Monitoraggio del sistema ubiquitina-proteasoma attività nelle cellule viventi Utilizzando una degron (dgn)-destabilizzato proteina verde fluorescente (GFP) a base di proteine ​​Reporter

Riepilogo

Un metodo per monitorare l'attività ubiquitina-proteasoma in cellule viventi è descritto. Un degron-destabilizzato GFP-(GFP-dgn) e di una stalla GFP-dgnFS proteina di fusione vengono generati e trasdotto nella cella utilizzando un vettore lentivirale espressione. Questa tecnica permette di generare una linea cellulare stabile GFP-dgn/GFP-dgnFS esprimendo in cui ubiquitina-proteasoma attività può essere facilmente valutata usando epifluorescenza o citometria a flusso.

Abstract

Proteasoma è l'organello intracellulare principale coinvolto nella degradazione proteolitica della anormali, proteine ​​misfolded, danneggiati o ossidati ^{1, 2.} Manutenzione delle attività del proteasoma è stato coinvolto in molti processi cellulari chiave, come risposta allo stress cellulare ^3, regolazione del ciclo cellulare e la differenziazione cellulare ⁴ o nella risposta del sistema immunitario ^5. La disfunzione del sistema ubiquitina-proteasoma è stata correlata allo sviluppo di tumori e malattie neurodegenerative ^{4, 6.} Inoltre, una diminuzione dell'attività del proteasoma trovato è una caratteristica della senescenza cellulare e organismal invecchiamento ^{7, 8, 9, 10.} Qui, vi presentiamo un metodo per misurare ubiquitina-proteasoma attività in cellule viventi usando un GFP-DGN proteina di fusione. Per poter controllare ubiquitina-proteasoma attività nelle cellule viventi primarie, DNA complementare costruisce codificante per una proteina fluorescente verde (GFP)-DGN proteina di fusione (GFP-DGN, instabile) e una variante portando una mutazione frameshift (GFP-dgnFS, stabile ¹¹⁾ sono inseriti in vettori di espressione lentivirali. Preferiamo questa tecnica rispetto alle tecniche tradizionali di transfezione in quanto garantisce una elevata efficienza di trasfezione molto indipendente dal tipo di cellula o l'età del donatore. La differenza tra fluorescenza visualizzata dal GFP-dgnFS (stabile) proteine ​​e la proteina destabilizzato (GFP-dgn) in assenza o presenza di inibitori del proteasoma può essere usato per stimare ubiquitina-proteasoma attività in ciascun ceppo cella particolare. Queste differenze possono essere monitorati mediante microscopia in epifluorescenza o può essere misurata mediante citometria a flusso.

Protocollo

1. Costruzione plasmide

1. Ordine personalizzato oligo-nucleotidi codifica per DGN (ACKNWFSSLSHFVIHL ¹¹⁾ e per dgnFS (HARTGSLACPTSSSICE) e legare esso nel pEGFP-C1 vettore per ottenere la fusione della GFP con DGN / dgnFS (Figura 1).
2. Amplifica la sequenza codificante per GFP-DGN e GFP-dgnFS mediante PCR secondo il protocollo della clonazione pENTR direzionale Kit TOPO e continuare con il pLenti6/V5 direzionale TOPO Cloning Kit (Figura 6).

2. Virus di produzione

1. Il giorno prima della transfezione (giorno 1) sementi su cellule HEK 293FT in fiasche T75 un modo che sarà 90-95% confluenti il ​​giorno della trasfezione.
2. Il giorno della trasfezione diluire 36 ml di reagente lipofectamina 2000 in 1,5 ml di DMEM senza siero e antibiotici in un falcon 15 ml. Utilizzare un altro ml 15 falco e diluire 3 mcg pLenti6/V5 portando il DNA complementare costrutto sia per GFP -DGN o GFP-dgnFS, 2,5 microgrammi pMD2.G busta codifica plasmide vettore backbone e 7,5 mg psPAX2 in 1,5 ml di DMEM senza siero e antibiotici. Dopo 5 min il DNA diluito viene combinato con il reagente diluito lipofectamina 2000.
3. Incubare la miscela per 20 min a temperatura ambiente per permettere i complessi DNA-lipofectamina di forma.
4. Rimuovere il supporto di cellule HEK 293FT, sostituirlo con attenzione da 7 ml di terreno (senza antibiotici) e aggiungere il DNA-lipofectamina miscela al pallone e la roccia avanti e indietro per la miscelazione (2 ° giorno). Incubare la beuta notte a 37 ° C in un umidificata 5% CO ₂ incubatore.
5. Cambiare media il giorno successivo (10 ml di mezzo senza antibiotici; 3 ° giorno).
6. Dopo 48 ore (giorno 5) supernatante raccolto, centrifugare a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente e filtrare il supernatante attraverso un filtro di PVDF 0,45 micron.

