Transretinal ERG Recordings aus Maus-Retina: Stäbchen und Zapfen Photomorphosen

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine relativ einfache Methode der transretinal Elektroretinogramm (ERG) Aufnahmen für den Erhalt von Stäbchen und Zapfen Photomorphosen aus intakten Maus Netzhaut. Dieser Ansatz nutzt die Block der synaptischen Übertragung von Photorezeptoren ihre Lichtantworten isolieren und speichert sie über das Feld über den Elektroden isoliert flachen montiert Netzhaut zu liegen.

Zusammenfassung

Es gibt zwei unterschiedliche Klassen von bildgebenden Photorezeptoren in der Retina von Wirbeltieren: Stäbchen und Zapfen. Stäbchen sind in der Lage, einzelne Photonen des Lichts erkennen, während Kegel kontinuierlich arbeiten unter rasch wechselnden hellen Lichtverhältnissen. Die Absorption von Licht durch Stab-und Kegel-spezifischen visuellen Pigmente in den äußeren Segmenten der Photorezeptoren löst eine Phototransduktionskaskade, die sich letztendlich in der Schließung des zyklisch Nukleotid-gesteuerten Kanäle auf der Plasmamembran und Zelle Hyperpolarisation. Dieses Licht-induzierte Veränderung der Membran aktuellen und potenziellen kann als Photoresponse registriert werden, entweder durch klassische Saugelektrode Aufnahmetechnik ^1,2 oder durch Aufnahmen transretinal Elektroretinogramm (ERG) von isolierten Netzhaut mit pharmakologisch blockiert postsynaptische Antwort Komponenten ^3-5. Das letztere Verfahren kann Arzneimittel-zugänglich dauerhafte Aufzeichnungen aus der Maus Photorezeptoren und ist besonders nützlich für die Herstellung von stabilen Photomorphosen from die knappen und fragilen Maus Kegel. Im Falle von Kegeln kann solche Experimente sowohl in dunkeladaptierten folgenden Bedingungen und intensive Beleuchtung, die im wesentlichen alle bleicht Sehpigment durchgeführt werden, um den Prozess der Membran Photoempfindlichkeit Rückgewinnung beim Dunkeladaptation ^6,7 überwachen. In diesem Video zeigen wir, wie Stab-und M / L-Kegel-driven transretinal Aufnahmen aus dunkeladaptierten Maus Netzhaut führen. Rod Aufnahmen durchgeführt werden, indem Retina von Wildtyp (C57Bl / 6) Mäusen. Mäuse, die Stange fehlt Signalisierung ^8. Der Einfachheit halber wird Kegels Aufnahmen aus genetisch modifizierten Stabsatzes Transducin α-Untereinheit-Knockout ^{(- / -} Tα) erhalten werden

Protokoll

1. Herstellung von Elektroden

1. Bereiten Glaselektroden. Wiegen Sie 120 mg Agar und mischen Sie es in 10 ml destilliertem Wasser (letzte Konzentration Agar 1,2%). Schmelzen Sie die Agar-Lösung im heißen Wasserbad. Füllen Sie Glaskapillaren (wir benutzen Word-Presision Instruments TW100-4 Kapillaren mit folgenden Abmessungen: Länge = 100 mm, Da / Di = 1/0.75 mm und innere Volumen = 44 mL) mit dem Agar-Lösung mit Kunststoff-Spritze. Verfestigen des Agar bei Raumtemperatur für 10 min. Somit können bis zu ca. 200 Kapillaren gefüllt (der Rest der Mischung kann Agar bei -4 ° C und wieder verwendet mehrfach gespeichert werden).
2. Schneiden Sie die Kapillaren in zwei Hälften mit einem Diamant-Messer.
3. Weichen Sie die daraus resultierenden Glaselektroden in Maus-Elektrode-Lösung für mindestens 24 Stunden bei 4 ° C Speichern der Elektroden bei 4 ° C und sie über den Zeitraum von 3-4 Monaten.

