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Method Article
* Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen
Ein einfaches Slot-Blot-Methode wurde für die Quantifizierung von Influenza Virus Hämagglutinin und Neuraminidase mit universellen Antikörper, die gegen ihre stärksten konservierten Sequenzen durch bioinformatische Analysen identifiziert entwickelt. Dieser innovative Ansatz kann eine sinnvolle Alternative zu quantitativen Bestimmung aller viralen Hämagglutinin und Neuraminidase.
Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) sind zwei Oberflächenproteine von Influenza-Viren, die bekanntlich eine wichtige Rolle im viralen Lebenszyklus und die Induktion von schützenden Immunantworten 1,2 zu spielen. Als Hauptzielgruppe für neutralisierende Antikörper, ist HA derzeit als das Influenza-Impfstoff Potenz Marker verwendet und wird durch einzelne radiale Immundiffusion (SRID) 3 gemessen. Allerdings verursacht die Abhängigkeit der SRID von der Verfügbarkeit der entsprechenden Subtyp-spezifischen Antiseren mindestens 2-3 Monate Verzögerung für die Veröffentlichung von jedem neuen Impfstoff. Darüber hinaus, obwohl es Belege, dass die NA auch induziert eine schützende Immunität 4, die Höhe der NA in Influenza-Impfstoffen ist noch nicht standardisiert durch einen Mangel an geeigneten Reagenzien oder analytische Methode 5. So sind einfache Alternative Methoden in der Lage Quantifizierung HA und NA-Antigenen wünschenswert für die schnelle Freigabe und bessere Qualitätskontrolle von Influenza-Impfstoffen.
Universell konservierten Regionen in allen verfügbaren Influenza-A-HA und NA-Sequenzen wurden von einer leistungsfähigen Bioinformatik-Analysen 6-7 identifiziert. Eine Sequenz (bezeichnet als Uni-1) wurde in die einzige universell konservierte Epitop des HA, das Fusionspeptid 6 identifiziert, während zwei konservierte Sequenzen in Neuraminidasen, einer in der Nähe der enzymatisch aktiven Stelle (bezeichnet als HCA-2) und die identifiziert wurden, andere in der Nähe des N-Terminus (bezeichnet als HCA-3) 7. Peptide mit dieser Aminosäure-Sequenzen wurden synthetisiert und verwendet, um Kaninchen für die Produktion von Antikörpern zu immunisieren. Der Antikörper gegen das Uni-1-Epitop von HA konnte auf 13 Subtypen von Influenza-A-HA (H1-H13) zu binden, während die Antikörper gegen die HCA-2 und HCA-3-Regionen von NA wurden binden alle 9 NA-Subtypen. Alle Antikörper zeigten bemerkenswerte Spezifität gegen die viralen Sequenzen als durch die Beobachtung, dass keine Kreuzreaktivität zu Allantois Proteine erkannt wurde nachgewiesen. Diese universellen Antikörper wurden dann verwendet, um Slot-Blot-Assays zu entwickeln, HA und NA in Influenza-A-Impfstoffe ohne die Notwendigkeit für spezifische Antiseren 7,8 quantifizieren. Vaccine Proben wurden auf eine PVDF-Membran mit einer Slot-Blot-Apparatur mit Referenzstandards verdünnt, um verschiedenen Konzentrationen angewendet. Für den Nachweis von HA, wurden die Proben und Standard-First in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) mit 4M Harnstoff, während für die Messung von NA sie in TBS verdünnt wurden mit 0,01% Zwittergent diese Bedingungen deutlich verbessert die Nachweisempfindlichkeit. Nach der Erkennung des HA und NA-Antigenen durch Immunoblot mit ihren jeweiligen universellen Antikörper wurden Signalintensitäten durch Densitometrie quantifiziert. Mengen von HA und NA in den Impfstoffen wurden dann anhand einer Standardkurve mit den Signalintensitäten der verschiedenen Konzentrationen der Referenzen verwendet etabliert.
