Diluído crânio-técnica de janela cortical para<em&gt; Em Vivo</em&gt; Tomografia de coerência óptica

Resumo

Apresenta-se um método de criação de uma janela diluído crânio-cortical (TSCW) em um modelo de rato para In vivo Outubro de imagem do córtex cerebral.

Resumo

Tomografia de coerência óptica (OCT) é uma técnica de imagem biomédica com resolução espacial-temporal. Com a sua abordagem minimamente invasiva outubro tem sido amplamente utilizado em oftalmologia, dermatologia, gastroenterologia e ^1-3. Usando uma janela diluído crânio-cortical (TSCW), empregamos espectral-domínio outubro modalidade (SD-OCT) como uma ferramenta para a imagem do córtex in vivo. Comumente, uma abertura de caveira foi usada para neuroimagem, pois proporciona uma maior versatilidade, no entanto, uma abordagem TSCW é menos invasivo e é um meio eficaz para imagiologia de longa duração em estudos neuropatologia. Aqui, apresentamos um método de criação de um TSCW em um modelo de camundongo in vivo para outubro de imagem do córtex cerebral.

Introdução

Desde a sua introdução no início dos anos 1990, OCT tem sido amplamente utilizado para a imagiologia biológica da estrutura e função do tecido ^2. Outubro gera imagens transversais através da medição de atraso de eco de tempo de ⁴ a luz retrodifundida pela implementação fonte de luz baixa coerência com um interferómetro de Michelson fibra óptica ^2,4. SD-outubro, também conhecido como domínio de Fourier outubro (FD-OCT), foi introduzido pela primeira vez em 1995 ⁵ e oferece uma modalidade de imagem superior em comparação com o tradicional domínio do tempo outubro (TD-OCT). Em SD-OCT, o braço de referência é mantido estacionário, resultando em uma alta velocidade e de aquisição de imagem ultra-alta resolução ^6-9.

Presentemente, os modelos TSCW têm sido largamente utilizados para aplicações em imagiologia do cérebro in vivo de dois fotões microscopia no lugar de uma craniotomia tradicional. Estes TSCW foram usados ​​simultaneamente com uma placa de crânio personalizado ou uma lamínula de vidro ^10-13 para fornecer ima adicionalging estabilidade. Nos nossos estudos, observou-se que os acessórios tais como estes não são necessários para outubro de imagem quando um TSCW é usado. Portanto, a ausência de uma placa de crânio ou lamelas de vidro permite uma gama mais ampla de tamanho de janela de imagem uma vez que podem interferir com o feixe óptico e alterar imagens outubro

A preparação diluída crânio tem provado ser vantajoso em estudos de imagem do cérebro utilizando dois fotões microscopia ^10-13. Em nossos experimentos, nós utilizamos um sistema SD-OCT para a imagem do córtex in vivo através de um TSCW. Nosso costume SD-outubro de configuração de imagem contém uma banda larga, fonte de luz de baixa coerência consiste em dois diodos superluminescent (SLD) centradas em 1295 nm com uma largura de banda de 97 nm, resultando em uma resolução axial e lateral de 8 m e 20 um, respectivamente ¹⁴ . Com o nosso dispositivo de imagem óptica, prevemos que a imagem através de um TSCW tem um grande potencial na identificação e visualização de estruturas e funções no ctecido cerebral ptically denso.

Protocolo

1. Preparação cirúrgico

1. CD 1 fêmea ratos com idades entre 6-8 semanas foram utilizados nas nossas experiências.
2. Anestesiar o rato com uma injecção intraperitoneal de uma combinação de cetamina e xilazina (80 mg / kg ketamine/10 mg / kg de xilazina). Posicione o mouse sobre uma almofada de homeotérmicos para garantir a temperatura corporal ideal em ~ 37 ° C. Monitorar continuamente o nível de anestesia, testando os reflexos do animal (por exemplo, apertando o pé com uma pinça sem corte) e injetar mais anestesia quando necessário.
3. Lubrifique os dois olhos com uma pomada de lágrima artificial. Remova os cabelos no couro cabeludo utilizando uma lâmina de barbear e depilar residual utilizando almofadas de preparação de 70% de álcool. Aplique uma fina camada de Nair creme de depilação sobre o couro cabeludo e esperar 2 min para que ela tenha efeito. Limpe cuidadosamente afastado cabelo Nair e restantes utilizando solução salina umedecido cotonetes e almofadas de preparação de álcool. Couro cabeludo deve agora ser completamente sem pêlos.
4. Desinfetar couro cabeludo usando um betadine vara cotonete e limpe com 7Almofadas prep 0% de etanol.
5. Cuidadosamente enrole o animal em campos cirúrgicos para garantir a temperatura corporal ideal de ~ 37 ° C e montar o animal sobre uma armação estereotáxica para imobilizar o crânio. Bata levemente o crânio para garantir a sua estabilidade. A lista de materiais utilizados são fornecidas na Tabela 1.