2. Einrichtung des Tests

1. Dunkel-Anpassung der Maus über Nacht. Verwenden Wildtyp (zum Beispiel C57Bl / 6) Mäuse für Stab-driven transretinal Aufnahmen und T α ^{- / -} Mäuse ohne Stab Signalisierung ⁸ für Kegel transretinal Aufnahmen.
2. Bereiten Sie 1 L Perfusionslösung, 100-ml-Elektrode-Lösung und 20 mL Inkubation Lösung (siehe unten) und Filtern der Perfusionslösung Trog eines Millipore 0,45 um oder 0,22 um-Filter (optional).
3. Kalibrieren der Lichtquelle (505 nm LED oder Halogenlampe optischen Stimulator) mit Hilfe eines Photometers in der Ebene der Netzhaut zu liegen. Im Fall der LED-Lichtquelle, einen optischen Diffusor verwenden, um Licht Einheitlichkeit zu erreichen.
4. Bereiten Sie die Perfusionskammer für Experiment (Kammer-Konstruktionen können abweichen). Unsere Kammer von 3 mm Plexiglas, mit einem Boden von dem Deckel einer kleinen Petrischale aus Kunststoff hergestellt ist und eine aktive Perfusion Volumen von ~ 400 ul (L = 25 mm, B = 8 mm, H ≈ 2 mm). Füllen der unteren Elektrode Raum der Kammer mit der Elektrode, enthaltend 2 mM L-Glutamat und 10 mM BaCl ₂. Die Verwendung von Kunststoff-Schlauch und einer Glaskapillare, eine Verbindung zwischen der Lösung in die untere Elektrode Raum (aus Kunststoff Schlauchverbinder an dem Kammerboden) und dem Elektrodenhalter. Stellen Sie sicher, es gibt keine Blasen in der Elektrode, der Verbindungsschlauch, oder der Elektrodenhalter (säubern die Lösung mit Kunststoff-Spritze falls erforderlich).
5. Montieren der Aufnahmekammer auf der Bühne des Mikroskops (optional: das Mikroskop über eine Anti-Vibrations-Platte zu befestigen, und abgeschirmt in einem Faraday-Käfig um mechanische und elektromagnetische Rauschen zu minimieren). Verbinden der unteren Elektrode Halter mit dem positiven Pol der headstage Differenzverstärkers (zB Warner Instruments DP-311-Verstärker). Center und richten Sie die Kammer unteren Elektrode Eröffnung mit dem Stimulus Lichtfleck. Verbinden Sie die Perfusion Linie auf die Aufnahme Kammer und drehen Sie die Durchblutung an.
6. Blase die Perfusionslösung mit 95% O _2/5% CO ₂ inkubiert, während es in 40 ° C watER Bad. CO ₂ wird der pH der Lösung auf 7,2. Die Lösung fließt aus der Flasche zu der Aufnahmekammer durch die Schwerkraft, die durch einen keramischen Widerstand Wiederaufheizen auf 36-37 ° C Um Wärmeverluste zu verringern, sollte die Heizung möglichst nahe an der Aufnahme Kammer wie möglich, idealerweise auf der Bühne des Mikroskops liegen.
7. Mit einem Durchflussregler die Strömungsrate bis etwa 1 ml / min.
8. Verbinden der oberen Elektrode mit dem zweiten (negativen) Pol der headstage unter Verwendung eines zweiten Elektrodenhalter. Binden die Thermoelementsonde an die obere Elektrode mit einem O-Ring. Stellen Sie sicher, dass die Elektrode und Thermoelement Spitzen nahe beieinander, so dass die Temperaturanzeige so nah an der Mitte der Netzhaut wie möglich getroffen wird. Tauchen der Spitze der oberen Elektrode in der Perfusion und gibt sie in der Mitte der Kammer. Lassen Sie 10-15 Minuten, um grundlegende Stabilisierung.
9. Einstellen der Gleichspannung für die Heizung, so dass die Temperatur der Lösung 36 ist -37 ° C

