

Zusammenfassung

Ein minimal-invasiven Protokoll, um die Maus Wirbelsäule zu stabilisieren und sich wiederholende In vivo Rückenmarks Bildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie ist beschrieben. Diese Methode verbindet eine Wirbelsäulen-Stabilisierung Gerät und ein Anästhetikum Regime die Atmungsorgane-induzierte Bewegungen zu minimieren und produzieren Rohstoffe Bilddaten, die keine Ausrichtung oder andere Nachbearbeitung erfordern.

Zusammenfassung

In-vivo-Bildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie ¹ in Mäusen, die gentechnisch verändert wurden, um fluoreszierende Proteine ​​in bestimmten Zelltypen ^2-3 hat unsere Kenntnis der physiologischen und pathologischen Prozessen in zahlreichen Geweben in vivo ^4-7 erweitert auszudrücken. In Studien des zentralen Nervensystems (ZNS), hat es eine breite Anwendung der in-vivo-Bildgebung des Gehirns, die eine Vielzahl von neuartigen und oft unerwartete Erkenntnisse über das Verhalten der Zellen wie Neuronen, Astrozyten, Mikroglia unter produziert wurde physiologische oder pathologische Zustände ^8-17. Allerdings haben vor allem die technischen Komplikationen der Umsetzung der in-vivo-Bildgebung in Studien der lebenden Maus Rückenmark beschränkt. Insbesondere erzeugt die anatomische Nähe des Rückenmarks in die Lunge und das Herz signifikante Bewegung Artefakt, das zur Bildgebung im lebenden Rückenmark eine anspruchsvolle Aufgabe macht. Wir entwickelten eine neuartige Methode, die die inhärenten Grenzen des Rückenmarks Bildgebung überwindet durch die Stabilisierung der Wirbelsäule, wodurch der Atemwege-induzierte Bewegungen und damit die Erleichterung der Anwendung der Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Abbildung der Maus Rückenmark in vivo. Dies ist durch die Kombination eines maßgeschneiderten Wirbelsäulenstabilisierung Gerät mit einer Methode der tiefen Narkose, was zu einer signifikanten Reduktion von Atemwegs-induzierte Bewegungen erreicht. Dieses Video-Protokoll zeigt, wie man einen kleinen Bereich des Lebendigen Rückenmarks, die unter physiologischen Bedingungen stabil über längere Zeiträume hinweg, indem sie Gewebeschäden und Blutungen auf ein Minimum gehalten werden kann aussetzen. Vertreter von RAW-Bildern erworben in vivo Details in hoher Auflösung die enge Beziehung zwischen Mikroglia und das Gefäßsystem. Ein Zeitraffer-Sequenz zeigt das dynamische Verhalten von Mikroglia-Prozesse in der lebenden Maus Rückenmark. Darüber hinaus zeigen einen kontinuierlichen Scan der gleichen z-frames die herausragende Stabilität, die dieser Methode erreichen können, um Stapel von Bildern und / oder Zeitraffer-Filme, die keine Bildausrichtung nach dem Erwerb zu generieren. Schließlich zeigen wir, wie diese Methode verwendet werden, um erneut und reimage der gleichen Gegend des Rückenmarks zu späteren Zeitpunkten werden, so dass für Längsschnittstudien der laufenden physiologische oder pathologische Prozesse in vivo.

Protokoll

1. Aufbau der Wirbelsäule Stabilisierung Gerät

1. Bestellen Sie die Narishige STS-A Compact Spinal Cord Klemmen und die Narishige MA-6N Head Holding-Adapter.
2. Individuelles Design und einen Edelstahl-Bodenplatte, die beiden Narishige Teile in Ausrichtung zu halten, so dass der Kopf des Tieres wird unterstützt, während die Wirbelsäule und Schwanz eingeklemmt sind. Denken Sie daran, dass das gesamte Gerät sollte unter dem Mikroskop-Objektiv in der Regel auf eine abgesenkte Mikroskoptisch fit.

