Direkt Intraventrikuläre Abgabe von Arzneimitteln an die Nager Central Nervous System

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Verfahren, um Medikamente mit dem zentralen Nervensystem Ziel entweder durch Einsetzen eines Katheters oder Durchführen einer Bolus-Injektion in die rechte laterale Ventrikel in Mäusen. Wir konzentrieren uns speziell auf den Transport von Antisense-Oligonukleotiden. Diese Technik ist leicht an andere Medikamente und Ratten.

Zusammenfassung

Aufgrund der Unfähigkeit, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden, müssen bestimmte Medikamente direkt in das Zentralnervensystem (ZNS) geliefert werden. Unser Labor konzentriert sich speziell auf Antisense-Oligonukleotide (ASO), obwohl die Techniken in der hier gezeigten Video kann auch verwendet werden, um eine Vielzahl von anderen Drogen, um das ZNS zu liefern. Antisense-Oligonukleotide (ASO) die Fähigkeit haben, Knockdown sequenzspezifische Ziele ¹ sowie Verschiebung Isoform Verhältnisse von spezifischen Genen ^2. Um weit verbreitete Gen Knockdown oder Spleißen im ZNS von Mäusen zu erreichen, können die ASOs in das Gehirn über zwei separate Wege der Verabreichung, die beide zeigen wir im Video geliefert werden.

Die erste Verwendung Alzet osmotische Pumpen, die mit einem Katheter, die chirurgisch in den lateralen Ventrikel implantiert wird. Dadurch können die ASOs kontinuierlich in das ZNS für eine festgelegte Zeit infundiert werden. Die zweite besteht aus einer einzigen Bolus-Injektion von einem hallogh Konzentration von ASO in den rechten lateralen Ventrikel. Beide Verfahren verwenden die Maus zerebralen Patienten, um die ASO auf das gesamte Gehirn und Rückenmark liefern, obwohl je nach den Bedürfnissen der Studie eine Methode gegenüber der anderen bevorzugt sein.

Einleitung

Einige Medikamente sind nicht in der Lage, die Blut-Hirn-Schranke (BHS) zu überqueren, mit direkter Zentrales Nervensystem (ZNS) Lieferung. Um die BBB umgehen können Medikamente direkt in das Gehirn mit Hilfe der beschriebenen Verfahren geliefert werden. Während unser Labor und das Papier detaillierte hierin Fokus auf Antisense Oligonukleotide (ASO), können auch andere Drogen, wie kleine Moleküle, Antikörper, Gentherapie-Vektoren, etc., Auch durch die exakt gleiche Ansatz geliefert werden.

Bestimmte Proteine ​​spielen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese von neurodegenerativen Erkrankungen. Solche Proteine ​​bilden oft giftige Spezies und sammeln zu Aggregaten, was zu möglichen neuronalen Tod und die anschließende neurologische Erkrankung ^3-4. In dem Bemühen, zu verlangsamen oder sogar stoppen das Fortschreiten dieser Erkrankungen kann eine therapeutische Option sein, das direkt auf und verringern die ursächliche Protein. Allerdings sind diese Proteine ​​oft ubiquitär durch die ZNS, was es schwierig macht e ffectively zielen sie auf einer globalen Skala.

Um Gene während der gesamten CNS Ziel verabreichen wir ASOs in Maus-Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit (CSF) über den lateralen Ventrikel die BHS zu umgehen. Diese spezielle Methode nutzt die Maus ventrikuläre System, das das gesamte Gehirn und Rückenmark umspült, so dass weite Verbreitung der ASOs. Wir verwenden die ASOs 18-20 mer RNA-Moleküle binden, die direkt die Ziel-mRNA-Sequenz sind, und je nach der ASO chemische Modifikationen, entweder A) rekrutieren RNase-H, die mRNA, die zu Knockdown verschlechtern oder B) verschieben alternatives Spleißen ^{1 , 2,16,17.} Es sei darauf hingewiesen, dass mehrere Moleküle für das Klopfen ein spezifisches Protein in vivo, einschließlich shRNA existieren. Da diese Moleküle nicht der Schwerpunkt dieses Artikels, richten wir den Leser auf Artikel bewerten, dass eine bessere Detail Knockdown Wirkmechanismen und die Vorteile / Nachteile der einzelnen ^5-6.

