Überwachung des Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in lebenden Zellen unter Verwendung eines Degron (DGN)-destabilisiert Green Fluorescent Protein (GFP)-basierte Reporter Protein

Zusammenfassung

Eine Methode, um Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in lebenden Zellen zu überwachen beschrieben. A Degron-destabilisierten GFP-(GFP-DGN) und eine stabile GFP-dgnFS Fusionsprotein erzeugt und transduziert in die Zelle mit einem lentiviralen Expressionsvektor. Diese Technik ermöglicht eine stabile GFP-dgn/GFP-dgnFS exprimierenden Zelllinie, in dem Ubiquitin-Proteasom-Aktivität leicht beurteilt werden kann, mit Epifluoreszenz oder Durchflusszytometrie generieren.

Zusammenfassung

Proteasome ist der wichtigste intrazelluläre Organellen in den proteolytischen Abbau von abnormal, fehlgefalteten, beschädigte oder oxidierte Proteine ^{​​1, 2} beteiligt. Wartung der Proteasom-Aktivität wurde in vielen wichtigen zellulären Prozessen beteiligt, wie Zelle Stressantwort ^3, Regulation des Zellzyklus und Zelldifferenzierung ⁴ oder Reaktion des Immunsystems ^5. Die Dysfunktion des Ubiquitin-Proteasom-System hat zu der Entwicklung von Tumoren und neurodegenerativen Krankheiten ^{4, 6} in Verbindung gebracht. Zusätzlich wurde eine Abnahme der Proteasom-Aktivität als Funktion der zellulären Seneszenz und organismal Alterung ^{7, 8, 9, 10} gefunden. Hier präsentieren wir eine Methode, um Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in lebenden Zellen mit einem GFP-dgn Fusionsprotein zu messen. Um Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in lebenden primären Zellen zu überwachen, konstruiert komplementäre DNA, die für ein grün fluoreszierendes Protein (GFP)-dgn Fusionsprotein (GFP-dgn, instabil) und eine Variante Tragen einer Frameshift-Mutation (GFP-dgnFS, stabil ¹¹⁾ werden in lentiviralen Expressionsvektoren insertiert. Wir bevorzugen diese Technik gegenüber herkömmlichen Transfektionstechniken weil es eine sehr hohe Transfektionseffizienz garantiert unabhängig von dem Zelltyp oder dem Alter des Spenders. Der Unterschied zwischen der Fluoreszenz, die von GFP-dgnFS (stabilen) Protein und dem destabilisierten Protein (GFP-dgn) in Abwesenheit oder Gegenwart von Proteasom-Inhibitor angezeigt kann zum Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in jeder bestimmten Zellstamm abzuschätzen. Diese Unterschiede können durch Epifluoreszenzmikroskopie überwacht werden können oder mittels Durchflusszytometrie gemessen werden.

Protokoll

Ein. Plasmidkonstruktion

1. Um individuelle Oligonucleotide Codierung für dgn (ACKNWFSSLSHFVIHL ¹¹⁾ und zum dgnFS (HARTGSLACPTSSSICE) und ligieren es in den pEGFP-C1-Vektor, um die Fusion des GFP mit dgn ​​/ dgnFS (Abbildung 1) zu erhalten.
2. Amplify die kodierende Sequenz für GFP-DGN-und GFP-dgnFS mittels PCR nach dem Protokoll des pENTR Directional TOPO Cloning Kit und fahren mit dem pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit (Abbildung 6).

2. Virusproduktion

1. Am Tag vor der Transfektion (Tag 1) Samen aus HEK 293FT Zellen in einem T75-Flaschen, so daß sie 90-95% konfluent auf dem Tag der Transfektion sein wird.
2. Am Tag der Transfektion zu verdünnen 36 ul Lipofectamin 2000 Reagent in 1,5 ml DMEM ohne Serum und Antibiotika in einem 15 ml Falcon. Verwenden Sie einen anderen 15 ml Falcon und verdünnen 3 ug pLenti6/V5 Durchführung der komplementäre DNA-Konstrukt entweder für GFP -DGN-oder GFP-dgnFS, 2,5 ug Umschlag kodierenden Plasmid pMD2.G und 7,5 ug Vektor-Rückgrat psPAX2 in 1,5 ml DMEM ohne Serum und Antibiotika. Nach 5 min die verdünnte DNA wird mit der verdünnten Lipofectamin 2000 Reagenz kombiniert.
3. Inkubieren des Gemisches für 20 min bei Raumtemperatur, um die DNA-Lipofectamin-Komplexe zu bilden ermöglichen.
4. Entfernen Sie das Medium HEK 293FT Zellen, ersetzen Sie es sorgfältig von 7 ml Medium (ohne Antibiotika) und fügen Sie die DNA-Lipofectamin Mischung in den Kolben und Rock hin und her für das Mischen (Tag 2). Inkubieren Sie die Kolben über Nacht bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% CO _2-Inkubator.
5. Ändern Medium am nächsten Tag (10 ml Medium ohne Antibiotika-Tag 3).
6. Nach 48 Stunden (Tag 5) Ernte Überstand Zentrifuge bei 300 xg für 5 min bei Raumtemperatur und filtern den Überstand durch einen 0,45 um PVDF-Filter.

