Imaging in vivo del midollo spinale di topo Utilizzo di due fotoni Microscopia

Riepilogo

Un protocollo minimamente invasiva per stabilizzare la colonna vertebrale del mouse ed eseguire ripetitivo In vivo spinale utilizzando la microscopia a due fotoni è descritto. Questo metodo combina un dispositivo di stabilizzazione della colonna vertebrale e un regime di anestetico per ridurre al minimo i movimenti respiratori indotti e produrre dati di immagini grezzi che non richiedono l'allineamento o altre post-elaborazione.

Abstract

Imaging in vivo mediante microscopia a due fotoni ¹ nei topi che sono stati geneticamente modificati per esprimere proteine ​​fluorescenti in specifici tipi cellulari ^03/02 ha notevolmente ampliato la nostra conoscenza dei processi fisiologici e patologici in numerosi tessuti in vivo ^4-7. Negli studi del sistema nervoso centrale (SNC), c'è stata una vasta applicazione di imaging in vivo del cervello, che ha prodotto una pletora di nuove e spesso inattese scoperte sul comportamento delle cellule come i neuroni, astrociti, microglia, in condizioni fisiologiche o patologiche ^8-17. Tuttavia, le complicanze per lo più tecnici hanno limitato l'attuazione di imaging in vivo negli studi del midollo spinale del mouse vivente. In particolare, la vicinanza anatomica del midollo spinale ai polmoni e al cuore genera artefatti significativo movimento che rende l'imaging del midollo spinale che vivono un compito impegnativo. Abbiamo sviluppato un nuovo metodo che supera i limiti intrinseci di imaging del midollo spinale mediante la stabilizzazione della colonna vertebrale, la riduzione delle vie respiratorie indotta da movimenti e facilitando così l'utilizzo della microscopia a due fotoni per l'immagine del midollo spinale del mouse in vivo. Questo si ottiene combinando un dispositivo personalizzato di stabilizzazione vertebrale con un metodo di anestesia profonda, con una conseguente significativa riduzione delle vie respiratorie indotta movimenti. Questo protocollo video mostra come esporre una piccola zona del midollo spinale vivente che può essere mantenuto in condizioni fisiologiche stabili per lunghi periodi di tempo, mantenendo danno tissutale e sanguinamento al minimo. Rappresentante immagini RAW acquisite in dettaglio vivo in alta risoluzione la stretta relazione tra microglia e la vascolarizzazione. Una sequenza timelapse mostra il comportamento dinamico dei processi microgliali nel midollo spinale del mouse vivente. Inoltre, una scansione continua della stessa z-frame dimostrares la stabilità eccezionale che questo metodo può raggiungere per generare pile di immagini e / o filmati timelapse che non richiedono l'allineamento dell'immagine post-acquisizione. Infine, ci mostrano come questo metodo può essere usato per rivisitare e re-imaging stessa area del midollo spinale in seguito timepoints, consentendo studi longitudinali in corso di processi fisiologici o patologici in vivo.

Protocollo

1. Costruire il dispositivo di stabilizzazione della colonna vertebrale

1. Ordina la STS-A Narishige Morsetti Compact midollo spinale e la MA-6N Narishige adattatore in mano la testa.
2. Design personalizzato e fare una piastra di base in acciaio inox per tenere le due parti Narishige in allineamento in modo che la testa dell'animale è supportato mentre la sua spina dorsale e la coda sono bloccato. Tenete presente che l'intero dispositivo dovrebbe andare bene sotto la lente microscopio di solito su un palco microscopio abbassato.