Cultura medio - DMEM (HEK 293FT)

tenda "> DMEM
10% FBS
0,1 mM MEM NEAA
6 mM L-glutammina
1 mM MEM Piruvato di sodio
1% Pen-Strep (opzionale)
500 pg / ml Geneticin (opzionale)

3. Concentrazione Virus polietilene glicole (PEG) Precipitazioni

1. Aggiungere un volume di glicole polietilene soluzione (50 Polietilenglicole mM, 41 mM NaCl, autoclave, pH = 7.2; PEG) a quattro volumi di surnatante e incubare per 2 ore a 4 ° C. Mescolare accuratamente ogni 20-30 minuti per inversione.
2. Centrifugare a 1500 xg per 30 min a 4 ° C. Un pellet bianco deve essere visibile.
3. Aspirare il surnatante e centrifugare nuovamente a 1500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Aspirare la soluzione rimanente PEG.
4. Risospendere il precipitato in media o tampone fosfato salino (PBS) pipettando su e giù e vigorosamente vortex per 20 a 30 secondi. Come linea guida usa 500 pl per una beuta T75 e aliquota a 100 pl. Conservare il virus a -80 ° C.

4. Titolazione di virus

1. Seme su 5 × 10 ⁴ U2-OS cellule in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti il giorno prima della transfezione.
2. Il giorno della trasfezione rimuovere il mezzo di coltura e sostituirla con 1 ml di DMEM contenente 8 mg / ml polibrene (hexadimethrine bromuro). Diluire il virus concentrato surnatante 1:10 e 1:100 e aggiungere 1 ml ciascuna ad un pozzetto. Per concentrazioni superiori virus usare 1 ml, 5 microlitri e 10 pl di surnatante virale concentrato per restanti pozzetti. Un pozzetto viene lasciata come controllo positivo.
3. Il giorno seguente sostituire il mezzo da 2 ml di DMEM.
4. Inizia con la selezione il giorno successivo. Applicare 10 pg / ml di blasticidina ciascun pozzetto. Sostituire il mezzo antibiotico contenente ogni secondo giorno.
5. Circa 6-7 giorni dopo aver iniziato la selezione delle cellule untransduced sono morti. Per la colorazione lavare le cellule tre volte con PBS e coprire le cellule con cristal violetto (10 mg / l cristal violettoin 20% etanolo) e incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente. Aspirare cristallo viola (può essere riutilizzato un paio di volte) e sciacquare i pozzetti due volte con DDH ₂ O e asciugare la piastra.
6. Contare le colonie e moltiplicare con 1.000 e la diluizione corrispondente (Figura 7). Questa procedura permette di calcolare le unità di trasfezione (TU) del virus / ml.

Cultura medio - DMEM (HFF-2/U2-OS)

DMEM
10% FBS
6MM L-glutammina
1% Pen-Strep

5. Trasduzione di fibroblasti diploidi umane (Questa procedura può essere utilizzata per qualsiasi tipo di cellula.)

1. Seed su 5 × 10 ⁴ fibroblasti diploidi umane (HDFS) a 6-pozzetti il giorno prima trasduzione.
2. Utilizzare una molteplicità di infezione di due insieme con 8 mg / ml polibrene trasduzione come enhancer in un totale di un millilitro.
3. Cambiare media il giorno successivo.
4. Quandole cellule sono a 70-80% di confluenza inizio della selezione con 10 pg / ml blasticidina. Dopo la selezione è completa (assenza di cellule non trasfettate più muoiono) l'espansione delle cellule può iniziare e le cellule sono pronte per esperimenti. Selezione cronica con blasticidina permette di generare una linea cellulare stabile overexpressing GFP-DGN o GFP-dgnFS proteine ​​di fusione, pronti per misurare l'attività del proteasoma. Questa procedura garantisce un elevata efficienza di trasfezione molto indipendente dal tipo di cellula.

