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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir stellen eine Methode zur Schaffung eines ausgedünnten Schädel kortikale Fenster (TSCW) in einem Mausmodell für In vivo OCT-Bildgebung der Großhirnrinde.

Zusammenfassung

Optische Kohärenztomographie (OCT) ist eine biomedizinische Bildgebung mit hoher räumlicher und zeitlichen Auflösung. Mit seiner minimal-invasive Ansatz Oktober wurde ausgiebig in der Augenheilkunde, Dermatologie und Gastroenterologie 1-3 verwendet. Mit einem ausgedünnten Schädel kortikale Fenster (TSCW) beschäftigen wir Spektral-Domain-OCT (SD-OCT) Modalität als ein Werkzeug zur Abbildung der Hirnrinde in vivo. Üblicherweise ein geöffneter-Schädel für bildgebende wurde verwendet, da es mehr Flexibilität bietet, jedoch eine weniger invasive TSCW Ansatz und ist ein wirksames Mittel für die langfristige Bildgebung in Neuropathologie Studien. Hier präsentieren wir eine Methode zum Erstellen einer TSCW in einem Mausmodell in vivo OCT-Bildgebung der Großhirnrinde.

Einleitung

Seit seiner Einführung in den frühen 1990er Jahren Oktober wurde ausgiebig für biologische Bildgebung von Gewebe Struktur und Funktion 2 verwendet. Oktober erzeugt Querschnittsbilder durch Messen Echo Zeitverzögerung des rückgestreuten Lichts 4 durch Umsetzung mit geringer Kohärenz Lichtquelle mit einem faseroptischen Michelson Interferometer 2,4. SD-OCT, auch als Fourier Domain OCT (FD-OCT) bekannt ist, wurde zum ersten Mal in 1995 5 eingeführt und bietet eine überlegene Bildgebungsmodalität im Vergleich zu herkömmlichen Zeitbereich Oktober (TD-OCT). Im SD-OCT wird der Referenzarm stationär gehalten, was zu einer hohen Geschwindigkeit und ultrahoher Auflösung Bildaufnahme 6-9.

Derzeit haben TSCW Modelle weitgehend in vivo Bildgebung des Gehirns Anwendungen der Zwei-Photonen-Mikroskopie an Stelle eines traditionellen Kraniotomie verwendet. Diese TSCW wurden gleichzeitig mit einer benutzerdefinierten Schädel Platte oder einem Deckglas 10-13 verwendet, um zusätzliche ima bietenGing Stabilität. In unseren Studien haben wir festgestellt, dass Zubehör wie diese sind nicht für die OCT-Bildgebung erforderlich, wenn ein TSCW verwendet wird. Daher ermöglicht das Fehlen eines Schädels Platte oder Glasdeckgläschen für ein breiteres Spektrum von bildgebenden Fenstergröße, wie sie mit dem optischen Strahl interferieren können und verändern OCT-Bilder.

Eine ausgedünnte Schädel Vorbereitung hat sich als in der Bildgebung des Gehirns mit Zwei-Photonen-Mikroskopie 10-13 vorteilhaft. In unseren Experimenten verwenden wir eine SD-OCT-Systems zur Abbildung der Hirnrinde in vivo durch einen TSCW. Unsere eigene SD-OCT-Bildgebung Setup enthält einen breitbandigen, geringer Kohärenz Lichtquelle aus zwei Superlumineszenzdioden (SLD) in 1295 nm mit einer Bandbreite von 97 nm, was zu einer axialen und lateralen Auflösung von 8 um und 20 um zentriert bzw. 14 . Mit unserem optischen Bildgebung Gerät, stellen wir uns, dass die Bildgebung durch eine TSCW großes Potenzial bei der Identifizierung und Visualisierung von Strukturen und Funktionen in der optically dichten Hirngewebe.