2. Animal chirurgia

1. Pre-riscaldare la camera di microscopio con un dispositivo di riscaldamento ad aria e mantenerla a 37 ° C.
2. Pesare l'animale ed effettuare il mix di anestetico con 100 mg di ketamina, 15 mg e 2,5 xylazina acepromazina mg per kg di peso corporeo, diluito in soluzione di NaCl 0,9% in condizioni di sterilità.
3. Anestetizzare l'animale, iniettando l'anestetico mix (KXA) per via intraperitoneale. Pizzicare piedi regolari devono essere eseguiti per garantire l'anestesia profonda in tuttol'esperimento. Supplemento con metà della dose iniziale oraria o, se necessario.
4. Utilizzare una piccola piastra elettrica animali per fornire supporto termico durante l'esecuzione della procedura chirurgica.
5. Applicare artificiale unguento lacrime sugli occhi per prevenire la disidratazione della cornea e danni.
6. Radersi la parte posteriore del primo animale con un dispositivo di taglio e poi con una lama affilata per rimuovere completamente i capelli dalla zona intorno l'incisione.
7. Rimuovere i capelli rasati e disinfettare la superficie della pelle rasata con un tampone di alcool.
8. Eseguire un piccolo (~ 1,5 cm) incisione longitudinale della pelle sopra il livello desiderato spinale (vertebre toraciche mostrato qui).
9. Esporre la muscolatura della schiena ritraendo con cura il tessuto connettivo sottocutaneo.
10. Separare con attenzione i muscoli paravertebrali dalla colonna vertebrale al livello desiderato. Eseguire il minor numero di incisioni possibile staccare i muscoli da entrambi i lati di ogni processo spinoso e poi raschiare i muscoli staccò unavia dalla superficie laminare.
11. Scegli la lamina che verrà rimosso e preparare i siti di ingresso per i morsetti spinale su entrambi i lati della colonna vertebrale, immediatamente rostrale e caudale alla laminectomia. Con attenzione spostare tessuto muscolare per fare quattro tasche dove i morsetti verrà inserito.
12. Sollevare la colonna vertebrale con la dentatura diritta punta pinze per consentire l'inserimento sicuro delle curve punta smussata forbici sotto la lamina senza toccare il midollo spinale. Eseguire la laminectomia lentamente tagliando l'osso da un lato e poi dall'altro lato.
13. Utilizzare un tampone di cotone o inserire pretagliati piccoli pezzi Gelfoam assorbibile spugna di gelatina accanto al incisioni di limitare sanguinamento minore. Utilizzare un cauterizer piccolo vaso per controllare l'emorragia ulteriormente se necessario. Usa preriscaldato sterile fluido cerebrospinale artificiale (ACSF) per lavare i tessuti.

3. Stabilizzazione della colonna vertebrale e la preparazione per imaging in vivo

1. Plac e l'animale su una base di elevazione sulla piastra di base del dispositivo di stabilizzazione della colonna vertebrale e fissare la testa l'adattatore capo azienda.
2. Posizionare i morsetti spinale della STS-Un dispositivo lungo la asse anteriore-posteriore dell'animale nel pre-preparati tasche che fiancheggiano il laminectomia (Figura 1). I due morsetti deve essere posizionato con un angolo di circa 45 ° rispetto alla dell'animale asse rostro-caudale per consentire spazio sufficiente per abbassare una lente immersione in acqua oltre il midollo spinale esposti (Figura 1).
3. Posizionare il morsetto terzo della STS-Un dispositivo alla base della coda così corpo dell'animale possono essere sospesi in aria dopo la rimozione del tampone elevazione per tutta la durata degli esperimenti di imaging (Figura 1).
4. Costruire un piccolo pozzo di Gelseal (Amersham Biosciences Corp.) intorno al midollo spinale esposti a facilitare il mantenimento del midollo spinale in ACSF e l'immersione della lente microscopio in questa soluzione per imaging in vivo.

jove_title "> 4. Nel imaging in vivo del midollo spinale di topo con la microscopia a due fotoni

1. Trasferire l'animale sul dispositivo di stabilizzazione spinale all'interno della camera preriscaldato che copre il microscopio e fissarlo su un palco microscopio abbassato posizionando il laminectomia direttamente sotto la lente (Figura 1).
2. Inferiore ad acqua immersione lente con attenzione nella soluzione ACSF facendo attenzione che non tocchi i morsetti spinale o il Gelseal.
3. Usa epifluorescenza per identificare l'area di interesse e concentrarsi su di esso. Passa alla modalità di scansione laser e di eseguire imaging in vivo utilizzando l'apposito a due fotoni laser a lunghezza d'onda di eccitazione, dicroici e filtri passa-banda per la fluorofori presenti nel tessuto fotografato.

