Antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung von Mycobacterium tuberculosis-Komplexes für die First und Second Line Drugs von Bouillon Verdünnung in einem Mikrotiterplatten-Format

Zusammenfassung

Antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung von Mycobacterium tuberculosis ist anspruchsvoll, aber von entscheidender Bedeutung für die Patientenversorgung. Diese Mikrotiterplatten-Format bietet Tests von 12 antimykobakterielle Drogen und bietet minimale hemmende Konzentration (MIC)-Werte, die in eine geeignete Behandlung helfen werden.

Zusammenfassung

Die schnelle Erkennung von Antibiotikaresistenzen wird in dem Bemühen, den Anstieg der resistenten Mycobacterium tuberculosis (Mtb) Kontrolle wichtig. Antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung (AST) von Mtb wird traditionell von den Agar-Methode der Anteil oder durch macrobroth Tests auf einem Instrument wie dem BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostics, Cleveland, OH) oder BacT / durchgeführt ALERT (bioMérieux, Hazelwood, MO). Die Agar-Anteil Methode, obwohl als "Gold"-Standard von AST, ist arbeitsintensiv und erfordert die Berechnung des Widerstandes, indem Koloniezahlen auf Drogen-haltigen Agar zu drogenfreien Agar verglichen. Wenn es ≥ 1% Wachstum auf das Medikament enthaltenden Medium, um Drogen-freiem Medium verglichen wird, ist der Organismus als resistent gegen das Medikament. Die macrobroth Methoden erfordern Mess-und Prüftechnik Haltepunkt ("critical") Wirkstoffkonzentrationen für die erste Zeile Medikamente (Isoniazid, Ethambutol, Rifampicin und Pyrazinamid). Die hier beschriebene Methode ist im Handel erhältlich in einer 96-well Mikrotiterplatten-Format [MYCOTB (TREK Diagnostics)] und enthält steigenden Konzentrationen von 12 Antibiotika zur Behandlung von Tuberkulose verwendet werden, einschließlich sowohl der ersten (Isoniazid, Rifampicin, Ethambutol) und zweite Zeile Medikamente (Amikacin, Cycloserin Ethionamid, Kanamycin, Moxifloxacin, Ofloxacin, para-Aminosalicylsäure, Rifabutin, und Streptomycin). Pyrazinamid ist ein erster Linie Droge, nicht in der Mikrotiterplatte durch seine Notwendigkeit sauren Prüfbedingungen enthalten. Vorteile der Mikro-System gehören sowohl einfache Einrichtung und schneller Umdrehung um Zeit (14 Tage) im Vergleich zu traditionellen Agar Anteil (21 Tage). Darüber hinaus kann die Platte aus Inokulum hergestellt unter Verwendung von entweder Brühe oder festen Medium eingestellt werden. Da die Mikrotiterplatten-Format ist neu und seit Mtb präsentiert einzigartige Herausforderungen an die Sicherheit im Labor, dieses Protokoll wird beschrieben, wie Sie sicher Setup, inkubieren und lesen Sie die Mikrotiterplatte.

Protokoll

Jedes Labor muss eine Risikobewertung in Zusammenarbeit mit ihren Institutional Biological Safety Officer durchführen, um die entsprechende Sicherheitsstufe für die Vorbereitung des Inokulums und zum Pipettieren des Inokulums in die Platte zu bestimmen. In unserem Labor verwenden wir Sicherheitsstufe 3 Labor (BSL3) Praktiken, bis die Mikrotiterplatten geimpft sind, und mit einem Kunststoff-Kleber versiegeln. Diese Platten werden dann in einen Plastikbeutel, der Wärme-auch versiegelt. Incubation und Interpretation Lesen der Mikrotiterplatte wird in einem Labor der biologischen Sicherheitsstufe 2 (BSL2) durchgeführt.

1. Kennzeichnung von Materialien

1. Beschriften Sie eine Blut-Agar-Platte, drei Middlebrook 7H10-Platten, Middlebrook 7H9-Bouillon, eine Kochsalzlösung zwischen Glasperlen Röhre und einer Mikrotiterplatte AST Platte mit den entsprechenden Kennungen (zB Name des Patienten, medizinische Datensatznummer) in der BSL2.
2. Beschriften Sie die Blut-Agar und 7H10 plated als "Reinheit zu überprüfen". Periodische Koloniezahlen des Inokulums werden empfohlen, um sicherzustellen, dass eine geeignete Konzentration von Organismen in den Test verwendet wird. Colony zählt, wenn durchgeführt werden müssen, um zwei der 7H10-Platten mit "1 / 1 Koloniezahl" und "1 / 50 Koloniezahl" gekennzeichnet sind.