Da diese Antikörper binden an universellen Epitope in HA oder NA konnten sich Interessierte Forscher sie als Werkzeuge der Forschung Verwendung in Immunoassays andere als die Slot-Blot nur.
1. Vorbereitung der Reagenzien und Geräte
2. Vorbereitung der Influenza-Impfstoff Proben und Referenz-Standard für HA-Slot-Blot-
Influenza-Impfstoff Referenzstandards mit vorgegebenen HA-Gehalt entsprechend der Impfstämme zu prüfenden wurden aus dem Zentrum für Biologics Evaluation and Research (CBER / FDA, USA) oder dem National Institute for Biological Standard and Control (NIBSC, UK) erhalten und sind für die HA Quantifizierung durch Slot-Blot verwendet. Die Ermittler konnten bereiten auch ihre eigenen Antigen-Standards unter Verwendung etablierter Verfahren wie in Verweise 9 und 10 beschrieben.
3. Vorbereitung der Influenza-Impfstoff Proben und Referenz-Standard für NA Slot-Blot-
Influenza-Impfstoff Referenzstandards entsprechend der Impfstämme zu prüfenden wurden aus dem Zentrum für Biologics Evaluation and Research (CBER / FDA, USA) oder dem National Institute for Biological Standard and Control (NIBSC, UK) erhalten und sind für die NA Quantifizierung verwendet durch Slot-Blot. Die NA Inhalt dieser Referenzproben durch SDS-PAGE-Analyse von deglykosylierter Proben in Verbindung mit Densitometrie Scan-Analyse bestimmt wurde, wie zuvor beschrieben 9, mit leichten Modifikationen 10. Kurz gesagt, wurden die deglykosylierter Impfstoff Referenzproben (5 ug) mit Probenpuffer gemischt und auf dem Gel. Das Gel wurde bei 20 mA für ca. 90 min laufen, bis die Verfolgung Farbstoff nur aus dem Gel laufen, gefolgt von Sypro Färbung. Densitometrie Quantifizierung von Proteinen erfolgte mit einem Fluorchem Geldokumentationssystem (Alpha Innotech) durchgeführt. Die Höhe der NA wurde basierend auf dem Verhältnis der NA-Proteine an die gesamten Proteine, wie Lowry-Assay ermittelt. Referenzproben hergestellt unter Verwendung dieser Methode kann dann in Slot-Blot zur Quantifizierung von NA Inhalte in Impfstoff Proben von Impfstoffen Hersteller verwendet werden.
4. Versammlung der Bio-Dot SF Mikrofiltration Apparate und Blotting von Proben auf PVDF-Membran
5. Immunoblotting von HA und NA-Antigenen
6. Repräsentative Ergebnisse:
Bioinformatik-Analysen aller verfügbaren Influenza-A-HA-Sequenzen bestätigte die N-Terminus der HA2 Untereinheit (die Fusion Peptid) als einzige konservierte Region von HA. Abbildung 1 zeigt die Erhaltung für jede Aminosäure-Position der identifizierten Konsensussequenz. Zwei Varianten wurden an den Positionen 2 (L-> I) und 12 (G-> N) der 14 N-terminalen Aminosäuren von HA2 identifiziert, aber solche Veränderungen gefunden wurden nicht auf die Bindung zwischen den Antikörpern und dem Peptid-Varianten 6 beeinflussen . Die Uni-1-Epitop (GLFGAIAGFIEGGW) wurde gewählt, um eine universelle Antikörper gegen HA entwickeln. Dieser Antikörper nachgewiesen bemerkenswerte Spezifität für virale Sequenzen und in der Lage ist die Bindung an 13 verschiedenen Subtypen von Influenza-A-HA (H1-H13) (Abbildung 2).