5. Immagini ripetitive e assistenza post-operatoria

1. Alla fine degli esperimenti di imaging, togliere il mouse dal dispositivo di stabilizzazione della colonna vertebrale e asciugare con cura il Gelseal dalla zona intorno alla laminectomia.Pulire bene la zona.
2. Ripristinare e suturare i muscoli della schiena sopra la laminectomia.
3. Ripristinare e suturare la pelle sopra la laminectomia, è tampone con Betadine.
4. Fornire 1 ml di soluzione lattato Ringers (Baxter Healthcare) come supplemento nutritivo e l'idratazione, così come il trattamento analgesico per via sottocutanea (0,1 mg / kg di buprenorfina).
5. Somministrare per via intraperitoneale antisettico trattamento (0,03 ml per il mouse, 2,27% soluzione iniettabile enrofloxacina antibatterici).
6. Animale posto su una piastra elettrica fino a pieno recupero dall'anestesia e successivamente casa individualmente.
7. Ripetere la somministrazione antisettico giorno per i primi 3-5 giorni dopo l'intervento chirurgico e un trattamento analgesico ogni 8-12 ore per 2-3 giorni dopo l'intervento. Monitoraggio animali al giorno per garantire un comportamento normale e pieno recupero.
8. Per re-imaging attraverso la laminectomia stesso, riaprire la pelle suturata e muscoli e ripetere i passaggi descritti nelle sezioni 2 - 4.
9. Ri-localizzare la preceously ripreso zona utilizzando i vasi sanguigni come una mappa come descritto in precedenza ^10.

6. Rappresentante risultati

Tutte le procedure di animali sono state effettuate in base agli orientamenti fissati dal Animal Care istituzionali e dei Comitati Usa presso la University of California, San Francisco e sono conformi alle normative federali. Una foto del dispositivo di stabilizzazione della colonna vertebrale e uno schema che mostra il posizionamento del mouse sul dispositivo sotto una lente microscopio è mostrato in Figura 1. Lasciando spazio sufficiente per i movimenti respiratori sotto il corpo dell'animale assicura stabile imaging in vivo nel midollo spinale. La figura 2 mostra la stretta relazione tra microglia e la vascolarizzazione come è stato ripreso in vivo nel midollo spinale di CX3CR1 ^{GFP / +} topi transgenici ^18, microglia, in cui sono endogenamente etichettati con GFP. Figura 3 mostra alcuni esempi di ripetitivoimaging in vivo come è stato eseguito nelle stesse aree del midollo spinale nei topi che esprimono una proteina fluorescente negli assoni spinali (YFP-H linea ³⁾ e microglia (nel CX3CR1 ^{GFP / +} topi).

Figura 1. Stabilizzazione della colonna vertebrale del mouse per imaging in vivo mediante microscopia a due fotoni. (A) Una misura piastra di base in acciaio viene utilizzata per supportare e allineare la STS-A Narishige morsetti compatti del midollo spinale e la MA-6N Narishige testa in possesso di adattatore come mostrato qui. (B) Il corretto posizionamento di topi transgenici adulti anestetizzati con un anestetico KXA sul dispositivo di stabilizzazione della colonna vertebrale. L'inserto viene illustrata la posizione dei morsetti spinale immediatamente rostralmente e caudalmente alla laminectomia e il tessuto esposto midollo spinale.

Figura 2. Imaging in vivo ad alta densità di cellule microgliali e dei vasi sanguigni nel midollo spinale di topi anestetizzati. Proiezione ma non allineati z-pile di (A) ad alta densità GFP-positive microglia (verde) nel midollo spinale di una ^GFP CX3CR1 ^/ mouse ⁺ in stretta vicinanza con i vasi sanguigni (rosso, marcato con l'iniezione endovenosa di rodamina destrano). (B) ingrandimento dell'immagine ad alta etichettato come in (A) di una singola cellula della microglia attaccato alla parete di un vaso sanguigno con i processi esteso intorno alla nave e verso il parenchima del midollo spinale. Barre di scala, 10μm.