Kulturmedium - DMEM (HEK 293FT)

Zelt "> DMEM
10% FBS
0,1 mM MEM NEAA
6 mM L-Glutamin
1 mM MEM Natriumpyruvat
1% Pen-Strep (optional)
500 ug / ml Geneticin (optional)

3. Viruskonzentration durch Polyethylenglykol (PEG) Niederschlag

1. Hinzufügen einem Volumen Polyethylenglykol-Lösung (50 mM Polyethylenglycol, 41 mM NaCl, Autoklaven, pH = 7,2; PEG) bis vier Volumina des Überstandes und inkubiere während 2 Stunden bei 4 ° C. Vorsichtig mischen Sie es alle 20-30 min durch Invertieren.
2. Abzentrifugieren bei 1500 × g für 30 min bei 4 ° C. Ein weißes Pellet sichtbar sein soll.
3. Überstand und zentrifugieren bei 1500 × g für 5 min bei 4 ° C. Saugen Sie den verbleibenden PEG-Lösung.
4. Das Pellet in Medium oder phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) durch Auf-und Abpipettieren und kräftig Vortex für 20 bis 30 Sekunden. Als Richtwert verwenden 500 ul für eine T75-Flasche und Aliquot auf 100 ul. Bewahren Sie das Virus bei -80 ° C.

4. Titrierung von Virus

1. Saatgut aus 5 × 10 ⁴ U2-OS-Zellen in jede Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen am Tag vor der Transfektion.
2. Am Tag der Transfektion entfernen Kulturmedium und ersetzen Sie sie durch 1 ml DMEM mit 8 ug / ml Polybren (Hexadimethrinbromid). Verdünnen der konzentrierten Virusüberstand 1:10 und 1:100 und fügen Sie 1 ul jeweils ein gut. Für höhere Viruskonzentrationen verwenden 1 ul, 5 ul und 10 ul konzentrierter Virusüberstand für die restlichen Brunnen. Eine Vertiefung wird als positive Kontrolle gelassen.
3. Am folgenden Tag ersetzt das Medium durch 2 ml DMEM.
4. Beginnen Sie mit der Auswahl des nächsten Tages. Übernehmen 10 ug / ml Blasticidin auf jedem gut. Ersetzen Sie das Antibiotikum enthaltenden Medium jeden zweiten Tag.
5. Etwa 6-7 Tage nach Beginn der Selektion werden die transduzierten Zellen tot sind. Für die Färbung Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS und decken die Zellen mit Kristallviolett (10 mg / l Kristallviolettin 20% Ethanol) und Inkubation für 5 bis 10 min bei Raumtemperatur. Aspirate Kristallviolett (kann ein paar Mal wiederverwendet werden) und spülen Sie die Vertiefungen zweimal mit ddH ₂ O und trocknen Sie die Platte.
6. Zählen Sie die Kolonien und mehrfach mit 1.000 und der entsprechenden Verdünnung (Abbildung 7). Dieses Verfahren ermöglicht die Transfektion Einheiten (TU) des Virus / ml zu berechnen.

Kulturmedium - DMEM (HFF-2/U2-OS)

DMEM
10% FBS
6 mM L-Glutamin
1% Pen-Strep

5. Transduktion von humanen diploiden Fibroblasten (Diese Prozedur kann für jeden Zelltyp verwendet werden.)

1. Seed von 5 × 10 ⁴ menschliche diploide Fibroblasten (HDF) bis 6-Well-Platten am Tag vor Transduktion.
2. Verwenden eine Multiplizität der Infektion von zwei zusammen mit 8 ug / ml Polybren als Transduktion Enhancer in einer Gesamtmenge von einem Milliliter.
3. Ändern Medium am nächsten Tag.
4. WennDie Zellen werden bei 70-80% der Konfluenz Beginn die Auswahl mit 10 ug / ml Blasticidin. Nach der Auswahl abgeschlossen ist (nicht mehr transfizierten Zellen sterben) die Expansion der Zellen beginnen kann und die Zellen sind bereit für Experimente. Chronische Auswahl mit Blasticidin ermöglicht, eine stabile Zelllinie überexprimierenden GFP-dgn oder GFP-dgnFS Fusionsproteine ​​bereit Proteasomenaktivität messen erzeugen. Dieses Verfahren garantiert einen sehr hohen Transfektionseffizienz unabhängig vom Zelltyp.

