Dans l'imagerie in vivo de la moelle épinière de souris utilisant microscopie à deux photons

Résumé

Un protocole minimalement invasive pour stabiliser la colonne vertébrale de souris et d'effectuer répétitives In vivo moelle épinière en utilisant microscopie à deux photons est décrit. Cette méthode combine un dispositif de stabilisation vertébrale et un régime d'anesthésie afin de minimiser les mouvements induits par des voies respiratoires et de produire des données d'imagerie brutes qui ne nécessitent pas d'alignement ou d'autres post-traitement.

Résumé

L'imagerie in vivo en utilisant microscopie à deux photons dans ^une souris qui ont été génétiquement modifiées pour exprimer des protéines fluorescentes dans des types cellulaires ^2-3 a sensiblement élargi notre connaissance des processus physiologiques et pathologiques dans de nombreux tissus in vivo ^4-7. Dans les études sur le système nerveux central (SNC), il ya eu une large application de l'imagerie in vivo dans le cerveau, qui a produit une pléthore de nouvelles et les résultats souvent inattendus sur le comportement des cellules comme les neurones, les astrocytes, la microglie, sous conditions physiologiques ou pathologiques ^8-17. Toutefois, des complications essentiellement techniques ont limité la mise en œuvre de l'imagerie in vivo dans des études de la moelle épinière de souris vivante. En particulier, la proximité anatomique de la moelle épinière vers les poumons et le cœur génère des artefacts importants mouvements qui permet l'imagerie de la moelle épinière qui vivent une tâche difficile. Nous avons développé une nouvelle méthode qui permet de surmonter les limitations inhérentes à l'imagerie de la moelle épinière par la stabilisation de la colonne vertébrale, réduisant respiratoires induites par les mouvements et en facilitant ainsi l'utilisation de la microscopie à deux photons à l'image de la moelle épinière de souris in vivo. Ce résultat est obtenu en combinant un dispositif de stabilisation spinale personnalisé avec une méthode d'anesthésie profonde, résultant en une réduction significative des maladies respiratoires induites par les mouvements. Ce protocole vidéo montre comment exposer une petite zone de la moelle épinière qui vivent peut être maintenu sous des conditions physiologiques stables sur de longues périodes de temps en gardant une lésion des tissus et des saignements au minimum. Représentant des images brutes acquises en détail in vivo à haute résolution de la relation étroite entre les microglies et la vascularisation. Une séquence timelapse montre le comportement dynamique des processus microgliales dans la moelle épinière de souris vivante. Par ailleurs, une analyse continue de la même z-cadre démontrents la stabilité exceptionnelle que cette méthode peut réaliser pour générer des piles d'images et / ou des films timelapse qui ne nécessitent pas d'alignement d'image post-acquisition. Enfin, nous montrons comment cette méthode peut être utilisée pour revisiter et réimager la même zone de la moelle épinière au timepoints plus tard, permettant des études longitudinales de cours de processus physiologiques ou pathologiques in vivo.

Protocole

1. Construire le dispositif de stabilisation spinale

1. Ordre de la mission STS-A Narishige Compact Pinces moelle épinière et le Narishige MA-6N adaptateur tenant la tête.
2. Conception sur mesure et faire une plaque en acier inoxydable de base pour tenir les deux parties Narishige dans l'alignement de sorte que la tête de l'animal est pris en charge alors que sa colonne vertébrale et la queue sont serrées. Gardez à l'esprit que l'ensemble du dispositif doit pouvoir être placés sous l'objectif du microscope généralement sur une platine de microscope abaissé.