jove_content "> In früheren Arbeiten haben wir ASOs verwendet werden, um an die Protein Superoxiddismutase 1 (SOD1) in einem transgenen Rattenmodell Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ⁷ (Abbildung 4). Mutationen im SOD1 treten bei etwa 2% aller ALS ⁸ Fälle, obwohl es wurde vor kurzem vermutet, dass SOD1 kann eine wichtige Rolle bei sporadischen ALS sowie ^9-10. spielen Durch Verringern insgesamt SOD1 Ebenen in der ALS transgenen Ratte, das Überleben nach Beginn wurde deutlich ⁷ erhöht. Diese wichtigen Daten waren die ersten zu zeigen, dass eine Behandlung ASO im ZNS könnte eine tiefgreifende positive Auswirkungen auf eine neurologische Erkrankung Modell haben. Seitdem ASOs gezielt auf menschliche SOD1 eingegeben haben und absolvierte erfolgreich eine Phase-I-Studie mit menschlichen minimalen Nebenwirkungen (Clnicaltrails.gov NCT01041222) , wie bei der 2012 ^64. Jahrestagung der American Academy of Neurology vorgestellt. Pläne, die ASOs vorwärts bewegen, um II-Studien der Phase sind derzeit im Gange.

Während Targeting SOD1 war die erste Demonstration der Verwendung ASOs eine neurologische Erkrankung zu behandeln, verschiedene andere Studien wurden seitdem durchgeführt Betrachtung der verschiedenen Krankheiten und deren Zielproteine. In 2010 und 2011, dass ASOs Verschiebung Spleißen des Protein Überleben von Motoneuronen 2 (SMN2) wurden in transgenen Mausmodellen der spinalen Muskelatrophie (SMA) verwendet und führte zu einer signifikanten Verbesserung der Krankheitsphänotypen ^11,12. Diese Spleißen ASOs sind jetzt in Phase I der klinischen Studien bei Kindern mit SMA (Clinicaltrails.gov NCT01494701). Darüber hinaus wurde kürzlich gezeigt, dass transiente Verwaltung ASOs gegen die Huntingtin-Gen gezielt in der Lage dramatisch zu retten das Huntington-Mausmodell waren, selbst nachdem die Huntingtin-Protein-Spiegel zu Studienbeginn ¹³ zurückgegeben.

In all diesen Studien wurden ASOs zu den lateralen Ventrikel geliefert gesamten Gen-Spiegel senken oder zu verändern durch Gentechnologiedie gesamte ZNS. Beide osmotische Pumpen und eine einzelne Bolusinjektion kann verwendet werden, um ASOs der CSF zu liefern. Pumpen ermöglichen eine langsame, kontinuierliche Lieferung, während die intracerebroventricular (ICV) Bolus ist eine schnelle, einmalige Injektion. Wir haben diese beiden Methoden mit Erfolg eingesetzt, obwohl wir nicht den direkten Vergleich zwischen Pumpe und Bolus in einem transgenen Linie haben berichtet.

Mit ASOs im ZNS ist eine leistungsfähige Methode, um insgesamt Protein-Ebene und / oder Veränderung Spleißen mehrerer Proteine ​​zu verringern. Während wir ASOs ausschließlich zur Behandlung von neurologischen Erkrankungen, erkennen wir, dass in anderen Bereichen kann auch von dieser Technik profitieren. Solange das Protein von Interesse wird im ZNS exprimiert und das ultimative Ziel ist es, CNS-weiten Veränderungen in der Genexpression, mit ASOs in den gezeigten Techniken zu erreichen, kann sehr nützlich sein.

Protokoll

Das Protokoll wurde von der unten Institutional Animal Care und Verwenden Ausschüsse an der Washington University in St. Louis genehmigt worden und ist in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Leitlinien für die Verwendung von Versuchstieren. Wenn dies Ihr erster Zeit Durchführung Operationen, empfehlen wir bei der JoVE Artikel auf Nagetier Operationen als Einführung vor Beginn ¹⁴ suchen.

ASOs an die Maus CNS sowohl durch osmotischen Pumpe Infusion und einer einzigen ICV Bolus-Injektion geliefert werden. Aus diesem Grund wird das Verfahren ausführlich unten in zwei Segmente unterteilt. Vor-und Nachteile der jeweiligen Methode fällt auf in der Diskussion Abschnitt berührt werden. Die Koordinaten in der verwendeten Protokolle sind für Erwachsene und C57BL6 B6C3 Mäusen. Entsprechende Ratte Koordinaten können in Tabelle 1 zu entnehmen.

