살아있는 세포에서 Ubiquitin-proteasome 활동 모니터링 Degron (dgn) - 불안정 그린 형광 단백질 (GFP) 기반 리포터 단백질을 사용하여

요약

생활 세포의 ubiquitin proteasome - 활동을 모니터링하는 방법이 설명되어 있습니다. degron-불안정 GFP-(GFP-dgn)과 안정적인 GFP-dgnFS 융합 단백질이 생성되고 lentiviral 발현 벡터를 사용하여 셀에 transduced 있습니다. 이 기술은 ubiquitin-proteasome 활동이 쉽게 epifluorescence 또는 유동 세포 계측법을 사용하여 평가 할 수있는 안정적인 GFP-dgn/GFP-dgnFS 표현 세포 라인을 생성 할 수 있습니다.

초록

Proteasome은 이상, misfolded, 손상되었거나 산화 단백질 ^{1, 2의} proteolytic 저하에 관련된 주요 세포 세포 기관입니다. proteasome 활동의 유지 보수는 세포의 스트레스 반응 ^3, 세포주기 조절과 세포 분화 ⁴ 면역 체계의 반응 ^5와 같은 많은 주요 세포 프로세스에 연루되었습니다. ubiquitin proteasome - 시스템의 장애는 종양 및 neurodegenerative 질병 ^{4, 6의} 개발에 관한되었습니다. 또한, proteasome 활동에 감소는 세포 노화 및 노화 organismal ^{7, 8, 9, 10의} 기능으로 발견되었다. 여기, 우리는 GFP-dgn 융합 단백질을 사용하여 생활 세포에 ubiquitin-proteasome 활동을 측정하는 방법을 제시한다. 기본 세포를 생활에 ubiquitin-proteasome 활동을 모니터링 할 수 있도록, 보완 DNA는 (녹색 형광 단백질 (GFP) dgn 융합 단백질에 대한 코딩 구성합니다 GFP-dgn, 불안정)과 frameshift 변이 (GFP-dgnFS, 안정적 ¹¹⁾ 운반 변종 lentiviral 표현 벡터에 삽입되어 있습니다. 이 셀 형식이나 기증자의 나이와 무관 한 매우 높은 transfection 효율을 보장하기 때문에 우리는 기존의 transfection 기술을 통해이 기술을 선호합니다. GFP-dgnFS (안정적) 단백질과 proteasome 억제제의 부재 또는 존재의 불안정 단백질 (GFP-dgn)에 의해 표시되는 형광의 차이점은 각 특정 세포 변형에 ubiquitin-proteasome 활동을 추정하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 차이는 epifluorescence 현미경에 의해 모니터링 될 수 있거나 유동 세포 계측법에 의해 측정 할 수 있습니다.

프로토콜

1. 플라스미드 건설

1. 주문 맞춤 oligo-세포핵의 dgn (ACKNWFSSLSHFVIHL ¹¹⁾ 및 dgnFS (HARTGSLACPTSSSICE)에 대한 인코딩 및 dgn / dgnFS (그림 1)과 함께 GFP의 융합을 얻기 위해 pEGFP-C1 벡터로를 ligate.
2. pENTR 방향 TOPO의 복제 키트의 프로토콜과 pLenti6/V5 방향 TOPO 복제 키트 (그림 6)를 계속에 따라 PCR에 의해 GFP-dgn과 GFP-dgnFS의 코딩 순서를 증폭.

2. 바이러스 제작

1. 그들은 transfection의 날에 90~95%의 합류 될 수 있도록 T75 플라스크에 HEK 293FT 세포에서 transfection 전날 (1 일) 씨.
2. transfection의 날 혈청과 15 ML 매의 항생제없이 DMEM의 1.5 ML에 lipofectamine 2,000 시약 36 μl를 희석. 또 다른 15 ML 매를 사용하여 두 GFP에 대한 보완 DNA가 구축 들고 3 μg pLenti6/V5을 희석 - dgn 또는 GFP-dgnFS, 혈청과 항생제가없는 DMEM의 1.5 ML의 2.5 μg 봉투 인코딩 플라스미드 pMD2.G와 7.5 μg 벡터 백본 psPAX2. 5 분 후에 희석 된 DNA가 희석 lipofectamine 2,000 시약과 결합되어 있습니다.
3. 양식에 DNA-lipofectamine 단지를 허용하도록 실온에서 20 분의 혼합물을 품다.
4. HEK 293FT 세포의 매체를 제거 중 7 ML (항생제 제외)으로 조심스럽게 교체하고 혼합에 대한 술병과 앞뒤로 바위를 (2 일)에 DNA-lipofectamine 혼합물을 추가합니다. humidified 5% CO ₂ 인큐베이터에서 37 ° C에서 밤새 술병을 품다.
5. 중간 다음 날 (; 3 일 항생제없이 10 ML 매체) 변경합니다.
6. 48 시간 후 (5 일) 수확 표면에 뜨는, 룸 온도에서 5 분 300 XG에서 원심 분리기와 0.45 μm PVDF 필터를 통해 표면에 뜨는을 필터링합니다.