2. Tierische Chirurgie

1. Pre-heat dem Mikroskop Kammer mit einer Luftheizung Gerät und halten sie auf 37 ° C.
2. Wiegen Sie das Tier und stellen die Narkose-Mix mit 100 mg Ketamin, 15 mg Xylazin und 2,5 mg Acepromazin pro kg Körpergewicht, in 0,9% NaCl-Lösung unter sterilen Bedingungen verdünnt werden.
3. Anesthetize das Tier durch Injektion des Anästhetikums Mix (KXA) intraperitoneal. Regelmäßige Zeh kneifen sollte durchgeführt werden, um tiefe Narkose ganz sicher seindas Experiment. Supplement mit der Hälfte der ursprünglichen Dosis stündlich oder nach Bedarf.
4. Verwenden Sie ein kleines Tier Heizkissen zur thermischen Unterstützung während der Durchführung des chirurgischen Eingriffs.
5. Übernehmen künstliche Tränen Salbe über die Augen, um Hornhaut Austrocknung und Schäden zu vermeiden.
6. Shave dem Rücken des Tieres zunächst mit einem Besatz Gerät und dann mit einer scharfen Klinge vollständig zu entfernen Haare aus der Gegend um den Einschnitt.
7. Nehmen Sie rasierten Haaren und desinfizieren Sie die rasierte Haut Oberfläche mit einer Alkohol-Pad.
8. Führen Sie eine kleine (~ 1,5 cm) Längsschnitt der Haut über den gewünschten spinaler Ebene (Brustwirbel hier abgebildet).
9. Expose der Rückenmuskulatur durch vorsichtiges Zurückziehen des subkutanen Bindegewebes.
10. Sorgfältig trennen die paravertebralen Muskeln von der Wirbelsäule auf dem gewünschten Niveau. Führen Sie möglichst wenige Schnitte, um die Muskeln von beiden Seiten jeweils Dornfortsatz lösen und dann kratzen die abgelösten MuskelnWeg von der laminaren Oberfläche.
11. Wählen Sie die Lamina, die entfernt werden und bereiten den Standorten der Eintrag für die Wirbelsäulen-Klemmen auf jeder Seite der Wirbelsäule, sofort rostral und kaudal der Laminektomie. Sorgfältig verdrängen Muskelgewebe zu vier Taschen, in denen die Klammern eingefügt werden können.
12. Heben Sie die Wirbelsäule mit dem geraden Zahn-Spitze Pinzette sichere Einsetzen der gebogenen stumpfen Spitze Schere unter der Lamina ohne sie zu berühren das Rückenmark zu ermöglichen. Führen Sie die Laminektomie durch langsames Schneiden des Knochens auf der einen Seite und dann auf der anderen Seite.
13. Verwenden Sie ein Wattestäbchen oder legen vorgeschnitten kleinen Gelschaum resorbierbare Gelatineschwamm Stücke neben den Einschnitten auf kleinere Blutungen zu begrenzen. Mit einem kleinen Schiff cauterizer weitere Blutungen zu kontrollieren, wenn nötig. Verwenden Sie vorgewärmte sterile künstliche Liquor (ACSF), um Gewebe zu waschen.

3. Die Stabilisierung der Wirbelsäule und der Vorbereitung auf in-vivo-Bildgebung

1. Plac e das Tier auf einer Anhöhe Pad auf der Grundplatte der Wirbelsäule Stabilisierung Gerät und sichern den Kopf in den Kopf halten Adapter.
2. Legen Sie die Wirbelsäule Klemmen des STS-A-Gerät entlang der anterior-posterioren Achse des Tieres in die vorbereiteten Taschen flankierenden Laminektomie (Abbildung 1). Die beiden Klemmen sollten in einem Winkel von ~ 45 platziert werden ° gegenüber dem Tier rostro-kaudalen Achse, um genügend Platz für das Absenken eines Wasser Immersionslinse über die freiliegende Rückenmark (Abbildung 1) zu ermöglichen.
3. Setzen Sie die dritte Klammer der STS-A-Gerät an der Basis des Schwanzes so dem Körper des Tieres in der Luft kann nach Entfernen der Erhebung Pad für die Dauer der bildgebenden Untersuchungen (Abbildung 1) ausgesetzt werden.
4. Bauen Sie ein kleines und von Gelseal (Amersham Biosciences Corp) um den freigelegten Rückenmark zur Aufrechterhaltung des Rückenmarks in ACSF und das Eintauchen des Mikroskop-Objektiv in dieser Lösung in-vivo-Bildgebung zu erleichtern.

jove_title "> 4. In-vivo-Bildgebung der Maus Rückenmark mit Zwei-Photonen-Mikroskopie

1. Übertragen Sie die Tiere auf der Wirbelsäule Stabilisierung Gerät in den vorgeheizten Kammer für das Mikroskop und sichern Sie sie auf eine abgesenkte Mikroskoptisch Platzierung des Laminektomie direkt unter dem Objektiv (Abbildung 1).
2. Lower eine Wasser-Immersions-Objektiv vorsichtig in das ACSF-Lösung dafür sorgen, dass sie nicht berühren das Rückenmark Klammern oder Gelseal.
3. Verwenden Sie Epifluoreszenz, um den Bereich von Interesse zu identifizieren und sich auf sie. Switch to Laser-Scanning-Modus und führen in-vivo-Bildgebung mit den entsprechenden Zwei-Photonen-Laser-Anregungswellenlänge dichroics und Bandpass-Filter für die Fluorophore in dem abgebildeten Gewebe.