Mit einem ähnlichen Ansatz wurden zwei universell konservierten Sequenzen in allen Influenza-A-NA ist, ein in der Nähe des enzymatisch aktiven Zentrums (HCA-2) (Abbildung 3A) und die andere am N-Terminus (HCA-3) (Abbildung 3B) identifiziert . Peptide mit dieser Aminosäure-Sequenzen wurden als Antigene verwendet werden, um universelle Antikörper gegen NA zu generieren. Die Antikörper gegen beide Epitope binden können, um alle 9 Subtypen der NA und zeigte sehr wenig Kreuzreaktivität zu Allantois oder zellulären Proteinen und bewiesen damit, eine hohe Spezifität für virale NA-Sequenzen (Abbildung 4).
Abbildung 5 zeigt einen Überblick über die Slot-Blot-Verfahren für die Quantifizierung von Influenza-HA und NA.
Beispiele für HA und NA-Antigen-Slot-Blot-Analyse sind in den Abbildungen 6 und 7 dargestellt. Abbildung 6A und 6C zeigt repräsentative Ergebnisse nach der Erkennung des HA-Antigen in einer Influenza-Impfstoff Referenzstandard und Impfstoff Proben. Jede Probe (Standard-oder Impfstoff) wurde in Doppelbestimmung durchgeführt, in benachbarten Vertiefungen. Duplikate sollen zeigen similar Intensitäten nach der Aufdeckung. Optimierung der Antikörper-Verdünnungen, Inkubation und Belichtungszeit kann je nach Bedarf und Antikörpern verwendet werden.
Ein Beispiel für eine typische Standardkurve erhalten nach der Aufdeckung von verschiedenen Konzentrationen von HA von einem Impfstoff Referenzstandard Probe wird in Abbildung 6B gezeigt. Die Konzentration von HA-Antigen ist proportional zur Signalintensität folgenden Chemilumineszenzdetektion der Slot-Blot und passt die 4-PL Kurvenanpassung Modell für diesen Konzentrationsbereich (0,0938 bis 6 pg HA / ml).
Abbildung 7 zeigt repräsentative Ergebnisse der Erkennung der NA-Antigen in einer Influenza-Impfstoff Referenzstandard und in Impfstoff-Proben. Density-Analyse zeigte, dass die Intensität des Signals durch den Nachweis der NA-Antigen in verschiedenen Verdünnungen eines Impfstoffs Referenzstandard durch Slot-Blot erhalten proportional zur Konzentration des NA (Abb. 7A) ist. Die daraus resultierende Standardkurve passt ein 4-PL Modell für diesen Konzentrationsbereich (0,039 bis 10 pg NA / ml), wie in Abbildung 7B gezeigt. Abbildung 7C zeigt ein Beispiel einer Slot-Blot-Analyse der NA-Gehalt in Grippeimpfstoff Proben. Jede Probe wurde in Doppelbestimmung durchgeführt, in benachbarten Vertiefungen.
Abbildung 1. Conservation Rate der Uni-1-Epitop in der Fusionspeptid Region des Influenza-A HA.
Bioinformatik-Analysen aller verfügbaren Influenza-A-HA-Sequenzen bestätigt, dass die Fusionspeptid (am N-Terminus der HA2 Untereinheit) das einzige universell konservierte Region von HA ist. Beachten Sie, dass die beiden Varianten an Position 2 (L-> I) und 12 (G-> N) gefunden wurden, nicht an den Antikörper Bindung 6 beeinflussen. Eine universelle Antikörper binden können 13 verschiedene Subtypen des Influenza-A-HA (H1-H13) wurde mit Hilfe der Uni-1-Epitop (GLFGAIAGFIEGGW).
Abbildung 2. Erkennung von 13 Subtypen des HA durch allgemeine Antikörper gegen HA.
Allantois Flüssigkeiten von 13 Subtypen von Influenza A-Viren vermehrt in bebrüteten Eier wurden fraktioniert in SDS-PAGE, gefolgt von einem Nachweis der HA-Proteine mit der Universal-Antikörper gegen das Uni-1-Epitop von HA. NP-Protein wurde als Ladekontrolle mit einem polyklonalen Kaninchen-NP-spezifische Antikörper nachgewiesen. Negative Kontrolle (-) war Allantoisflüssigkeit aus infizierten Eiern. Positive Kontrolle (+) war ein Referenz-Standard von H1 aus NIBSC, UK
Abbildung 3. Sequenzhomologie von Influenza-A-NA in der Nähe des enzymatisch aktiven Zentrums und der N-Terminus.