2. La chirurgie des animaux

1. Pré-chauffer la chambre du microscope avec un dispositif de chauffage de l'air et le maintenir à 37 ° C.
2. Peser les animaux et faire le mélange anesthésique en utilisant 100 mg de kétamine, 15 mg de xylazine et 2,5 acépromazine mg par kg de poids corporel, dilué dans une solution de NaCl 0,9% dans des conditions stériles.
3. Anesthésier les animaux par l'injection de l'anesthésique mélange (KXA) par voie intrapéritonéale. Pincer orteils doivent être effectuées régulièrement pour s'assurer une anesthésie profonde à traversl'expérience. Supplément avec la moitié de la dose initiale horaire ou selon les besoins.
4. Utilisez un tapis de petits animaux de chauffage à fournir un soutien thermiques tout en effectuant la procédure chirurgicale.
5. Appliquer une pommade artificielle des larmes sur les yeux pour éviter la déshydratation de la cornée et des dommages.
6. Rasez le dos de l'animal d'abord avec un dispositif de coupe et ensuite avec une lame tranchante pour supprimer complètement les cheveux de la zone autour de l'incision.
7. Enlever les poils rasés et désinfecter la surface de la peau rasée avec un tampon d'alcool.
8. Effectuer un petit (~ 1,5 cm) incision longitudinale de la peau sur le niveau souhaité vertébrale (vertèbres thoraciques représenté ici).
9. Exposer la musculature arrière par attentivement rétractant le tissu conjonctif sous-cutané.
10. Soigneusement séparée des muscles paravertébraux de la colonne vertébrale au niveau désiré. Effectuer le moins possible de détacher les incisions les muscles des deux côtés de chaque processus épineux et puis gratter les muscles détaché unchemin de la surface laminaire.
11. Choisissez la lame qui sera enlevé et préparer les sites d'entrée pour les pinces de la colonne vertébrale de chaque côté de la colonne vertébrale, juste rostrale et caudale de la laminectomie. Soigneusement supplanter tissu musculaire pour faire quatre poches où les pinces seront insérés.
12. Soulevez la colonne vertébrale avec la denture droite pointe pince pour permettre l'insertion sûre des courbes émoussées la pointe des ciseaux sous la lame sans toucher la moelle épinière. Effectuez la laminectomie par lentement couper les os d'un côté puis de l'autre côté.
13. Utilisez un coton-tige ou d'insérer prédécoupés petits morceaux Gelfoam éponge de gélatine absorbable à côté de l'incision pour limiter les saignements mineurs. Utiliser un petit bâtiment cauterizer pour contrôler les saignements supplémentaires si nécessaire. Utilisez préchauffé stériles fluide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) de laver les tissus.

3. Stabilisation de la colonne vertébrale et la préparation pour l'imagerie in vivo

1. Plac e l'animal sur un coussin d'altitude sur la plaque de base du dispositif de stabilisation vertébrale et sécuriser la tête dans l'adaptateur de tête de portefeuille.
2. Placer les pinces vertébrale de la mission STS-Un dispositif le long de l'axe antéro-postérieur de l'animal dans les poches pré-préparés flanquant la laminectomie (figure 1). Les deux pinces doivent être placés à un angle de ~ 45 ° par rapport à rostro-caudale de l'animal axe pour laisser un espace suffisant pour faire baisser une lentille à immersion d'eau au cours de la moelle épinière exposée (figure 1).
3. Placez la pince tiers de la mission STS-Un dispositif à la base de la queue pour le corps de l'animal peut être en suspension dans l'air après le retrait de la plaquette d'altitude pour la durée des expériences d'imagerie (figure 1).
4. Construire un petit puits d'Gelseal (Amersham Biosciences Corp) autour de la moelle épinière exposés afin de faciliter le maintien de la moelle épinière dans l'ACSF et l'immersion de l'objectif du microscope dans cette solution pour l'imagerie in vivo.

jove_title "> 4. Dans l'imagerie in vivo de la moelle épinière de souris avec la microscopie à deux photons

1. Transfert de l'animal sur le dispositif de stabilisation spinale intérieur de la chambre préchauffé couvrant le microscope et le fixer sur une platine de microscope abaissé plaçant la laminectomie droites sous la lentille (figure 1).
2. Une lentille Lower immersion dans l'eau avec précaution dans la solution ACSF veillant à ce qu'elle ne touche pas les pinces épinière ou du Gelseal.
3. Utilisez épifluorescence pour identifier la zone d'intérêt et se concentrer sur elle. Passer en mode balayage laser et d'effectuer l'imagerie in vivo en utilisant l'appropriée à deux photons de longueur d'onde d'excitation laser, dichroïques et de filtres passe-bande pour les fluorophores présents dans le tissu imagée.