5. Repetitive Bildgebung und post-operative Betreuung

1. Am Ende der bildgebenden Untersuchungen, entfernen Sie die Maus aus dem Rückenmark Stabilisierung Gerät und wischen die Gelseal aus der Gegend um die Laminektomie.Reinigen Sie den Bereich gut.
2. Wiederherstellen und Naht der Rückenmuskulatur über die Laminektomie.
3. Wiederherstellen und Naht der Haut über der Laminektomie, Tupfer mit betadine.
4. Geben Sie 1 ml Ringer-Laktat-Lösung (Baxter Healthcare) als Nährstoff-und Flüssigkeitszufuhr zu ergänzen, sowie analgetische Behandlung subkutan (0,1 mg / kg Buprenorphin).
5. Verwalten antiseptische Behandlung intraperitoneal (0,03 ml pro Maus, 2,27% Enrofloxacin injizierbaren antibakteriellen Lösung).
6. Legen Tier auf einem Heizkissen bis zur vollständigen Erholung aus der Narkose und anschließend Haus ist individuell.
7. Wiederholen Sie die antiseptische Verwaltung täglich für die ersten 3-5 Tage nach der Operation und analgetische Behandlung alle 8-12 Stunden für 2-3 Tage nach der Operation. Monitor Tier täglich zum normalen Verhalten und vollständige Genesung zu gewährleisten.
8. Für Re-Imaging durch die gleiche Laminektomie, öffnen Sie die Naht der Haut und Muskeln und wiederholen Sie die Schritte in den Abschnitten 2 - 4 beschrieben.
9. Re-locate dem Vorjahrously abgebildeten Bereich durch das Blut Blutgefäße als eine Karte, wie oben beschrieben ^10.

6. Repräsentative Ergebnisse

Alle tierischen Verfahren wurden nach den Richtlinien von institutionellen Animal Care und Verwenden Ausschüsse an der University of California, San Francisco Set durchgeführt und sind in Übereinstimmung mit behördlichen Vorschriften. Ein Bild der spinalen Stabilisierung Gerät und eine schematische Darstellung der Positionierung der Maus auf dem Gerät unter einem Mikroskop-Objektiv ist in Abbildung 1 dargestellt. Unter Berücksichtigung adäquater Raum zum Atmen Bewegungen unter dem Körper des Tieres gewährleistet in-vivo-Bildgebung im Rückenmark stabil. Abbildung 2 zeigt die enge Beziehung zwischen Mikroglia und das Gefäßsystem, wie es war in vivo in das Rückenmark von CX3CR1 ^{GFP / +} transgenen Mäusen ¹⁸ abgebildet, in die Mikrogliazellen sind endogen mit GFP-markierten. Abbildung 3 zeigt Beispiele für repetitivein-vivo-Bildgebung, wie sie in der gleichen Rückenmarks Bereiche in Mäusen, die ein fluoreszierendes Protein in der Wirbelsäule Axone (YFP-H-Linie ³⁾ und Mikroglia (in der CX3CR1 ^{GFP / +} Mäusen) durchgeführt wurde.

Abbildung 1. Stabilisierung der Maus Wirbelsäule in-vivo-Bildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie. (A) Eine maßgeschneiderte Grundplatte aus Stahl wird verwendet, um die Unterstützung und Ausrichtung der STS-A Narishige kompakte Rückenmark Schraubzwingen und MA-6N Narishige Kopf hält Adapter wie hier gezeigt. (B) Die richtige Positionierung der erwachsenen transgenen Mäuse betäubt mit einer KXA Narkose an der Wirbelsäule Stabilisierung Gerät. Der Einschub zeigt die Platzierung der Wirbelsäule Klammern unmittelbar rostral und kaudal auf die Laminektomie und die freigelegten Rückenmark.

Abbildung 2. In-vivo-Bildgebung mit hoher Dichte Mikroglia-Zellen und Blutgefäßen in das Rückenmark von narkotisierten Mäusen. Projizierte aber blockfreien z-Stapel (A) sehr dicht GFP-positive Mikroglia (grün) in das Rückenmark eines CX3CR1 ^{GFP / +} Maus in der Nähe von Blutgefäßen (rot, beschriftet mit iv-Injektion von Rhodamin Dextran). (B) Hohe Vergrößerung Bild wie in (A) aus einem einzigen Mikrogliazellen an der Wand eines Blutgefäßes mit Prozessen rund um das Schiff verlängert und in Richtung des Rückenmarks Parenchym bezeichnet. Scale-Bars, 10 um.