문화 매체 - DMEM (HEK 293FT)

십t "> DMEM
10% FBS
0.1 MM 가상 NEAA
6 MM L-글루타민
1 ㎜의 가상 나트륨 Pyruvate
1퍼센트 펜 - 패 혈성 (선택 사항)
500 μg / ML Geneticin (선택 사항)

3. 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 강수량의 바이러스 농도

1. 4의 표면에 뜨는과 2 시간에 품다 ° C. 네 개의 볼륨, 하나의 볼륨 폴리에틸렌 글리콜 솔루션을 (PEG 50 ㎜의 폴리에틸렌 글리콜, 41 MM NaCl, 압력솥, 산도 = 7.2)를 추가 조심스럽게 그것을 반전으로 모든 20-30 분 섞는다.
2. 4 ° C.에 30 분에 1,500 XG에 스핀 다운 흰색 펠렛이 표시됩니다.
3. 표면에 뜨는을 대기음, 4 ° C.에서 5 분 1500 XG에서 다시 원심 분리기 나머지 PEG 솔루션을 기음.
4. 중간하거나 펠렛을 Resuspend 인산염 버퍼 생리 (PBS)를 pipetting 아래에서 20 명 정도로 30 초 힘차게 소용돌이에 의해. 가이드 라인은 한 T75 술병과 나누어지는 그 100 μl에 500 μl를 사용하여 있습니다. -80에서 바이러스를 저장 ° C.

4. 바이러스의 Titering

1. 5 아웃 씨 × 6 잘 판 transfection 전날의 각 잘에 10 ⁴ U2-OS 세포.
2. transfection의 날 문화 매체를 제거하고 DMEM 8 μg / ML polybrene (hexadimethrine 브롬화)를 포함하는 1 ML하여 교체하십시오. 농축 바이러스에게 표면에 뜨는 1시 10분과 1:100을 희석 잘 하나에 각각 1 μl를 추가합니다. 높은 바이러스 농도는 1 μl, 5 μl하고 나머지 우물에 집중 바이러스 표면에 뜨는 10 μl를 사용합니다. 하나는 잘 긍정적 인 제어로 남아 있습니다.
3. 다음 날 DMEM 2 ML하여 매체를 교체하십시오.
4. 선택 다음날로 시작합니다. 각도에 10 μg / ML Blasticidin을 적용합니다. 매초마다 하루 항생제 포함하는 매체를 교체하십시오.
5. 약 6-7일 선택을 시작한 후 untransduced 세포가 죽었어요. 착색은 PBS로 세포를 세 번 씻고 크리스탈 바이올렛 (10 MG / L 크리스탈 바이올렛과 ​​세포를 표지20 % 에탄올)과 상온에서 5-10 분에 품다 인치 기음 크리스탈 바이올렛은 (몇 번 재사용 할 수)와 ddH ₂ O와 두 번 우물을 씻어 판을 건조.
6. 식민지을 계산하고, 1,000 해당 희석 (그림 7)에 곱합니다. 이 절차는 바이러스 / ML의 transfection 단위 (TU)를 계산 할 수 있습니다.

문화 매체 - DMEM (HFF-2/U2-OS)

DMEM
10% FBS
6mM L-글루타민
1퍼센트 펜 - 패 혈성

5. 인간 Diploid의 섬유 아세포의 도입 (이 절차는 모든 세포 유형에 대해 사용할 수 있습니다.)

1. 5 아웃 씨 × 10 ⁴ 인간의 diploid의 섬유 아세포 (HDFs) 6 - 잘 접시에 전달 전날.
2. 한 밀리리터의 총 8 μg / 전달 증강 등의 ML의 polybrene과 함께 두 감염의 다중성을 사용합니다.
3. 다음 날 중간 변경합니다.
4. 언제세포가 confluency 시작 10 μg / ML blasticidin로 선택의 70~80% 이용하실 수 있습니다. 선택이 완료되면 (더 이상 untransfected 세포가 죽는 없음) 세포의 확장이 시작 수 있으며, 세포 실험을위한 준비가되어 있습니다. blasticidin과 만성 선택은 안정적인 세포 라인 overexpressing GFP-dgn 또는 GFP-dgnFS 융합 단백질, proteasome 활동을 측정 할 준비를 생성 할 수 있습니다. 이 절차는 셀 타입의 독립적 인 매우 높은 transfection 효율을 보장합니다.