2. Diluído crânio-Preparação Janela Cortical

1. Iniciar a incisão na linha média, no ponto entre os olhos. Continuar caudalmente ao ponto da linha média entre as orelhas. Parte da pele com fórceps.
2. Localizar a área a ser diluído sob um microscópio de dissecação e retire cuidadosamente a fáscia usando uma pinça. Seque o crânio com cotonetes estéreis antes de criar a janela diluído cortical. Em nossos experimentos, nós criamos um 4 × 4 mm diluído janela craniana ~ 1 mm posterior e lateral para bregma.
3. Comece diluindo o crânio com uma rodada carbide com tamanho de broca 0,75 milímetros em uma broca cirúrgica com onl leve movimento radicaly. Não aplique pressão directa sobre o crânio. Pare de perfuração cada seg 20-30 para remover o pó de osso utilizando solução salina estéril e cotonetes e para evitar o superaquecimento do crânio. A solução salina irá também ajudar na dissipação do calor em todo o crânio.
4. Uma vez que a camada externa do osso compacto é completamente removido a camada de osso esponjoso do meio deve ser agora visíveis. Pode haver algum sangramento leve como vasos sanguíneos são mais evidentes na camada de osso esponjoso. Mudar para uma broca de pedra verde e continuar a perfuração utilizando cuidado extra como a camada esponjosa é mais delicada. A broca de pedra verde irá remover o material menos osso ao criar uniformidade em toda a janela craniano. Pare a perfuração de vez em quando para remover o pó de osso e para arrefecer o crânio.
5. Finalmente, quando o crânio tornou-se mais transparente e vasculatura do cérebro é agora visível, iniciar o polimento do crânio utilizando uma broca de polimento. Isso permitirá uma mais precisa desbaste enquanto alisando o crânio. Verifique magreza do skull batendo nele com uma pinça. Parar de polimento quando o crânio fica ligeiramente flexível.
6. A janela craniana diluído deve agora ser completamente liso e reflector e prontos para imagiologia (Figura 1). Devido à natureza dos tecidos altamente espalhamento do cérebro, do crânio deve ser diluído até, pelo menos, 55 mm para a penetração de profundidade óptima. A lista de materiais utilizados são fornecidas na Tabela 1.

3. Tomografia de coerência óptica

1. Após a cirurgia está completa, verificar a taxa de animal respiração e reflexos para assegurar um nível adequado de anestesia e administrar anestesia adicional se necessário. Remover animal da armação estereotáxica, manter animais envolvido em panos cirúrgicos, e animais de transporte para a estação de imagiologia.
2. Antes de imagem para verificar os sinais reflexos e aplicar lágrima artificial adicional se necessário. Montar animal sobre a armação estereotáxica para fixar o crânio.
3. Coloque o animal sobOutubro câmara ea posição do TSCW sob o feixe óptico (Figura 2). Uma vista em corte transversal do crânio e no cérebro podem agora ser visualizada (Figura 3).
4. A aquisição de dados pode começar uma vez que área de interesse está localizada. Para os fins de imagem, usamos espelhos Galvo para alcançar uma janela de imagem com uma largura de 4,0 mm. Uma profundidade de 2 mm de imagem foi obtida com 6 mW de potência incidente e um ponto focal 1 mm abaixo do crânio diluído. Cada área transversal consistindo de 2.048 scans axiais com uma taxa de aquisição de 0,14 segundos por imagem.
5. Digitalizações volumétricas do cérebro pode também ser obtido por recolha de uma série de 2D imagens transversais usando dois conjuntos de espelhos para Galvo xy digitalização com o espelho de digitalização Galvo primeiro feixe na direcção sagital e o espelho Galvo segunda análise no coronal direção.

Resultados

Após a criação de uma janela diluído sobre o córtex cerebral a vasculatura agora deve ser visualmente mais proeminente (Figura 1) e vai permitir uma maior profundidade de imagens (até 1 mm). O córtex direito é diluído para cerca de 55 pM quando comparado com um crânio normal, medido a 140 ^ m (Figura 1) e proporciona uma maior clareza óptica. Além disso o desbaste de 10-15 uM é possível ¹¹ não, contudo, necessário que a utilização de folhas de vidro de cober...

Discussão

Imagens com outubro e um diluído crânio-se de uma técnica neuro-imaging romance que só recentemente foram investigadas ^{15, 16.} Em nossos experimentos, demonstramos a viabilidade do SD-outubro de imagem através de um TSCW em um modelo de rato in vivo. A partir dos resultados, o crânio é diluído para cerca de 55 ^ m e a profundidade de penetração é obtida em cerca de 1 mm, com resolução de imagem de 8 um e 20 um na direcção axial e lateral, respectivamente. No perfil de intensidade do si...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materiais	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Cetamina	Phoenix Pharmaceuticals	57319-542-02
Xilazina	Akorn, Inc.	139-236
Pomada Lágrimas artificiais	Rugby	0536-6550-91
Nair	Church & Dwight Co., Inc.	4010130
Estéril Álcool Prep Pad	Kendall Healthcare	6818
Algodão aplicadores com ponta	Fisherbrand	23-400-115
Vareta com tampão da solução Betadine	Purdue Produtos	67618-153-01
Solução Salina 0,9%	Phoenix Pharmaceuticals	57319-555-08
Quadro estereotáxico	Stoelting
Alta velocidade da broca cirúrgica das mãos	Foredom		38.000 rpm
Carbide Rodada Bur	Stoelting		0,75 milímetros
Dura-Green Pedras	Shofu		Shank: HP Shape: BA1
Compomaster Grossa e Compomaster Polisher	Shofu		Forma: Mini-Pt.
SpaceDrapes	Braintree Scientific, Inc.