Protokoll

Ein. Chirurgische Vorbereitung

  1. Weibliche CD 1 Mäuse im Alter zwischen 6-8 Wochen wurden in unseren Experimenten verwendet.
  2. Anästhesieren die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin und Xylazin einer Kombination (80 mg / kg ketamine/10 mg / kg Xylazin). Platzieren Sie die Maus auf einer homöothermen pad die optimale Körpertemperatur bei ~ 37 ° C zu gewährleisten Kontinuierliche Überwachung von Betäubungsmitteln durch Testen Tieres Reflexe (z. B. Einklemmen Fuß mit stumpfen Pinzette) und injizieren mehr Betäubung, wenn nötig.
  3. Schmieren Sie beide Augen mit einem künstlichen Riss Salbe. Entfernen Sie Haare auf der Kopfhaut mit einer Rasierklinge und entfernen restliche Haar mit 70% Alkohol prep Pads. Tragen Sie eine dünne Schicht von Nair Enthaarungscreme auf der Kopfhaut und warten Sie 2 min für sie wirksam wird. Vorsichtig abwischen Nair und die restlichen Haare mit Kochsalzlösung angefeuchteten Wattestäbchen und Alkohol prep Pads. Scalp sollte nun komplett haarlos.
  4. Desinfizieren der Kopfhaut mit einem betadine Tupfer-Stick und reinigen mit 70% Ethanol prep Pads.
  5. Vorsichtig wickeln Sie das Tier in Operationstüchern die optimale Körpertemperatur von ca. 37 ° C sicherzustellen und montieren das Tier auf einem stereotaktischen Rahmen, um den Schädel zu immobilisieren. Tippen Sie auf den Schädel seiner Stabilität zu gewährleisten. Eine Liste der verwendeten Materialien sind in Tabelle 1 bereitgestellt.

2. Verdünnt-skull Kortikale Fenster Vorbereitung

  1. Starten Sie den Einschnitt an der Mittellinie zwischen den Augen. Weiterhin kaudal zur Mittellinie zwischen den Ohren. Teil der Haut mit einer Pinzette.
  2. Suchen Sie den Bereich unter einem Binokular verdünnt und entfernen Sie vorsichtig die Blende mit einer Pinzette. Trocknen Sie die Schädel mit sterilen Wattestäbchen, bevor Sie die ausgedünnt kortikale Fenster. In unseren Experimenten haben wir eine 4 × 4 mm ausgedünnt kranialen Fensters ~ 1 mm posterior und lateral bregma.
  3. Beginnen Ausdünnung den Schädel mit einem runden Hartmetallfräser mit Bohrer 0,75 mm in einem chirurgischen Bohrmaschine mit Licht Kehrbewegung only. Wenden Sie keine direkten Druck auf den Schädel. Stoppen Bohren alle 20-30 Sek. Knochen Staub mit steriler Kochsalzlösung und Wattestäbchen zu entfernen und zu vermeiden Überhitzung des Schädels. Die Kochsalzlösung wird auch in Ableitung der Wärme über den Schädel zu unterstützen.
  4. Sobald die äußere Schicht des kompakten Knochen vollständig entfernt wird die mittlere Schicht Spongiosa sollte jetzt sichtbar. Es könnten leichten Blutungen wie Blutgefäße sind deutlicher in der Spongiosa Schicht. Wechseln Sie zu einem grünen Stein bur und weiter bohren mit besonderer Vorsicht die schwammigen Schicht ist feiner. Der grüne Stein bur löscht weniger Knochen während der Erstellung Ebenheit der gesamten kranialen Fenster. Stoppen Bohren gelegentlich Knochenmehl zu entfernen und den Schädel zu kühlen.
  5. Schließlich ist, wenn der Schädel ist transparenter geworden und Gefäßen am Gehirn jetzt sichtbar, beginnen Polieren des Schädels mit einem Polier-bur. Dies ermöglicht eine genauere Ausdünnung während Glätten den Schädel. Überprüfen Dünne des skull durch leichtes Antippen mit einer Pinzette. Stoppen Polierens, wenn der Schädel wird etwas flexibel.
  6. Der verdünnte kranialen Fenster sollte nun völlig glatt und reflektierend und bereit zum Abbilden (Abbildung 1). Aufgrund der Art der hoch streuenden Gewebe des Gehirns sollte der Schädel auf mindestens 55 um für die optimale Eindringtiefe verdünnbar. Eine Liste der verwendeten Materialien sind in Tabelle 1 bereitgestellt.

3. Optical Coherence Tomography Imaging

  1. Nach der Operation abgeschlossen ist, überprüfen Tieres Atemfrequenz und Reflexe auf ein angemessenes Niveau der Anästhesie sicherzustellen und zu verwalten zusätzliche Betäubung, wenn nötig. Entfernen Tier aus der stereotaktischen Rahmen halten Tier-OP-Abdeckungen gewickelt und Transport Tier zum Imaging-Station.
  2. Vor Bildgebung überprüfen Zeichen für Reflexe und gelten zusätzliche künstliche Tränenflüssigkeit, wenn nötig. Montieren Tier auf den stereotaktischen Rahmen, um den Schädel zu sichern.
  3. Platz Tier unterOktober Kamera und positionieren Sie den TSCW unter dem optischen Strahl (Abbildung 2). Eine Querschnittsansicht des Schädels und Gehirn kann nun visualisiert werden (Abbildung 3).
  4. Die Datenerfassung kann beginnen, sobald Bereich des Interesses befindet. Zum Abbilden Zwecke, verwenden wir Galvo Spiegeln, eine Abbildungsanordnung Fenster mit einer Breite von 4,0 mm zu erreichen. Ein bildgebendes Tiefe von 2 mm wurde mit 6 mW des einfallenden Leistung und einem Brennpunkt 1 mm unterhalb des ausgedünnten Schädels erhalten. Jeder Querschnittsfläche bestand aus 2.048 axiale Scans mit einer Erfassungsrate von 0,14 Sekunden pro Bild.
  5. Volumetrischen Abtastungen des Gehirns kann auch durch Sammeln einer Serie von 2D-Querschnittbild-Bilder unter Verwendung von zwei Sätzen von Galvo Spiegel für xy Abtasten mit dem ersten Spiegel Galvo Abtasten des Strahls in der sagittalen Richtung und der zweiten Spiegel Galvo Abtasten in der koronalen erhalten werden Richtung.