6. 유동 세포 계측법에 의한 측정

1. 1 아웃 씨 × 10 ⁵ 세포 (GFP-dgn 또는 GFP-dgnFS 중 하나를 들고) 실험 전날.
2. 제어 세포에게 사전에 3 시간 proteasome 억제제와 측정, 예를 들어 100 μg / ML의 LLnL을 취급합니다.
3. PBS로 두 번 세척하고 트​​립신의 0.5 ML를 사용하여 세포를 수확. trypsinisation 문화 매체의 4.5 ML을 사용하고 15 ML 팔콘로 셀을 전송 중지합니다.
4. 스핀 t상온에서 5 분 300 XG에서 그는 세포.
5. 37, 매체를 대기음 PBS에있는 세포를 resuspend 5 분 300 XG에서 다시 스핀 다운 ° C.
6. FACS 버퍼 (10 MM의 Hepes, 140 MM NaCl, 2.5 MM CaCl _2, 산도 = 7.4) 400 μl에 resuspend PBS를 대기음 및 FACS 튜브에 세포를 전송합니다.
7. 유동 세포 계측법에 의해 얼음과 측정 샘플에있는 세포를 유지. 셀은 4 ° C.에 이상 30 분에 저장하지 않아야합니다

7. 대표 결과

GFP-dgn 융합 단백질은 proteasome 따라서 단백질이 즉시 타락을 타겟으로하는 시퀀스를 수행, 그것은 GFP 형광 신호의 감소에 해당합니다. frameshift 돌연변이 (GFP-dgnFS)이 순서의 변형 버전을 들고 proteasome에 의해 저하가 아니라 높은 녹색 형광로 연결됩니다. 이러한 이유로, 젊은 예상 높은 proteasome 활동으로 HDFs하고 GFP-DG와 transducedN 유동 세포 계측법 측정 모두와 epifluorescence (그림 2A와 B, 그림 3)의 낮은 (6 % 긍정적 인 세포) 형광 신호를 보여줍니다. 같은 HDFs 긍정적 인 세포의 39.7 %를 표시 GFP-dgnFS와 transduced. proteasome 억제제를 LLnL (N-아세틸-L-leucyl-L-leucyl-L-norleucinal)과 세포의 치료, GFP-dgn과 GFP-dgnFS 세포 (그림 2A와 B 모두에서 62.9 %의 최대 신호를 제기 ).

고령자 인간의 피부 샘플에 proteasome 활동에 가능한 감소를 확인하려면, 젊은 중년 및 이전 기증자로부터 격리 피부 섬유 아세포는 GFP-dgn과 GFP-dgnFS 감염된 위의 설명 및 유동에 의한 분석을하기 전에 동일한 통로 번호로 재배 세포 계측법. 이 실험에서, 젊은 사람들 사이 GFP 신호의 분명한 증가 (11.2 ± 0.88 % GFP 양성 세포)와 중년이 기증자는 (20.4 ± 2.27 % GFP 양성 세포, P = 0.003)을 나타내는, 관찰되었습니다 프로 티어 식물 감소노인 기증자 ⁷ (그림 4)에서 얻은 샘플에 ome 활동. proteasome 활동에 더 감소는 오래된 개인 (그림 4)에서 분리 섬유 아세포에서 관찰되지 않았습니다. GFP-dgnFS에 대한 형광 강도는 모든 경우에 있었어요 ~ 90 % (데이터가 게재되지 않음) 세 가지 다른 연령 그룹에 대한 높은 transfection 효율을 나타냅니다된다.

1 그림. GFP-dgn과 GFP-dgnFS 순서. 표시는 GFP (녹색) pEGFP-CL1 벡터 (회색)과 dgn / dgnFS 순서 (빨간색)의 여러 복제 사이트의 3' 엔드입니다.

그림 2. GFP-dgn과 GFP-dgnFS 인간의 diploid의 섬유 아세포의 유동 세포 계측법 분석. A. 젊은 사람의 포피의 섬유 아세포 (HFF-2)은 녹색 형광 단백질을 운반 lentiviral 벡터에 감염되었다 (GFP) dgn 유전자 또는 GFP-dgnFS (frameshift)는 등의 표시 및 유동 세포 계측법을 (FACS 캔토 II, Becton 디킨슨)를 사용하여 GFP 형광에 대한 분석 구성합니다. 표시 할 경우, 세포는 proteasome 억제제 N-아세틸-L-leucyl-L-leucyl-L-norleucinal (LLnL)로 3h 치료를했다. 감염되지 않은 세포는 제어로 사용되었습니다. 실험은 triplicates에서 수행되었다. B. 데이터 세 독립적 인 실험을 대표합니다. 번호는 GFP 양성 세포의 양을 반영합니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 3. GFP-dgn과 GFP-dgnFS HFF-2 세포의 형광 현미경 분석. HFF-2 영은 그림 2에서와 같이 취급되었다. 감염 후 구일에서 셀은 V 있었다형광과 위상 대비 현미경으로 isualized.