6. Messung durch Durchflusszytometrie

1. Seed von 1 × 10 ⁵ Zellen (Buchwert entweder GFP-DGN-oder GFP-dgnFS) am Tag vor dem Experiment.
2. Saures Kontrollzellen 3 Stunden vor der Messung mit der Proteasom-Inhibitor, z. B. 100 g / ml LLnL.
3. Zweimal mit PBS waschen und Ernte der Zellen mit 0,5 ml Trypsin. So stoppen Sie die Trypsinierung verwenden 4,5 ml Kulturmedium und übertragen die Zellen in ein 15 ml Falcon.
4. Spin ter Zellen bei 300 xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
5. Absaugen Medium, werden die Zellen in PBS und drehen sich wieder bei 300 × g für 5 min bei 37 ° C.
6. Absaugen PBS, in 400 ul FACS-Puffer (10 mM Hepes, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl _2, pH = 7,4) resuspendiert und übertragen die Zellen in FACS-Röhrchen.
7. Halten Sie die Zellen auf Eis und messen Proben mittels Durchflusszytometrie. Die Zellen sollten nicht mehr als 30 min bei 4 ° C gelagert werden

7. Repräsentative Ergebnisse

Das GFP-Fusionsprotein dgn trägt eine Sequenz, die das Proteasom und damit das Protein sofort abgebaut abzielt, sie entspricht der Abnahme der GFP-Fluoreszenz-Signal. Die Frameshift Mutante (GFP-dgnFS) eine mutierte Version dieser Sequenz und nicht abgebaut wird durch Proteasom, sie führt die höhere grünen Fluoreszenz. Aus diesen Gründen transduzierten junge HDFs mit erwarteten hohen Proteasom-Aktivität und mit GFP-dgn zeigen eine gering (6% positive Zellen) Fluoreszenzsignal sowohl Durchflusszytometrie Messung und in Epifluoreszenz (2A und B, Abbildung 3). Das gleiche HDFs transduziert mit GFP-dgnFS anzuzeigen 39,7% der positiven Zellen. Die Behandlung der Zellen mit Proteasom-Inhibitor LLnL (N-Acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L-norleucinal) angehoben das Signal zu maximal 62,9% in beiden, GFP-dgn und GFP-dgnFS Zellen (2A und B ).

Um mögliche Rückgang der Proteasom-Aktivität bei älteren menschlichen Hautproben zu bestimmen, wurden Fibroblasten von jungen, mittleren Alters und alte Spendern isoliert mit GFP-DGN-und GFP-dgnFS infiziert, wie oben beschrieben und kultiviert auf die gleiche Passage-Nummer vor der Analyse mittels Durchflusszytometrie Zytometrie. In diesen Experimenten Spender eine klare Zunahme der GFP-Signal zwischen jungen Menschen (11,2 ± 0,88% GFP-positive Zellen) und mittleren Alters (20,4 ± 2,27% GFP-positiven Zellen, P = 0,003) beobachtet wurde, was auf eine Abnahme proteasome Aktivität in Proben aus alten Spendern ⁷ (Abbildung 4). Keine weitere Abnahme der Proteasom-Aktivität wurde in Fibroblasten von ältesten Individuen (Abbildung 4) getrennt beobachtet. Fluoreszenzintensität für GFP-dgnFS betrug in allen Fällen ca. 90% (Daten nicht gezeigt), zeigt einen hohen Transfektionseffizienz für die drei verschiedenen Altersgruppen.

Abbildung 1. Die GFP-DGN-und GFP-dgnFS Sequenz. Angezeigt wird das 3'-Ende des GFP (grün) die multiple Klonierungsstelle des pEGFP-CL1 Vektor (grau) und der DGN / dgnFS Sequenz (rot).

Abbildung 2. Durchflusszytometrie-Analyse der GFP-DGN-und GFP-dgnFS menschliche diploide Fibroblasten. A. Young humane Vorhautfibroblasten (HFF-2) wurden mit lentivirale Vektoren, die ein grün fluoreszierendes Protein infiziert (GFP)-Gen oder ein dgn GFP-dgnFS (Frameshift) zu konstruieren, wie angegeben und analysiert GFP-Fluoreszenz unter Verwendung von Durchflusszytometrie (FACS Canto II, Becton Dickinson) analysiert. Wo angegeben, wurden die Zellen auch für 3h mit Proteasom-Inhibitor N-Acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L-norleucinal (LLnL) behandelt. Nichtinfizierten Zellen wurden als Kontrolle verwendet. Experimente wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt. B. Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Die Zahlen spiegeln die Menge an GFP-positiven Zellen. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 3. Fluoreszenzmikroskopie Analyse von GFP-dgn und GFP-dgnFS HFF-2-Zellen. Junge HFF-2 wurden wie in Abbildung 2 behandelt. Um 9 Tage nach der Infektion wurden die Zellen visualized durch Fluoreszenz und Phasenkontrast-Mikroskopie.