2. Technologist Vorbereitungen in den BSL3 gehen

1. Geeignete persönliche Schutzausrüstung ist erforderlich, um in der BSL3 Arbeit und umfasst Solid-Front Kleid, Kopfbedeckung, Handschuhe, Überschuhe und ein Beatmungsgerät. Jedes Organ sollte ihre eigene Atemschutz-Plan in Zusammenarbeit festzulegen mit ihrer Institution Industrial Hygiene Officer. In unserem Labor haben wir mehrere Atemschutzgeräte zur Verfügung, darunter Gebläsefiltergeräte (PAPRs) und ausgestattet HEPA-Filter, N95 halbe Gesicht Atemschutzmasken.

3. Vorbereitung der biologischen Sicherheitswerkbank

1. In der BSL3, bereiten die biologische Sicherheitswerkbank (BSC) durch Desinfektion der Oberfläche und platzieren Sie ein Papiertuch mit Desinfektionsmittel ca. 6 cm von der Entlüftung Panel getränkt.
2. Legen Sie einen Abfallbehälter auf der linken Seite, und kleine nephlometer und Vortexer auf der rechten Seite.
3. Impfösen, pipetors und Tipps sind neben dem Papiertuch gelegt.
4. Legen Sie ein Rack mit dem Organismus (in Brühe oder auf festem Medium) und dem McFarland 0,5 Standard auf dem Papiertuch.

4. Die Kalibrierung des Nephelometer

1. Legen Sie eine Kochsalzlösung zwischen Glasperlen Röhre im Nephelometer und stellen Sie das Gerät auf Null mit der Salzlösung zwischen leer.
2. Setzen Sie den McFarland 0,5 Standard im Nephelometer und kalibrieren nach den Anweisungen des Herstellers.

5. Vorbereitung des Inokulums

1. Arbeiten in der BSC, kratzen Kolonien von festen Medium mit einer sterilen Schleife in die entsprechend gekennzeichneten Kochsalzlösung zwischen Glasperlen Röhre, bis eine ≥ 0,5 McFarland Standard erreicht wird.
2. Sichtprüfung der Probe, und im Vergleich zu den McFarland Standard.
3. Vortex Probe für 30-60 Sekunden.
4. Lassen Sie das Inokulum für 15 Minuten absetzen (einen Timer).

6. Inokulation der Mikrotiterplatte

1. Passen Sie das Inokulum mit Kochsalzlösung zwischen Brühe mit dem Nephelometer kalibriert, um die McFarland 0,5 in Stufen 4,1 und 4,2. Dies muss innerhalb von 30 Minuten (je Hersteller-Spezifikationen) abgeschlossen sein.
2. Verwenden Sie ein 200 ul Pipette und eine LONG Aerosol resistent Pipettenspitze zu 100 ul Inokulum aus dem TOP 1 / 3 ^rd der Saline Wulst zwischen Rohr zu entfernen. Beimpfen Middlebrook 7H9 Broth. Langsam Wirbel der beimpften 7H9-Bouillon für 20 Sekunden.
3. Entfernen Sie das AST Mikrotiterplatte von der Hersteller-Paket. NICHT verwenden, wenn das Trockenmittel ist blau oder wenn die Folienverpackung beschädigt ist.
4. Bereiten Sie eine 1:50-Verdünnung Rohr für die spätere Verwendung in der Vorbereitung der 1:50-Verdünnung durch Pipettieren 50 ul sterilem Wasser in einem sterilen Röhrchen.
5. Gießen Sie die Brühe 7H9 Inokulums in einen Trog. AVOID Aerosolerzeugung.
6. Legen Sie die AST-Mikrotiterplatte mit dem Etikett nach oben ein.
7. Verwenden Sie ein 12-Kanal-Pipette auf 100 ul des Inokulums zu jedem Well hinzu.
8. Verdünnungen für Koloniezahlen:
   1. Der 1 / 1 Verdünnung ist von der positiven Kontrolle und (H12) durch Ausstreichen 1 ul-Schleife auf dem 7H10 Platte mit der Aufschrift "1 / 1" vorbereitet.
   2. Die 1 / 50 Verdünnung durch Animpfen einer 1 ul Schleife von der positiven Kontrolle und (H12) und wirbelnden es in das Rohr mit 50 ul Wasser Rohr hergestellt wie oben beschrieben vorbereitet. Streak 1 ul dieser Verdünnung auf die Platte mit der Aufschrift "1 / 50".
9. Inoculate die Reinheit Platten aus dem Trog durch Pipettieren 50 ul auf eine entsprechend gekennzeichnet Blutagar und 7H10 Platten-und Streifen für die Isolierung.
10. OrtKlebstoff Siegel auf der AST-Mikrotiterplatte. Drücken Sie fest auf jede Vertiefung eine ausreichende Abdichtung mit dem weißen Rücken der Dichtung zu gewährleisten. Vermeiden Sie Knicke.
11. Desinfizieren Sie die Mikrotiterplatte durch Abwischen mit einem Papiertuch mit einem tuberkuloziden Desinfektionsmittel und Ort Mikrotiterplatte in eine Plastiktüte und schließen mit einer Wärme-Siegel oder Tape eingelegt.
    1. Der Plastikbeutel dient als sekundäre Behälter, um sicherzustellen, dass alle Brühe enthalten ist, sollte es ein Leck oder spill der primären Platte sein.