6. Misura di Citometria a Flusso

1. Seed out 1 × 10 ⁵ cellule (trasporto o GFP-DGN o GFP-dgnFS) il giorno prima dell'esperimento.
2. Trattare cellule di controllo 3 ore prima della misurazione con l'inibitore del proteasoma, ad esempio 100 mg / ml LLNL.
3. Lavare due volte con PBS e raccogliere le cellule con 0,5 ml di tripsina. Per arrestare la tripsinizzazione utilizzare 4,5 ml di mezzo di coltura e trasferire le cellule a 15 ml di una falcon.
4. Spin tegli cellule a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente.
5. Aspirare il terreno, risospendere le cellule in PBS e centrifugare di nuovo a 300 xg per 5 min a 37 ° C.
6. Aspirare il PBS, risospendere in 400 ml di FACS tampone (10 mM Hepes, 140 mM NaCl, 2.5 mM _CaCl2, pH = 7.4) e trasferire le cellule nei tubi FACS.
7. Mantenere le cellule su campioni di ghiaccio e misura mediante citometria a flusso. Le cellule non devono essere conservate per più di 30 minuti a 4 ° C.

7. Risultati rappresentativi

La GFP-dgn proteina di fusione porta una sequenza che si rivolge al proteasoma e quindi la proteina è immediatamente degradato e corrisponde alla riduzione del segnale di fluorescenza GFP. Il frameshift mutante (GFP-dgnFS) porta una versione mutata di questa sequenza e non è degradata da proteasoma, conduce alla maggiore fluorescenza verde. Per queste ragioni, giovane HDFS previsto ad alta attività del proteasoma e trasdotte con GFP-dgn mostrano una bassa (6% cellule positive) sia nel segnale di fluorescenza misurazione del flusso e citometria a epifluorescenza (Figura 2A e B, figura 3). Lo stesso HDFS trasdotte con GFP-dgnFS visualizzare 39,7% di cellule positive. Il trattamento delle cellule con inibitore LLNL proteasoma (N-acetil-L-leucil-L-leucil-L-norleucinal) sollevato il segnale massimo del 62,9% in entrambi, GFP-DGN e GFP-dgnFS cellule (Figura 2A e B ).

Per determinare la possibile perdita di attività del proteasoma in età compresa tra campioni di pelle umana, fibroblasti dermici isolati da donatori giovani, di mezza età e anziani sono stati infettati con GFP-DGN e GFP-dgnFS, come sopra descritto e coltivato al numero stesso passaggio prima dell'analisi con flusso citometria. In questi esperimenti, un netto aumento del segnale GFP tra gli individui giovani (11,2 ± 0,88% GFP-positive cellule) e di mezza età donatori (20,4 ± 2,27% GFP-positive cellule, P = 0.003) è stato osservato, che indica un diminuzione Proteasome attività in campioni ottenuti da donatori di età compresa tra ⁷ (Figura 4). Nessun ulteriore diminuzione proteasoma è stata osservata in fibroblasti isolati da individui più vecchi (Figura 4). Intensità di fluorescenza di GFP-dgnFS era in tutti i casi ~ 90% (dati non mostrati) che indica una elevata efficienza di trasfezione per i tre gruppi di età diverse.

Figura 1. La sequenza GFP-DGN e GFP-dgnFS. Mostrato è il terminale 3 'di GFP (verde) del sito di clonaggio multiplo del vettore pEGFP-CL1 (grigio) e la DGN / dgnFS sequenza (rosso).

Figura 2. Analisi di citometria a flusso di GFP-DGN e GFP-dgnFS fibroblasti diploidi umane. A. fibroblasti prepuzio giovani umani (HFF-2) sono state infettate con vettori lentivirali che trasportano una proteina fluorescente verde (GFP)-DGN o un gene GFP-dgnFS (frameshift) costrutto, come indicato e analizzato per fluorescenza GFP mediante citometria a flusso (FACS Canto II, Becton Dickinson). Dove indicato, le cellule sono state trattate per 3 ore con un inibitore del proteasoma N-acetil-L-leucil-L-leucil-L-norleucinal (LLNL). Cellule non infettate sono state usate come controllo. Esperimenti sono stati eseguiti in triplicato. B. Dati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti. I numeri riflettono la quantità di cellule GFP positive. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 3. Analisi di microscopia a fluorescenza GFP-DGN e GFP-dgnFS HFF-2 cellule. Giovane HFF-2 sono stati trattati come in Figura 2. A 9 giorni dopo l'infezione, le cellule erano visualized di fluorescenza e microscopia a contrasto di fase.