Abbildung 4. Änderungen im Proteasom-Aktivität in menschlichen Hautalterung. Die menschlichen Vorhautfibroblasten aus neun verschiedenen Spendern in den angegebenen Altersgruppen wurden minimal erweitert und infiziert mit lentiviralen Konstrukte Codierung für GFP-dgn. Um 9 Tage nach der Infektion wurden die Zellen durchflusszytometrisch analysiert. Die Daten wurden auf drei Proben pro Altersgruppe in Duplikaten (± SE) erhalten.

Abbildung 5. Experimentellen Ansatz. Custom-Oligonukleotide für die DGN und dgnFS in den pEGFP-C1-Vektor kloniert und Viren werden für jedes Konstrukt mit HEK 293FT Zellen produziert. Der Titer der Viren bestimmt. Zellen mit dem Virus transduziert und erweitert. Nach der bevorzugte Behandlung die Zellen werden analysiertfür Fluoreszenzsignal durch Durchflusszytometrie.

Abbildung 6. Karte von Plenti GFP-dgn. Die Karte des pLenti6/V5-DEST Vektor, der GFP-dgn Sequenz angezeigt wird. Abkürzungen: PCMV (CMV-Promotor), GFP-dgn (Sequenz von GFP-DGN), P _SV40 (SV40 early Promotor), EM7 (EM7 Promotor), Blasticidin (Blasticidin Resistenzgen), ΔU3 / 3'LTR (3'LTR mit deletierte U3-Region), SV40 pA (SV40 Polyadenylierungssignal), Ampicillin (Ampicillin-Resistenz-Gen), pUC ori (pUC), PRSV / 5'LTR (RSV / 5'LTR Hybrid-Promotor), Ψ (HIV-1 Ψ Verpackungssignal ), RRE (HIV-1-Rev-Response-Element).

Abbildung 7. U2-OS Titerung Platte. U2-OS wurden auf einer 6-well-Platte ausgesät und transfiziert mit verschiedenen Virus-Konzentrationen (Verdünnung von 1/100 und 1/10, 1, 5 und 10 ul der Zusammenarbeitncentrated viralen Überstand). Ein gut als transfizierten Kontrolle (NT) eingesetzt. Nach 6-7 Tagen wurden die Zellen mit Kristallviolett angefärbt und luftgetrocknet.

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Diskussion

Die erste Veröffentlichung mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) als Reporter Substrat für Ubiquitin-Proteasom-Aktivität wurde in 2000 ¹² veröffentlicht. Seitdem hat GFP zu einem gemeinsamen Instrument zur zellulären Aktivitäten, insbesondere das Ubiquitin-Proteasom-Prozess zu visualisieren. Um Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in vivo zu überwachen ein transgenes Mausmodell mit einem GFP-basierte Reporter wurde ¹³ eingeführt. Zusätzliche in vivo Forschung etabliert ander...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer
pEGFP-C1 Vektor	BD Bioscience Clontech	6084-1
pENTR Directional TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K2400-20
pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit	Invitrogen	V496-10
Lipofectamine 2000 Reagent	Invitrogen	11668019
DMEM	Sigma	D5546
PVDF-Filter (Rotilabo-Spritzenfilter)	Roth	P667.1
Polyethylenglykol	Sigma	P2139
NaCl	Merck	1.06404.1000
Dulbeccos Phosphat-gepufferte Saline 1x (PBS)	Invitrogen	14190
Hexadimethrinbromid	Sigma	10,768-9
Blasticidin	Invitrogen	R21001
Kristallviolett	Sigma	C3886
FACS-Röhrchen	BD Biosciences
Penicillin Streptomycin (Pen-Strep)	Invitrogen	15140130
L-Glutamin 200 mM	Invitrogen	25030024
Fötales Rinderserum (FBS)	Biochrom AG	S0115
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x	Invitrogen	11140035
MEM Natriumpyruvat 100 mM	Invitrogen	11360039
D-(+)-Glucose (45%)	Sigma	G8769
Geneticin	Invitrogen	11811023
CaCl2	Merck	C5080
Hepes	Sigma	H3375
Trypsin-EDTA (0,05%)	Invitrogen	25300054