Zwei universell konservierten Sequenzen wurden in Influenza-A-NA von einer leistungsfähigen Bioinformatik, einer in der Nähe der enzymatisch aktiven Stelle (HCA-2) befindet (Panel A), die andere am N-Terminus (HCA-3) (Panel B) identifiziert. Peptide mit diesen konservierten Aminosäure-Sequenzen wurden synthetisiert und verwendet werden, um universelle Antikörper gegen NA zu generieren.
Abbildung 4. Erkennung von 9 Subtypen der NA von NA-Antikörper.
Allantois Flüssigkeiten von neun NA-Subtypen von Influenza A-Viren vermehrt in bebrüteten Eier wurden fraktioniert in SDS-PAGE, gefolgt von einem Nachweis der NA-Proteine mit der HCA-2 (Panel A) und HCA-3 (Panel B) Antikörper. NP-Protein wurde als Ladekontrolle mit einem polyklonalen Kaninchen-NP-spezifischen Antikörper (Panel C) nachgewiesen. Negative Kontrolle (-) war Allantoisflüssigkeit aus infizierten Eiern. Positive Kontrolle (+) war Allantoisflüssigkeit mit rNA1 von A / New Caledonia/20/99 versetzt und sondiert mit den entsprechenden Antiseren.
Abbildung 5. Flussdiagramm der Slot-Blot-Verfahren für die Quantifizierung von HA und NA-Antigenen in Influenza-Impfstoffen.
Der Puffer für Probenverdünnung sowie für Wasch-und Blockierung der Slot-Blot-Membran benötigt werden zuerst hergestellt und die PVDF-Membran und Filterpapiere für die Montage des Bio-Dot SF Mikrofiltration Apparat benötigt werden eingeweicht. Influenza-Impfstoff und Referenz-Standard-Proben sind in der optimalen Puffer für HA-oder NA-Erkennung durch Slot-Blot-verdünnt. Die Bio-Dot SF Mikrofiltration Gerät ist gemäß den Anweisungen des Herstellers und die Proben werden auf die PVDF-Membran aufgebracht montiert. HA und NA-Antigene werden unter Verwendung des universellen Antikörper gegen jedes Antigen. Densitometrie Analyse basiert auf der Chemilumineszenz-Signale für die Quantifizierung von HA und NA in den untersuchten Proben erhalten wurden, durchgeführt.
Abbildung 6. Nachweis der HA-Antigen in Grippeimpfstoff Proben und beziehenrenzstandard.
Panel A zeigt einen repräsentativen Blot erhalten folgende Immundetektion der HA-Antigen. Die HA Referenz Antigen wurde auf Konzentrationen von 0 bis 6 pg HA / ml und die Impfstoffe zu einer Konzentration von 0,375 Mikrogramm Hämagglutinin / ml in 4 M Harnstoff / TBS, bevor sie auf eine PVDF-Membran mit einer Bio-Dot SF Mikrofiltration Vorrichtung aufgebracht wurden verdünnt verdünnt . Die HA-Antigen wurde dann unter Verwendung des Uni-1 Universal-Antikörper. Panel B zeigt ein Beispiel für eine Standardkurve durch Erfassen von Signalen von verschiedenen HA-Konzentrationen von einem Impfstoff Referenzstandard erhalten. Die Signalintensität ist proportional zur Konzentration des HA und die Kurve passt ein 4-PL-Modell.
Abbildung 7. Nachweis der NA-Antigen in Grippeimpfstoff Proben und Referenz-Standard.