7. Desinfektion von Materialien und biologischen Sicherheitswerkbank

1. Um zu vermeiden, produzieren Aerosole, legen Sie eine weitere Rinne auf der Oberseite des Troges geimpft, bevor Sie ihn sanft in die verwerfen Container.
2. Desinfizieren Sie alle Materialien, einschließlich nephlometer, Vortexer, Platten, Rohre, etc. durch Abwischen mit einem tuberkuloziden Desinfektionsmittel und warten den richtigen Zeitpunkt der Desinfektion gemäß den Anweisungen des Herstellers zu versichern, bevor Sie aus dem BSC. Zum Beispiel erfordert ProSpray, tuberkuloziden Desinfektionsmittel verwenden wir, 15 Minuten, um zu töten Mykobakterien.
3. Legen Sie die zu verwerfen Behälter an einem biohazard Tasche und Dichtung vor dem Autoklavieren.

8. Incubation

1. Die Platten sollten mit den Medien inkubiert unten und darauf zu achten, damit kein Spritzwasser oder eine Flüssigkeit sein.
2. Inkubieren Sie die AST Mikrotiterplatte Platte, 7H10 und Blut-Agar-Platten in einem 35-37 ° C Inkubator mit 5-10% CO ₂ mit 5-10% CO ₂ in die BSL2 Labor.
   1. In unserem Labor ist dies akzeptabel, da die Platte ist gut verschlossen und in einem verschlossenen Plastikbeutel.
3. Nicht mehr als 2 Mikrotiterplatten AST Platten sollten in den Inkubator nach den Anweisungen des Herstellers gestapelt werden.

9. Repräsentative Ergebnisse

Die Interpretation der Ergebnisse:

Sealed AST Mikrotiterplatten lesen kann manuell über einen Spiegel als Hilfsmittel oder mit einem automatisierten Platten-Lesegerät wie dem Vizion (TREK Diagnostics) werden. Die Platten können so bald wie 7 Tage nach der Impfung untersucht werden. Untersuchen Sie das Wachstum Kontrollvertiefungen in Positionen H11 und H12, um festzustellen, ob sie positiv (dh, eine Anzahlung von Zellen am Boden des Brunnens) sind. Wenn das Wachstum Kontrollvertiefungen nicht positiv sind, inkubieren der Platte und in regelmäßigen Abständen erneut zu prüfen (zB, Tag 10, Tag 14), bis das Wachstum Kontrollvertiefungen positiv sind.

1. Spiegel zu lesen:
   1. Ort versiegelt AST Mikrotiterplatte auf die Plattform;
   2. Lesen Wachstum Kontrollvertiefungen nach 7 Tagen Inkubation, wenn dieser negativ ist, inkubieren AST Mikrotiterplatte;
   3. Wenn das Wachstum steuert akzeptabel sind, dann lesen Sie das Medikament enthaltenden Brunnen. Für für jedes Medikament, notieren Sie die erste Verdünnung, dass kein Wachstum wurde durch den Vergleich der Drogen-Brunnen mit dem Wachstum zu kontrollieren.
   4. Das Wachstum wird als Trübung oder als Ablagerung von Zellen am Boden eines Brunnens.
2. Instrument Lesen Sie: Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers, die folgenden Anweisungen sind ein Beispiel dafür, wie die Lesart mit dem Vizion Plattform durchgeführt werden:
   1. Log in.
   2. Verwenden Sie "MYCOTB" AST Platte Software.
   3. Ort versiegelt Platte mit dem Barcode mit Blick auf den Benutzer. Das Wachstum wird als Trübung oder als Ablagerung von Zellen am Boden eines Brunnens.
   4. Lesen Sie das Wachstum kontrolliert, wenn dieser negativ ist, inkubieren AST Mikrotiterplatte, wenn positive lesen Sie die Platte durch Berühren des Bildschirms mit dem ersten und jedes Medikament, das nicht angezeigt wird Wachstum.