3. Isolieren Sie die Maus-Retina

1. Unter schwaches rotes Licht, einschläfern die Dunkelheit angepasste Maus mit CO ₂ und Genickbruch. Optional: Erstellen Sie eine Referenzmarke auf jeder Maus Augapfel durch Ausbrennen der meisten dorsalen Punkt der Lederhaut mit einem Brenneisen Stift oder beheizten Sezieren Stift. Alle nachfolgenden Verfahren werden unter Infrarot-Licht mit Infrarot-Bildwandler Passform zu einem Binokular durchgeführt.
2. Präparieren Sie die Augen mit einer gebogenen Schere durch leichten Druck und Dehnung der Haut an den Seiten jedes Auge. Hemisect beide Augäpfel unter IR-Beleuchtung mit Mikroschere oder einer Rasierklinge.
3. Entfernen Sie die Hornhaut und Linse. Entfernen Sie so viel wie möglich des Glaskörpers.
4. Schälen Sie den ersten Netzhaut vom Pigmentepithel Schicht und, wenn nötig, reinigen Sie es mit einer Pinzette, um verbleibende Granulat von Pigmentepithel zu entfernen. Wir sind in der Regel mit ganzen Netzhaut sowohl für die Stäbchen und Zapfen transretinal Aufnahmen. Allerdings, wenn Sie wollen, speziell aus dem dorsalen Teil der Netzhaut, die Maus mehr M / L-Zapfen ⁹ hat aufzuzeichnen, vor dem Schälen die Netzhaut entfernen Sie den ventralen Teil des Augenmuschel mit einer Rasierklinge oder Mikroschere mit dem Brenneisen Marke als Referenz.
5. Legen Sie die zweite hemiseziert Augapfel in einer kleinen Petrischale mit Inkubationslösung und inkubieren Sie die Zubereitung in einem lichtdichten Gehäuse mit reinem Sauerstoff bis zur Verwendung gesättigt. In der Regel unter diesen Bedingungen die zweite Maus Augenmuschel kann für mehrere Stunden bei Raumtemperatur gelagert werden und für Aufnahmen.
6. Mit einem Glas oder Kunststoff Pipette übertragen die isolierte Netzhaut zu einem Rückgang der Perfusionslösung (ca. 300 ul) auf dem Deckel einer Petrischale. Fügen Sie 5-6 kleine Tropfen der Elektrode Lösung mit BaCl ₂ vor, inkubieren der Netzhaut mit BaCl _2. Setzen Sie ein quadratisches Stück (ca. 5x5 mm) der Rückseite Ecke gefettet (wir verwenden Dow Corning 111 Ventil Schmier-und Dichtmittel) Millipore-Filterpapier (0,45 um HArg Typ) mit vorgefertigten Loch in ihrer Mitte (von 2 bis 2,5 mm Durchmesser) auf die gleiche Lösung Tropfen. Mit einer Pinzette die Netzhaut Position auf dem Filterpapier (Photorezeptor Seite nach oben) und drücken Sie den Rändern an der Peripherie zu Flachbild-mounten. Die Netzhaut sollte über der Öffnung in dem Filterpapier zentriert werden.
7. Mit einer Pinzette Das Filterpapier mit der Retina zum Perfusionskammer und legen Sie es über dem Stimulus-Spot ausgerichtet unteren Elektrode Raum. Leicht drücken Sie die gefetteten Kanten des Filterpapiers zu verbinden es mit der Kammer.
8. Legen Sie die obere Elektrode über die Netzhaut Zentrum (leicht berühren Photorezeptorschicht). Die Zentrierung des oberen Elektrode auf der Netzhaut erhöht die Signalamplitude (bis zu ~ 20-40% gegenüber rl es näher an der Retina Rand im Vergleich). Obwohl eine solche Elektrode Lage leicht verzerrt den effektiven Licht Reizintensität Erreichen eines kleinen Sektor der Netzhaut (~ 12-15% der Gesamtfläche), ist es immer noch die optimale Art und Weise der Abgabe des elektronischenzertrat. Das Präparat ist jetzt bereit für transretinal Aufnahmen.

4. Transretinal Recordings

1. Abhängig von Ihrer Mauslinie, Rekord Stab oder M / L-Kegel-driven-Test Flash-Reaktionen zwischen schwach und stark Intensität der kalibrierten 505 nm Licht von LED-Lichtquelle oder optische Stimulator zur Verfügung gestellt. Im Falle unserer LED-Lichtquelle, wird der Blitz-Intensität durch eine Kombination von computerisierte Steuerung von LED-Eingangsspannung, schaltbare Widerstände, und eine Reihe von Neutralfilter (wir verwenden E-Farbe Nr. 211 0,9 ND-Filter von Film Rosco Laboratories gesteuert ) zwischen der LED und der Netzhaut platziert. Die Dauer der LED Probeblitz (20 ms) durch einen Computer gesteuert. Wenn unter Verwendung einer Halogenlampe optischen Stimulator kann Probeblitz Intensität und Wellenlänge durch einen Satz von Neutralfilter und Schmalband-Interferenz-Filter, jeweils gesteuert werden. Testen Blitzdauer kann durch Computer-gesteuerte Jalousien gesteuert werden.
2. Optional: zur Aufrechterhaltung eines effizientenUnterdrückung der Glia-Komponente der Photoreaktion mit BaCl ₂ im Laufe des Tages, ändern Sie die untere Elektrode Lösung gelegentlich (z. B. vor der Prüfung jedes einzelnen Retina) durch Spülen Sie es mit einem Kunststoff-Spritze mit frischer Lösung gefüllt.