4 그림. 인간의 피부 노화에 proteasome 활동의 변화. 지정된 연령 그룹의 9 개 다른 기증자로부터 인간의 포피의 섬유 아세포는 최소한 확장과 GFP-dgn에 대한 코딩 lentiviral 구조에 감염되었습니다. 감염 후 구일에서, 셀 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. 데이터 중복의 연령 그룹 당 3 샘플 (± SE)에 취득했다.

그림 5. 실험 방법은. dgn와 dgnFS에 대한 사용자 정의 - oligo 세포핵은 pEGFP-C1 벡터로 복제되어 바이러스는 HEK 293FT 세포를 사용하여 각 구조에 대한 생산됩니다. 바이러스의 titer가 결정된다. 세포는 바이러스에 transduced 및 확장하고 있습니다. 선호 치료 후 세포 분석유동 세포 계측법에 의한 형광 신호.

6 그림. pLenti GFP-dgn의지도는. GFP-dgn 시퀀스를 포함하여 pLenti6/V5-DEST 벡터의지도가 표시됩니다. 약어 : PCMV (CMV 프로모터), GFP-dgn (GFP-dgn의 순서), P _SV40 (SV40 초기 발기인), EM7 (EM7 발기인), Blasticidin (Blasticidin 저항 유전자), ΔU3 / 3'LTR (3'LTR로 삭제 U3 지역), SV40 PA (SV40 polyadenylation 신호), 암피실린 (암피실린 저항 유전자), pUC 오라 (pUC 원본), PRSV / 5'LTR (RSV / 5'LTR 하이브리드 발기인), Ψ (HIV-1 Ψ 포장 신호 ), RRE (HIV-1 수익 응답 요소).

그림 7. U2-OS의 titering 판. U2-OS는 6 잘 판에 나가 놓는하고 다른 바이러스 농도 (1백분의 1과 1 / 10의 희석, 1, 5 및 공동 10 μl와 transfected되었습니다) 바이러스 표면에 뜨는을 ncentrated. 하나는 잘 untransfected 제어 (NT)로 사용되었다. 6-7일 후, 전지 크리스탈 바이올렛, 공기 건조 물들했다.

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토론

ubiquitin proteasome - 활동 기자 기판으로 녹색 형광 단백질 (GFP)을 사용하여 첫 번째 출판 2000 ¹² 년에 출판되었다. 그 후, GFP 세포 활동, 특히 ubiquitin-proteasome 프로세스를 시각화 할 수있는 일반적인 도구가되었습니다. 생체 내 ubiquitin-proteasome 활동을 모니터링 할 수 GFP 기반 기자와 유전자 변형 마우스 모델은 ¹³ 도입되었습니다. 생체 연구에 추가이 간행물 ^14에서 ...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호
pEGFP-C1 벡터	BD Bioscience Clontech	6084-1
pENTR 방향 TOPO 복제 키트	Invitrogen	K2400-20
pLenti6/V5 방향 TOPO 복제 키트	Invitrogen	V496-10
Lipofectamine 2000 시약	Invitrogen	11668019
DMEM	시그마	D5546
PVDF 필터 (Rotilabo-Spritzenfilter)	로스	P667.1
폴리에틸렌 글리콜	시그마	P2139
NaCl	머크	1.06404.1000
Dulbecco의 인산이 Sali 버퍼NE 1X (PBS)	Invitrogen	14,190
hexadimethrine 브로마이드	시그마	10,768-9
Blasticidin	Invitrogen	R21001
크리스탈 바이올렛	시그마	C3886
FACS 튜브	BD Biosciences
페니실린의 스트렙토 마이신 (펜 - 패 혈성)	Invitrogen	15140130
L-글루타민 200 MM	Invitrogen	25030024
태아 소 혈청 (FBS)	Biochrom AG	S0115
가상 비 필수 아미노산 (NEAA) 100x	Invitrogen	11140035
가상 나트륨 Pyruvate 100 MM	Invitrogen	11360039
D-(+)-포도당 (45 %)	시그마	G8769
Geneticin	Invitrogen	11811023
CaCl2	머크	C5080
Hepes	시그마	H3375
트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.05 %)	Invitrogen	25300054