Figura 4. Variazioni attività del proteasoma in invecchiamento della pelle umana. I fibroblasti prepuzio umano di nove donatori diversi gruppi di età indicati, sono stati minimamente ampliato e infettati con costrutti lentivirali codificanti per GFP-DGN. A 9 giorni dopo l'infezione, le cellule sono state analizzate mediante citometria di flusso. I dati sono stati ottenuti su tre campioni per fascia d'età in duplicato (± SE).

Figura 5. Approccio sperimentale. Custom-oligo nucleotidi per DGN e dgnFS sono clonato nel vettore pEGFP-C1 e virus sono prodotti per ogni costrutto utilizzando HEK cellule 293FT. Il titolo del virus è determinata. Cellule sono trasdotte con il virus e ampliato. Dopo il trattamento preferito le cellule vengono analizzateper il segnale di fluorescenza mediante citometria a flusso.

Figura 6. Mappa di Plenti GFP-DGN. La mappa del pLenti6/V5-DEST vettore compresa la GFP-DGN sequenza viene visualizzato. Abbreviazioni: pCMV (promotore CMV), GFP-DGN (sequenza di GFP-dgn), P _SV40 (SV40 promotore precoce), EM7 (EM7 promotore), blasticidina (gene di resistenza blasticidina), ΔU3 / 3'LTR (3'LTR con cancellato U3 regione), SV40 pA (SV40 segnale di poliadenilazione), ampicillina (gene di resistenza alla ampicillina), pUC ori (origine pUC), PRSV / 5'LTR (RSV / 5'LTR promotore ibrido), Ψ (HIV-1 segnale di imballaggio Ψ ), RRE (HIV-1 risposta elemento Rev).

Figura 7. U2-OS piastra titolazione. U2-OS sono state seminate su una piastra da 6 pozzetti e transfettate con concentrazioni virali (diluizione di 1/100 e 1/10, 1, 5 e 10 pl di concentrated surnatante virale). Un pozzetto è stato usato come controllo non trasfettate (NT). Dopo 6-7 giorni, le cellule sono state colorate con violetto cristallo ed essiccato all'aria.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

La prima pubblicazione con la proteina fluorescente verde (GFP) come substrato reporter per ubiquitina-proteasoma attività è stata pubblicata nel 2000 ^12. Da allora, la GFP è diventata uno strumento comune per visualizzare le attività cellulari, in particolare il sistema ubiquitina-proteasoma processo. Per monitorare ubiquitina-proteasoma attività in vivo un modello di topo transgenico con GFP-reporter è stato introdotto ^13. Ulteriori ricerca in vivo stabilito un altro model...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo
pEGFP-C1 Vector	BD Bioscience Clontech	6084-1
pENTR direzionale TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K2400-20
pLenti6/V5 direzionale TOPO Cloning Kit	Invitrogen	V496-10
Lipofectamine 2000 Reagente	Invitrogen	11668019
DMEM	Sigma	D5546
PVDF filtro (Rotilabo-Spritzenfilter)	Roth	P667.1
Polietilene glicole	Sigma	P2139
NaCl	Merck	1.06404.1000
Fosfato Dulbecco Buffered Saline 1x (PBS)	Invitrogen	14190
hexadimethrine bromuro	Sigma	10,768-9
Blasticidina	Invitrogen	R21001
Cristallo viola	Sigma	C3886
FACS tubi	BD Biosciences
Penicillina Streptomicina (Pen-Strep)	Invitrogen	15140130
L-glutammina 200 mM	Invitrogen	25030024
Siero bovino fetale (FBS)	Biochrom AG	S0115
MEM Aminoacidi non essenziali (NEAA) 100x	Invitrogen	11140035
MEM Piruvato di sodio 100 mM	Invitrogen	11360039
D-(+)-glucosio (45%)	Sigma	G8769
Geneticin	Invitrogen	11811023
CaCl2	Merck	C5080
Hepes	Sigma	H3375
Tripsina-EDTA (0,05%)	Invitrogen	25300054