5. Repräsentative Ergebnisse

Lösungen

1. Mausretina Perfusionslösung: 112,5 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl _2, 1,2 mM CaCl _2, 10 mM HEPES (pH 7,2), 20 mM NaHCO _{3, 3} mM Na Succinat, 0,5 mM Na Glutamat, 0,02 mM EDTA, und 10 mM Glucose. Darüber hinaus wird die Lösung mit 2 mM L-Glutamat und 10 pM DL-A-4, um Komponenten höherer Ordnung der Photoreaktion ^10,11 Block ergänzt, und mit 0,1% MEM-Vitaminen und Aminosäuren MEM Lösungen (Sigma) bis zu Netzhaut zu verbessern Lebensfähigkeit.
2. Maus-Elektrode Lösung: 140 mM NaCl, 3,6 mM KCl, 2,4 mM MgCl _2, 1,2 mM CaCl _2, 3 mM HEPES (pH 7,4, NaOH). Die Lösung in dem unteren Elementctrode Raum enthält auch 2 mM L-Glutamat in die synaptische Übertragung ¹⁰ und, zusätzlich zu blockieren, 10 mM BaCl _{2 zu} unterdrücken die Gliazellen Komponente des Photoantwort ^3,12.
3. Retina Inkubationslösung: Man löst 272 mg L-15-Medium (Sigma) und 20 mg BSA in 20 ml deionisiertem Wasser. Endgültige L-15 und BSA-Konzentrationen sind 13,6 mg / ml und 1 mg / ml. Der pH-Wert auf 7,4 mit 1 M HCl.

Abbildung 1. Schematische Darstellung der Isolierung der Maus Netzhaut für transretinal ERG-Aufnahmen.

Abbildung 2. Foto des Perfusionskammer und Aufzeichnungs-Elektroden mit ihren Haltern. Die roten Pfeile zeigen die Richtung der Perfusionsfluss.

Abbildung 3. Schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus für transretinal ERG-Aufnahmen. Die roten Pfeile zeigen die Richtung der Perfusionsfluss.

. Abbildung 4 Repräsentative Ergebnisse: aufgezeichnet Familie Maus Stab-driven transretinal Antworten. Photomorphosen waren Low-Pass bei 30 Hz (8-polig Bessel) gefiltert, digitalisiert bei 1 kHz und auf einem Computer zur weiteren Analyse. Gezeigt Spuren stellen Durchschnittswerte von 5-6 Antworten auf dim Lichtintensitäten und 2-3 Antworten auf sättigenden Lichtintensitäten.

Abbildung 5 Repräsentative Ergebnisse:. Aufgezeichnete Familie der Maus Kegel-driven transretinal Antworten. Photomorphosen waren Low-Pass bei 30 Hz (8-polig Bessel) gefiltert, digitalisiert bei 1 kHz und auf einem Computer zur weiteren Analyse. Gezeigt werden Spuren AVERAGES von 5-10 Reaktionen bei schwachen Licht-Intensitäten und 3-5 Antworten auf sättigenden Lichtintensitäten.

Diskussion

Die Methode der Stab-und Kegel-driven transretinal ERG Aufnahmen oben beschrieben wird immer ein mächtiges Werkzeug zur Untersuchung der Funktion der Maus Photorezeptoren sowohl in Wildtyp-und genetisch veränderte Tiere. Zusätzlich zu dem einfachen Charakterisierung von basischen Photoantwort Eigenschaften bietet diese einfache Technik große Resonanz Stabilität bei langen Experimente schließen zu erhalten Retina-Präparaten durchgeführt. Sowohl dunkeladaptierten Stange maximale Reaktion Amplitude und Lichtempfind...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material Name	Typ	Firma	Katalog-Nummer	Kommentar
DL-A-4		Tocris Bioscience	0101
Alle anderen Reagenzien		Sigma-Aldrich
Glaskapillaren		World Precision Instruments	TW100-4	Zur Herstellung von Elektroden
Filterpapier	HArg	Millipore	HABG01300
Photometer		UDT Instruments	S350	Für leichte Kalibrierung
Radiometrische Silicon Sensor		UDT Instruments	221	Für leichte Kalibrierung
Antischwingungstisches		Technische Manufacturing Corporation	TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01	Um mechanische Geräusche zu minimieren
Luftkompressor Panther P 15TC		Werther International	P 15TC	An Antischwingungstisches
Stereomikroskop		LEICA	MZ9.5	Für Maus Auge Dissektion
Infrarot-Bildwandler		BEMeyers	ProwlerTM	Gebunden an Stereomikroskop
Differenzverstärker DP-311		Warner Instruments	DP-311
Axon 1440A Digidata Digitizer	;	Molecular Devices	1440A
Dual Channel 8-Pol-Filter		Krohn-HITE GmbH	3382
Keramische Widerstand		TE Connectivity	CGS SBCHE618RJ	Für Wiedererhitzen des Perfusionslösung
Thermoelement	T	Physitemp Instruments	IT-18
Temperaturwächter		Omega	DPi32	Verbunden mit Thermoelement
LED 505 nm		TT Electronics / Optek Technology	Digi-Key P / N 365-1185-ND	Zum Test Blitze / Bleichen Licht gelten
Kautergriff Stift		Bovie	AA25	Zur Markierung der dorsalen Teilder Maus Augapfels
pCLAMP 10 Elektrophysiologie Datenerfassung und-analyse-Software		Molecular Devices