5. Imagerie répétitive et soins post-opératoires

1. A la fin des expériences d'imagerie, retirez la souris à partir du dispositif de stabilisation vertébrale et essuyez soigneusement le Gelseal de la zone autour de la laminectomie.Nettoyez bien la région.
2. Restaurer et suture les muscles du dos au cours de la laminectomie.
3. Restaurer et suture la peau au cours de la laminectomie, il tampon avec la bétadine.
4. Fournir une solution de lactate de Ringer ml (Baxter Healthcare) comme un complément nutritif et l'hydratation, ainsi que le traitement antalgique par voie sous cutanée (0,1 mg / kg de buprénorphine).
5. Administrer un traitement antiseptique par voie intrapéritonéale (0,03 ml par souris, 2,27% enrofloxacine solution injectable antibactérien).
6. Placer sur des animaux d'un coussin chauffant jusqu'à la guérison complète de l'anesthésie et ensuite on la maison individuelle.
7. Répétez l'administration antiseptique quotidien pour les 3-5 premiers jours après la chirurgie et le traitement antalgique toutes les 8-12 heures pendant 2-3 jours post-opératoire. Surveiller les animaux quotidiennement pour assurer un comportement normal et le rétablissement complet.
8. Pour re-imagerie à travers la laminectomie même, la réouverture de la peau suturée et les muscles et répéter les étapes décrites dans les sections 2 - 4.
9. Re-localiser les précéously imagé zone en utilisant la vascularisation artérielle comme une carte, comme décrit précédemment ^10.

6. Les résultats représentatifs

Toutes les procédures animales ont été réalisées sous les directives établies par les soins des animaux et des comités institutionnels Utiliser à l'Université de Californie, San Francisco et sont conformes à la réglementation fédérale. Une image du dispositif de stabilisation vertébrale et un schéma montrant le positionnement de la souris sur le périphérique sous une lentille de microscope est montré dans la figure 1. Permettre une salle adéquate pour les mouvements de la respiration au-dessous du corps de l'animal assure la stabilité de l'imagerie in vivo dans la moelle épinière. La figure 2 montre la relation étroite entre les microglies et les vaisseaux comme il a été imagé in vivo dans la moelle épinière des CX3CR1 ^{GFP / +} souris transgéniques ^18, dans lequel les microglies sont étiquetés avec la GFP endogène. Figure 3 montre des exemples répétitifsl'imagerie in vivo tel qu'il a été effectué dans les mêmes régions de la moelle épinière chez la souris exprimant une protéine fluorescente dans des axones épinière (YFP-H ligne ³⁾ et la microglie (CX3CR1 dans la ^{GFP + /} souris).

Figure 1. Stabilisation de la colonne vertébrale de souris pour l'imagerie in vivo en utilisant microscopie à deux photons. (A) une plaque personnalisée fait d'acier de base est utilisé pour soutenir et aligner la mission STS-A Narishige compacte pinces de la moelle épinière et la MA-6N Narishige tête de la tenue adaptateur comme indiqué ici. (B) Le positionnement correct de l'adulte de souris transgéniques anesthésiés avec un anesthésique KXA sur le dispositif de stabilisation vertébrale. L'insert montre le placement des pinces épinière immédiatement rostralement et caudalement à la laminectomie et les tissus de la moelle épinière exposées.

Figure 2. Dans l'imagerie in vivo des cellules microgliales haute densité et des vaisseaux sanguins dans la moelle épinière des souris anesthésiées. Projections, mais non-alignés z-piles de (A) très dense GFP-positives microglie (vert) dans la moelle épinière d'un CX3CR1 ^{GFP /} souris ⁺ à proximité de vaisseaux sanguins (rouge, marqué avec injection IV de la rhodamine dextran). (B) l'image à fort grossissement étiquetés comme en (A) d'une seule cellule microgliale attaché à la paroi d'un vaisseau sanguin avec les processus étendus autour du navire et vers le parenchyme de la moelle épinière. Barres d'échelle, 10 microns.