ALZET osmotische Pumpe

1. Herstellung von Alzet osmotische Pumpen

1. Legen Sie eine sterile drape und vorsichtig fallen die folgenden Elemente auf, während es dabei nicht direkt anfassen, um die Sterilität zu wahren: osmotische Pumpe (n), Flow Modulator (en), 1 ml sterile Spritze (n), Skalpell, und Abschnitte der Rohrleitung (1 Stück Schlauch = 5 Pumpen). Bei Mäusen, gibt es drei Möglichkeiten für Pumpen: 14 Tage, 28 Tage, und 42 Tage (Abbildung 2A).
2. Die Kappe und füllen sterile 50 ml konische Röhrchen mit 15-20 ml Kochsalzlösung. Bis zu 6 montierten Pumpen können pro konische Röhrchen gegeben werden.
3. Füllen Sie eine p60 Petrischale mit 100% Ethanol. In entsprechenden Anzahl von Kathetern zum Ethanol. Bei Mäusen ist Katheterlänge 2,5 mm.
4. Filter wird jedes ASO in so viele 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen wie nötig. Fügen Sie ein Eppendorf-Röhrchen mit steriler 0,9% iger Kochsalzlösung gefüllt, um den Schlauch mit zu füllen.
5. Wenn alles bereit ist, auf sterile Handschuhe anziehen. Achten Sie darauf, nicht auf alles, was nicht steril zu berühren. Wechseln Sie die Handschuhe nach Bedarf.
6. Für jede ASO verwendet werden, füllen eine 1 ml Spritzeund loadpumps indem Sie die Nadel in das obere Loch und langsam füllen, bis überschüssiges austritt. Weiter, bis alle Pumpen gefüllt sind.
7. Uncap die Fließeigenschaften-Modulatoren und legen in den Pumpen. Schieben Sie den Flow-Modulator fast alle den Weg in, so dass ein 3-5 mm Lücke.
8. Mit dem Skalpell, schneiden jedes Stück Schlauch in 5 gleich große Segmente. Nehmen Sie ein Stück Schlauch, mit steriler Kochsalzlösung unter Verwendung einer 1 ml Spritze zu füllen, und legen Sie die Spitze des Flussregulierungsvorrichtung in ein Ende des Schlauchs. Dann nehmen Sie eine Kanüle aus dem Ethanol und verbinden Sie es mit dem anderen Ende des Schlauchs. Die Pumpe ist nun fertig konfektioniert.
9. Legen Sie das komplett montierte Pumpe in den sterilen 50 ml konischen Röhrchen mit Kochsalzlösung zur Grundierung. Die Grundierung kann für die Pumpen aufzusaugen Fluid in die Arzneimittelabgabe einzuleiten sowie kommen auf die richtige Temperatur. Priming Zeit: 14 Tag Pumpen: 4-6 Std., 28 Tage Pumpen: 40 Stunden, 42 Tage Pumpen: 60 Std. Wenn Sie fertig sind die Montage der Pumpen, krönen die konische Röhrchen und in einer sauberen37 ° C Wasserbad bis zur Operation.