Lesen Reinheit Platten. Das Blut-Agar-Platte sollte kein Wachstum nach 48 Stunden zeigen und die 7H10 Reinheit Platte sollte konfluenten Wachstum eines Organismus Typ haben. Falls kontaminiert, muss das AST Mikrotiter-Test von einer Reinkultur wiederholt werden.

Berechnen Koloniezahlen von der positiven Kontrolle auch in der folgenden Tabelle:

Koloniezahl Key

# Kolonien auf der Platte mit der Aufschrift "1 / 1" gezählt	# Kolonien auf der Platte mit der Aufschrift "1 / 50" gezählt	Inokulum Koloniezahl (KBE / ml)
<50	0	<5 X 10 4
50-100	0-2	5 X 04 bis 1 Oktober X 10 5
> 100	≤ 10	1 X 05 bis 5 Oktober X 10 5
> 100	> 10	> 5 X 10 5

Es kann mit Para-Aminosalicylsäure werden nachgestellte in einigen Stämmen von Mycobacterium Tuberkulosesis. Dies können Sie an allen Brunnen, Pellets und mit dem ersten gut, dass die gleiche Größe Pellet wurde als die nächste Verdünnung als Endpunkt interpretiert werden. Widerstand ist selten mit dieser Droge.

Abbildung 1. Repräsentative Ergebnisse mit dem MYCOTB Platte.

Drug Abkürzung	Medikament	MIC μ / ml
OFL	Ofloxacin	16
MXF	Moxifloxacin	8
RIF	Rifampicin	> 16
AMI	Amikacin	0,5
STR	Streptomycin	16
RFB	Rifabutin	8
PAS	p-Aminosalicylsäure	≤ 0,5
ETH	Ethionamid	5
CYC	Cycloserin	4
INH	Isoniazid	2
KAN	Kanamycin	1,2
EMB	Ethambutol	4,0

Diskussion

Ein Beispiel für eine AST Mikrotiterplatte, dass ein positives Wachstum steuert hat, ist in Abbildung 1 dargestellt, und der Endpunkt MIC (ug / ml) für jedes Medikament ist eingekreist. Eine Studie in unserem Labor durchgeführt angedeutet, dass die AST Mikrotiterplatte Methode entspricht dem Goldstandard Agar Anteil Methode für die Empfindlichkeitsprüfung von Mycobacterium tuberculosis ist. Schnellere Berichterstattung über die Ergebnisse mit Mikrotiter AST Mikrotiterplatte wurde erhalten, wenn die traditionellen Agar Anteil Methode mit der endgültigen Interpretation für AST Mikrotiterplatte und Agar Anteil Methode bei 14 und 21 Tagen hat gegenüber respectively.The AST Mikrotiterplatte den Vorteil des Testens ersten und zweiten Zeile Drogen gleichzeitig mit deren Hilfe verhindert übermäßige Verzögerungen bei resistenten Stämmen können. Die AST Mikrotiterplatte ist auch viel einfacher einzurichten und zu lesen als die APM und sowohl eine manuelle Spiegel und ein halbautomatisches System, wie die VIZION kann verwendet werden, um die Platten gelesen werden. Die Verfügbarkeit eines MIC-Wert für TB-Medikamente Resistenzen können wertvolle neue Informationen für Ärzte in Bezug auf die traditionelle kritische Konzentration Mehrwert zu bieten, vor allem für diejenigen Isolate mit "borderline" Anfälligkeit.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer
AST Mikrotiterplatten und Klebedichtung	TREK Diagnostics, Cleveland Ohio	MYCOTB
McFarland 0,5 Standard-	TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio	E1041
Middlebrook 7H10-Platten	Fischer
Blutagarplatten	Fischer
Sterile Schleifen 1 ul	Fischer
Sterile Schleifen 10 ul	Fischer
Sensititre Saline-Tween Glasperlen Brühe	TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio	27143
7H9 OADC Broth	TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio	T3440
Lange Pipettenspitzen	Fischer
Sterile Tröge	TREK Diagnostics, Cleveland, Ohio
M. tuberculosis	ATCC	27294
Pipeters: 1000, 200, 20 &mgr; l	Fischer
Tipps 1000, 20, 20 ul	Fischer
Multichannel Pipetten	Fischer
Incubator 5-10% CO 2	Fischer
Plastiktüten, klein, CO 2 durchlässig	Poly Plastic, Delano, PA
TB Desinfektionsmittel (So wie ProSpray C-60)	Certol International, Commerce City, CO	PSC60/32
Spiegel Box Reader	Fischer