Abbildung 3. Repetitive in-vivo-Bildgebung des gleichen axonalen Segmenten und Mikroglia, wie sie verlegt wurden und reimaged in das Rückenmark von anästhesierten Mäusen an verschiedenen Tagen. (A) YFP-lab ELED Axone an den Tagen 0 und 5. (B). Das gleiche vaskuläre Strukturen und Mikroglia-Zellen um sie herum abgebildet in vivo in das Rückenmark von CX3CR1 ^{GFP / +} Mäusen an den Tagen 0 und 1. Scale-Bars, 10 um.

Movie 1. Representative Zeitraffer-Sequenz in vivo von der Maus Rückenmark erworben. Diese Sequenz zeigt im Detail fein Mikroglia Prozessdynamik (grün) und ihre Wechselwirkungen mit dem Gefäßsystem (rot, beschriftet mit iv-Injektion von Rhodamin Dextran) im Laufe der Zeit innerhalb eines Gewebes dicht mit fluoreszierender Strukturen besiedelt. Die RAW-Bilder waren nur für Hintergrundgeräusche, Helligkeit und Kontrast korrigiert und die Zeitraffer Film wurde von z-Projektion nacheinander erworben Bildstapeln gebaut, ohne Bildausrichtung, durchschnittlich oder z-Auswahl der einzelnen Ebenen. Blutgefäße durchlaufen eine ähnliche Reihe von z Ebenen wie die Bilder von Mikroglia. Z-Ebene Tiefe: 38 um.oad/2760/Davalos_Movie_1.mov "> Klicken Sie hier, um den Film zu sehen.

Movie 2. Timelapse-Sequenz zeigt die rohe Stabilität der bildgebenden Verfahren auf der Ebene eines einzelnen z-Ebene. Schnelle Erfassung der gleichen einfachen z-Ebene in das Rückenmark von CX3CR1 ^{GFP / +} Mäuse an der Wirbelsäule Stabilisierung Gerät unter KXA Narkose gelegt, zeigt minimal image Verschiebung zwischen aufeinander folgenden Frames bei einer Abtastrate von 1 Bild / s, die schneller ist als die Atemfrequenz der Maus. Der kleine Rest-Verschiebung ist wahrscheinlich auf Herzschlag. Klicken Sie hier, um den Film zu sehen.

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Diskussion

Die hier beschriebene Methode ermöglicht einen stabilen und repetitive in vivo Bildgebung von dicht besiedelten fluoreszierende zellulären Strukturen in das Rückenmark von anästhesierten Mäusen mit zwei-Photonen-Mikroskopie. Die erreichte Stabilität ist das Ergebnis einer maßgeschneiderten Wirbelsäulenstabilisierung Gerät und ein Anästhetikum Regime, Atemwegs-induzierte Bewegung Artefakt reduziert. Die Wirbelsäule Stabilisierung Gerät ermöglicht Atempause der Unterseite der Maus Körper und kann mi...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Rhodamin B Dextran	Invitrogen	D1841	70 kDa, verdünnt in ACSF (3% w / v)
Ketamin HCl	Bionichepharma	NDC No: 67457-001-10	Injizierbare, 50mg/ml
Anased	Lloyd Labs	NADA No: 139-236	Xylazin injizierbare, 20mg/ml
Acepromazine	Vedco	NADA No: 117-531	Injizierbare, 10mg/ml
Künstliche Tränen Salbe	Phönix Pharma-	NDC No: 57319-760 - 25	Schmiermittel
Betadine	Fischer	19-061617
McPherson-Westcott Schere	World Precision Instruments	555500S	Gebogen, stumpf-Spitze Schere
Gerade Pinzette	World Precision Instruments	555047FT	Zahnriemen Spitze Pinzette
Kleine Schiffe cauterize	Feine Science Tools	18000-00
Gelfoam	Pharmacia, Pfizer Inc.	Schwingmühle MM400
Compact Rückenmark Klemmen	Narishige	STS-A
Head Holding-Adapter	Narishige	MA-6N
Gelseal	Amersham Biosciences Corp	80-6421-43
Ringer-Laktat-	Baxter Healthcare	2B8609
Buprenex	Reckit Benckiser Pharmaceuticals Inc.	NDC No: 12496 - 6757-1	Buprenorphin, injizierbare
Baytril	Bayer	NADA 140-913	Enrofloxacin, antibakterielle injizierbaren 2,27% (20ml)
Heizkissen - Large	Feine Science Tools	21060-10