2. Pre-chirurgische Verfahren

1. Wischen Sie alles auf mit 70% Ethanol, um den Bereich zu sterilisieren und hinlegen sterilen Tüchern auf der Tischplatte und stereotax einen sterilen Bereich zu erstellen. Es ist wichtig, aufmerksam zu sein von den sterilen Bereich während der gesamten Operation. Schalten Sie die folgenden Schritte aus: Bead Sterilisator, Heizkissen, Licht, Digitalanzeige und Sauerstoff / Isofluran-System (Abbildung 1).
2. Die folgenden Punkte werden benötigt, wenn dadurch entweder eine einzelne Operation oder eine ganze Serie von Operationen, wie wir routinemäßig tun: 1 Pinzette, 1 gebogene hemostat, 1 Paar kleine Schere, 1 Paar kleinen gebogenen stumpfen Schere, 1 Ratte Knochenfräser , 1 gerades hemostat, 5-0 Nylonnaht, 1 konische Röhrchen mit 70% Ethanol, 1 konischen Rohr mit 95% Ethanol, 1 konischen Rohr mit Jod 1 konische Röhrchen mit Wasserstoffperoxid, Packung sterile Wattestäbchen, 1 Flasche Super Kleber, 1 Tube antibiotische Salbe, 1 Tube AugeSchmiermittel und 1 elektrischen Rasierer.
3. Stecken Sie die Enden der beiden Paare von Scheren, Pinzetten und gekrümmten hemostat in den Wulst Sterilisator für 15 sek. Entfernen und legen in 70% Ethanol. Bei der Durchführung von mehr als einer Operation erneut sterilisieren die Spitzen der Instrumente zwischen den Tieren.
4. Schalten Sie die Isofluran auf 4% und O ₂ zu 0,4 l / min und direkte Gasstrom in die Kammer. Wir haben unsere Isofluran / Sauerstoff-System kalibriert mindestens einmal pro Jahr, um sicherzustellen, dass wir liefern die richtige Menge der Anästhesie. Bewegen Sie die Maus in der Kammer und warten, bis die Atmung deutlich verlangsamt. Entfernen Sie die Maus, und führen Sie eine Zehe Prise, um sicherzustellen, die Maus ist völlig unbewusst.
5. Rasur das Haar von der Spitze der Schulter bis in zwischen den Augen. Wenn die Maus beginnt zu erwachen, platzieren Sie den Mauszeiger in die Kammer zurück, bis die Maus ist wieder völlig unbewusst, Bestätigung mit einer Zehe Prise. Setzen Sie den narkotisierten Maus auf dem stereotax und drücken Sie die Nase Kegel über der Nase.Sei sanft wie die Zähne und Knochen brüchig sind.
6. Richten Sie den Gasstrom zum stereotax halten die Maus narkotisiert. Es ist wichtig, gelegentlich zu überprüfen, um sicherzustellen, dass die Maus ist völlig unbewusst mit einer Zehe Prise während der Operation. Sichern Sie den Kopf mit den Ohr Bars. Wir bevorzugen Nivellierung Ohr Bars, obwohl die lateralen Ventrikel zielen, ist eine perfekt Ebene Schädel nicht notwendig aufgrund der großen Größe der Ventrikel.
7. Schalten Sie die Isofluran Ebene bis hinunter zu 2,0% für die Wartung. Dab Augensalbe auf jedes Auge. Wie in dem Video, legen ein steriles Tuch über die Maus, so dass nur die Basis des Halses und des Kopfes ausgesetzt sind. Dann desinfizieren OP-Bereich durch Abwischen der Oberseite des Kopfes und Halses in einer kreisförmigen Bewegung ab der Mitte der Fläche rasiert und Bewegen nach außen zunächst mit einem Wattestäbchen in 95% Ethanol getaucht, gefolgt von einem Wattestäbchen in Jod getaucht.
8. Wir empfehlen die Verwendung eines Rektalsonde Feedback temperaturgeführte Heizsystem, das sorgt fürdie Temperatur der Maus bleibt auf einem stabilen 37 ° C. Wenn die Temperatur der Maus nimmt während der Operation, kann die postoperative Erholung länger dauern und die daraus resultierende Hypothermie können abweichende Protein-Aktivität führen, einschließlich Hyperphosphorylierung des Mikrotubuli-assoziierten Proteins Tau ^15. Nach dem Einrichten der Heizungsanlage, sind Sie nun bereit, um die Operation zu beginnen.