Ergebnisse

Nach dem Erstellen eines ausgedünnten Fenster über der Großhirnrinde das Gefäßsystem sollte nun optisch prominente (Abbildung 1) und wird für einen tieferen Bildtiefe ermöglichen (bis zu 1 mm). Die rechten Cortex wird auf ungefähr 55 um ausgedünnt zu einer normalen Schädels an 140 um (Abbildung 1) gemessen und stellt eine größere optische Klarheit verglichen. Weitere Verdünnung auf 10-15 &mgr; m ist möglich 11 jedoch nicht notwendig, da die Verwendung von Gl...

Diskussion

Imaging mit OCT und einem ausgedünnten Schädel ist eine neuartige bildgebende Technik, die erst seit kurzem 15, 16 untersucht. In unseren Experimenten haben wir gezeigt, die Machbarkeit der SD-OCT-Bildgebung durch eine TSCW in einem Mausmodell in vivo. Aus unseren Ergebnissen wird der Schädel auf ca. 55 um verdünnt und die Eindringtiefe wird bei etwa 1 mm mit Bildauflösung von 8 um und 20 um in der axialen und lateralen Richtung erhalten wurden. In dem Signal-Intensitätsprofil, erhöht OCT-Bild...

Offenlegungen

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der UC Discovery-Proof of Concept Zuschuss und durch die NIH (R00 EB007241) unterstützt. Die Autoren möchte auch Jacqueline Hubbard für ihre Unterstützung danken, die in diesem Experiment.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Materialien Firma Katalog-Nummer Kommentare
Ketamin Phoenix Pharmaceuticals 57319-542-02
Xylazin Akorn, Inc. 139-236
Künstliche Tränen Salbe Rugby 0536-6550-91
Nair Church & Dwight Co., Inc. 4010130
Sterile Alkohol Prep Pad Kendall Healthcare 6818
Wattestäbchen Applikatoren Fisherbrand 23-400-115
Betadine Lösung Swabstick Purdue Produkte 67618-153-01
Saline Solution, 0,9% Phoenix Pharmaceuticals 57319-555-08
Stereotaktischen Rahmen Stoelting
High Speed ​​Surgical Handbohrmaschine Foredom 38.000 rpm
Carbide Rosenbohrer Stoelting 0,75 mm
Dura-Green Stones Shofu Shank: HP
Form: BA1
CompoMaster Coarse & CompoMaster Polisher Shofu Form: Mini-Pt.
SpaceDrapes Braintree Scientific, Inc.

Referenzen

  1. Bizheva, K., Unterhuber, A., Hermann, B., Povazay, B., Sattmann, H., Drexler, W. Imaging ex vivo and in vitro brain morphology in animal models with ultrahigh resolution optical coherence tomography. Journal of Biomedical Optics. 9, 719-724 (2004).
  2. Fujimoto, J. G. Optical coherence tomography for ultrahigh resolution in vivo imaging. Nature Biotechnology. 21, 1361-1367 (2003).
  3. Wantanabe, H., Rajagopalan, U. M., Nakamichi, Y., Igarashi, K. M., Kadono, H., Tanifuji, M. Swept source optical coherence tomography as a tool for real time visualization and localization of electrodes used in electrophysiological studies of brain in vivo. Biomedical Optics Express. 2, 3129-3134 (2011).
  4. Huang, D., Swanson, E. A., Lin, C. P., Schuman, J. S., Stinson, W. G., Chang, W., Hee, M. R., Flottee, T., Gregory, K., Puliafito, C. A., Fujimoto, J. G. Optical coherence tomography. Science. 254, 1178-1181 (1991).
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  22. Gill, A. S., Rajneesh, K. F., Owen, C. M., Yeh, J., Hsu, M., Binder, D. K. Early optical detection of cerebral edema in vivo. J. Neurosurg. 114, 470-477 (2011).

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