Figure 3. Répétitifs imagerie in vivo des mêmes segments axonaux et microglies comme ils ont été relocalisés et reimaged dans la moelle épinière des souris anesthésiées à des jours différents. (A) YFP-Lab axones ELED aux jours 0 et 5. (B). Les mêmes structures vasculaires et les cellules microgliales autour d'eux imagé in vivo dans la moelle épinière des CX3CR1 ^{GFP /} souris ⁺ aux jours 0 et 1. Barres d'échelle, 10 microns.

Vidéo 1. Séquence timelapse Représentant acquises in vivo de la moelle épinière de souris. Cette séquence montre en détail la dynamique processus de fines microgliales (vert) et leurs interactions avec le système vasculaire (rouge, marqué avec injection IV de la rhodamine dextran) dans le temps dans un tissu densément peuplées avec des structures fluorescentes. Les images brutes ont été corrigées pour que le bruit de fond, la luminosité et le contraste et le film a été construit par timelapse z projetant des piles d'images séquentiellement acquises, sans alignement de l'image, avec une moyenne ou z-sélection des avions individuels. Les vaisseaux sanguins passent par une gamme similaire de plans z que les images de la microglie. Profondeur de plan Z: 38 um.oad/2760/Davalos_Movie_1.mov "> Cliquez ici pour regarder le film.

Séquence Timelapse Movie 2. Démontrant la stabilité de la méthode brute d'imagerie à l'échelle d'un seul z-plan. L'acquisition rapide de la même et unique plan z dans la moelle épinière des souris ^GFP CX3CR1 ^{/ +} mis sur le dispositif de stabilisation vertébrale sous anesthésie KXA, démontre le déplacement d'image minimale entre les images consécutives à une vitesse de balayage de 1 image / s qui est plus rapide que le rythme respiratoire de la souris. Le déplacement mineure résiduelle est probablement dû au battement de coeur. Cliquez ici pour regarder le film.

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Discussion

La méthode décrite ici permet de stable et répétitive en imagerie in vivo de la fluorescence densément peuplées structures cellulaires dans la moelle épinière des souris anesthésiées à l'aide microscopie à deux photons. La stabilité obtenue est le résultat d'un instrument fait sur mesure et une stabilisation de la colonne vertébrale protocole anesthésique qui réduit d'artefact mouvement respiratoire induite. Le dispositif de stabilisation vertébrale permet de répit sous l...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires
Rhodamine B dextrane	Invitrogen	D1841	70 kDa, dilué dans ACSF (3% p / v)
Kétamine HCl	Bionichepharma	NDC Non: 67457-001-10	Injectable, 50mg/ml
Anased	Lloyd Labs	NADA Non: 139-236	Injectables xylazine, 20mg/ml
Acépromazine	Vedco	NADA Non: 117-531	Injectable, 10mg/ml
Les larmes artificielles onguent	Phoenix pharmaceutiques	NDC Non: 57319-760 - 25	Lubrifiant
Betadine	Fisher	19-061617
McPherson Westcott Ciseaux	Précision du Monde Instruments	555500S	Courbé, émoussé pointe ciseaux
Pince droite	Précision du Monde Instruments	555047FT	Pince la pointe crantée
Petit bâtiment cautériser	Outils Fine Science	18000-00
Gelfoam	Pharmacia, Pfizer Inc	Mixer Mill MM400
Compact de la moelle épinière pinces	Narishige	STS-A
Adaptateur de tête tenant	Narishige	MA-6N
Gelseal	Amersham Biosciences Corp	80-6421-43
Ringer	Baxter Healthcare	2B8609
Buprenex	Reckit Benckiser Pharmaceuticals Inc	NDC Non: 12496 - 6757-1	La buprénorphine, injectables
Baytril	Bayer	NADA 140-913	Enrofloxacine, injectable antibactérien 2,27% (20ml)
Coussin chauffant - Grand	Outils Fine Science	21060-10