Figura 3. Ripetuti negli imaging in vivo dei segmenti stessi assonale e microglia come sono stati trasferiti e re-imaging nel midollo spinale di topi anestetizzati in giorni diversi. (A) YFP-lab assoni forme ai giorni 0 e 5. (B). Le stesse strutture vascolari e cellule della microglia che li circonda ripreso in vivo nel midollo spinale di CX3CR1 ^{GFP / mice +} ai giorni 0 e 1. Barre di scala, 10μm.

Movie 1. Sequenza Timelapse rappresentante acquisito in vivo dal midollo spinale di topo. Questa sequenza mostra in dettaglio la dinamica sottile processo di microglia (verde) e le loro interazioni con il sistema vascolare (rosso, marcato con rodamina iv iniezione di destrano) nel tempo all'interno di un tessuto densamente popolato con strutture fluorescenti. Le immagini RAW sono stati solo corretti per il rumore di fondo, la luminosità e il contrasto e il film timelapse è stato costruito da z-stack proiettando immagini in sequenza acquisita, senza allineamento dell'immagine, con una media o z-selezione di piani individuali. I vasi sanguigni passare attraverso una serie simile di aerei z come le immagini della microglia. Z profondità aereo: 38 micron.oad/2760/Davalos_Movie_1.mov "> Clicca qui per guardare il film.

Movie 2. Sequenza Timelapse dimostrare la stabilità prime del metodo di imaging a livello di un singolo piano z. Rapida acquisizione dello stesso singolo piano z nel midollo spinale di topi ^GFP CX3CR1 ^{/ +} immessi sul dispositivo di stabilizzazione della colonna vertebrale in anestesia KXA, dimostra cilindrata minima immagine tra fotogrammi consecutivi ad una velocità di scansione di 1 frame / s che è più veloce della frequenza respiratoria del mouse. La cilindrata minore residuo è probabilmente dovuto al battito cardiaco. Clicca qui per guardare il film.

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Discussione

Il metodo qui descritto consente di stabile e ripetitivo nel imaging in vivo di densamente popolate strutture fluorescenti cellulari nel midollo spinale di topi anestetizzati utilizzando la microscopia a due fotoni. La stabilità raggiunta è il risultato di un dispositivo su misura di stabilizzazione della colonna vertebrale e un regime di anestetico che riduce respiratoria indotta artefatto movimento. Il dispositivo di stabilizzazione della colonna vertebrale permette di respiro sotto il corpo del mo...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Rodamina B destrano	Invitrogen	D1841	70 kDa, diluito in ACSF (3% w / v)
Ketamina HCl	Bionichepharma	NDC No: 67457-001-10	Iniettabili, 50mg/ml
Anased	Lloyd Labs	NADA No: 139-236	Xylazina iniettabili, 20mg/ml
Acepromazina	Vedco	NADA No: 117-531	Iniettabili, 10mg/ml
Lacrime artificiali unguento	Fenice farmaceutico	NDC No: 57319-760 - 25	Lubrificante
Betadine	Pescatore	19-061617
McPherson-Westcott Forbici	Mondo di precisione Strumenti	555500S	Curvato, smussato-tip forbici
Pinza dritta	Mondo di precisione Strumenti	555047FT	Pinza punta dentata
Cauterizzare piccoli vasi	Strumenti Scienza multa	18000-00
Gelfoam	Pharmacia, Pfizer Inc.	Mixer Mill MM400
Compatta del midollo spinale morsetti	Narishige	STS-A
Adattatore tenendo testa	Narishige	MA-6N
Gelseal	Amersham Biosciences Corp.	80-6421-43
Ringer lattato	Baxter Healthcare	2B8609
Buprenex	Reckit Benckiser Pharmaceuticals Inc.	NDC No: 12496 - 6757-1	Buprenorfina, iniettabili
Baytril	Bayer	NADA 140-913	Enrofloxacina, iniettabili antibatterico 2,27% (20ml)
Riscaldamento pad - Grande	Strumenti Scienza multa	21060-10