Panel A und B zeigen repräsentative Signale erhalten nach der Aufdeckung von NA in einer Influenza-Impfstoff Referenzstandard verdünnt, um NA-Konzentrationen im Bereich von 0 bis 10 pg NA / ml in 0,01% Zwittergent / TBS und die daraus resultierenden 4-PL Standardkurve folgenden Densitometrie analysiert. Ein Beispiel für typische Chemilumineszenz detektiert nach einer Slot-Blot-Analyse der NA-Antigen in Grippeimpfstoff Proben ist in Panel C Influenza-Impfstoff Proben gezeigt wurden auf eine Konzentration von 1 ug HA / ml in 0,01% Zwittergent / TBS verdünnt und wurden auf einen ausgelöscht PVDF-Membran mit einem Bio-Dot SF Mikrofiltration Apparat. Verdünnungen der entsprechenden Impfstoff Referenzstandard, mit Konzentrationen im Bereich von 0 bis 2,5 pg NA / ml, wurden auf dem gleichen Fleck enthalten, um eine Standardkurve für die Quantifizierung der NA-Antigen in der Impfstoff-Proben zu etablieren. Die NA-Antigen wurde mit dem HCA-2 universal-Antikörper gegen NA und Densitometrie Analyse der Chemilumineszenzsignale erhalten wurde, durchgeführt erkannt. Die Höhe der NA in jedem Impfstoff Probe kann gegen die 4-PL Standardkurve durch Auftragen der Signalintensität Werte gegenüber der NA-Konzentration für den Impfstoff Referenzstandard erhalten wird, berechnet werden.
Quantitative Bestimmung des Influenza Virus HA und NA sind entscheidend für die Impfstoff-Forschung und Entwicklung, da diese beiden Oberflächenproteine wichtigsten viralen Komponenten induzieren Immunreaktionen 6-11 sind. Zuvor berichtete immunologische Methoden zum Nachweis dieser Proteine benötigen Belastung spezifischen Antikörpern. Die einfache, reproduzierbare und schnelle Slot-Blot-Methode, um die HA und NA-Antigenen hier beschriebenen Quantifizierung eignen sich für alle Influenza-A-V...
Die Autoren bedanken sich bei Frau Monika Tocchi für redaktionelle Durchsicht des Manuskripts danken. AMH wird durch ein Stipendium von King Abdulaziz Universität unterstützt wird, durch den saudi-arabischen Kulturbüro in Kanada.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Name des Reagenzes oder Ausrüstung | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare |
---|---|---|---|
Bio-Dot SF Mikrofiltration Apparatus | Bio-Rad | 170-6542 | |
Bio-Dot SF Filterpapier | Bio-Rad | 162-0161 | |
Immobilon-FL Transfer-Membran (PVDF) | Millipore | IPFL00010 | |
Vakuumpumpe | Millipore | WP6111560 | |
Chemilumineszenz BioMax Light Film | Kodak | 178 8207 | |
FluorChem Gel-Dokumentations-System | Alpha Innotech | 29 bis 008-1896X | |
Universal-Kaninchen-Antikörper gegen HA und NA-Antigenen | Uni-1 (HA) HCA-2, HCA-3 (NA) | Antikörper sind durch MTA erhältlich oder können von interessierten Forschern nach den Verfahren zuvor beschriebenen 6,7 erzeugt werden. | |
Influenza-Impfstoff-Antigen Referenz | CBER / FDA oder NIBSC | ||
Influenza-Impfstoff Proben | Häufig in den meisten Ländern | ||
Harnstoff | Sigma-Aldrich | U1250 | |
Zwittergent 3-14 Waschmittel | Calbiochem | 693017 | |
Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Blotting Grade Blocker Non-Fett-Trockenmilch | Bio-Rad | 170-6404 | |
ImmunoPure Goat Anti-Rabbit IgG (H + L), Peroxidase-konjugierten | Thermo Scientific | 31460 | |
SuperSignal West Dura Erweiterte Duration Substrate | Thermo Scientific | 34075 |
An author's affiliation was omitted from the publication of Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays.
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