3. Implantation von Alzet osmotische Pumpe

1. Vor Beginn der Operation auf ein neues Paar sterile Handschuhe anziehen. Dann wird unter Verwendung einer Pinzette und eine kleine Schere, einen Einschnitt in die Haut von der Basis des Halses oberhalb des Tieres Schädel in zwischen den Augen
2. Nehmen Sie die abgestumpften Schere mit der Kurve nach oben und unten gleiten die Haut an der Basis des Halses wieder nach links Hinterbein. Es sollte kein Widerstand. Falls ja, entfernen Sie die Schere und versuchen Sie es erneut. Dies bildet die subkutane Tasche für den osmotischen Pumpe.
3. Wipe der Schädel sauber mit sterilen Wattestäbchen, von einem Wattestäbchen gefolgt eingetaucht in Wasserstoffperoxid zu Bregma verbessern.
4. Wischen Sie die 50 ml konische Röhrchen, die Pumpen enthalten, um die Sterilität der Pumpen zu halten. Sie vorsichtig eine Pumpe aus dem konischen Rohr mit dem gekrümmten hemostat unter besonders vorsichtig, dass die Pumpe nicht berühren die Seiten des konischen Rohrs. Halten Sie den Boden der Pumpe mit einer Zange und drücken Sie den Flussregulierungsvorrichtung in den Rest des Weges mit dem gekrümmten hemostat.
5. Halten Sie die Pumpe, wo die Strömung Modulator und Schläuche erfüllen mit dem gekrümmten hemostat. Legen Sie die Pumpe unter die Haut an der Basis des Halses und schieben Sie es zurück in Richtung der linken Hinterbein soweit es ohne Widerstand zu gehen. Achten Sie darauf, sich nicht die Katheter Touch nichts.
6. Mit dem gekrümmten hemostat, greifen die Kanüle an der Nut, wo die obere trifft den Sockel. Bewegen Sie die Kanüle Fahrer in Position und sichern einrastet.
7. Legen Sie eine einzelne Tropfen Superkleber auf der Basis der Kanüle. Push die Spitze der Kanüle in den Fahrer und Position, so dass der Schlauch gerade nach hinten gerichtet ist.
8. Tippen Sie auf die Katheterspitze Bregma und Null die Koordinaten auf dem Digital-Display. Heben Sie den Katheter und bewegen 1,1 mm seitlich nach rechts und 0,5 mm posterior (Abbildung 2B). Halten Sie die Haut aus dem Weg mit dem gekrümmten hemostat.
9. Fahren Sie mit dem dünnen Metall-Katheter durch den Schädel, bis die Kunststoffkanüle Basis fest gegen die Oberseite des Schädels gedrückt. Die Metall-Katheter kann direkt durch den Schädel getrieben werden in Mäusen aufgrund der relativen dünnen Schädel. Bei Verwendung von Ratten, bohren Sie ein Loch in den Schädel vor dem Absenken des Katheters.
10. Ziehen Sie jede Haut, die Kleber auf sie hat vom Schädel. Mit der Kanüle Fahrer hält die Kanüle / Katheter in Ort, warten 1-2 min bis der Kleber vollständig trocknen.
11. Beim Üben zu Katheterplatzierung beurteilen, injizieren 20-40 ul 2,5% FastGreen Dye durch den Schlauch (Abbildung 2C). Warten Sie 2-3 min, perfuse die Maus mit 1X PBS 0,03% Heparin, und entfernen Sie das Gehirn. Cut koronal am Katheter Website. Wenn der Katheter im Ventrikel platziert wurde, wird der Farbstoff in der Maus Ventrikelsystems (2D) durchströmt zu werden.
12. Halten Sie den Katheter an Ort und Stelle mit dem gekrümmten hemostat gleichzeitiger Erhöhung der Fahrer. Langsam den hemostat um sicherzustellen, dass die Kanüle richtig mit dem Schädel befestigt.
13. Mit einem Wattestäbchen, drücken Sie auf die Oberseite der Kanüle. Montieren Sie die Rattenknochen Clippers in den Wald zwischen dem Ober-und Unterteil der Kanüle. Clip aus der Spitze der Kanüle während noch nach unten drücken mit dem Wattestäbchen. Versuchen Sie, und halten Sie die Clippers Ebene, um nicht die Kanüle aus dem Schädel zu lösen. Wenn die Kanüle kommen unglued hat, schnell wieder Leim und Druck mit einem Wattestäbchen für weitere 2 min.
14. Mit dem 5:0-Faden, regelmäßige hemostat und Pinzetten, Naht entlang der vollständigen Öffnung, die ihr besonderes Augenmerk rechts über die Kanüle. Wir verwenden eine Running horizontal Matratzennaht (siehe Abbildung 5) aufgrund der größeren Einschnitt über den Schädel.
15. Tragen Sie einen Klecks von antibiotische Salbe über den Kopf und Hals. Lösen Sie das Ohr Bars und lösen Sie die Nase Kegel. Entfernen Sie die Maus vom stereotax und auf eine Erwärmung pad für die Verwertung. Überwachen Sie die Mäuse eng für die Dauer der Erholung, in der Regel im Bereich von 10-30 Minuten. Überprüfen Sie alle 2-3 Minuten, bis die Maus beginnt herumlaufen und sich pflegt.

4. Postoperative Pflege

1. Überwachen Sie die Mäuse täglich nach der Operation für die erste Woche.
2. Wenn eine Maus scheint in Schmerzen oder Leiden zu sein, empfehlen wir die Bereitstellung der Maus mit einer 5 mg / kg subkutane Injektion von Carprofen einmal 24 Stunden für bis zu 5 Tage, um die Schmerzen zu lindern.
3. Wenn es scheint, eine Infektion sein, großzügig auftragen antibiotische Salbe auf den Bereich täglich konsultieren behandelnde Tierarzt, um sicherzustellen, dass die Wunde richtig heilt.
4. Rallen, um die 5-0 Nylonnaht 7-10 Tage nach der Operation zu Irritationen aus dem Faden zu verhindern.

5. Ändern oder Entfernen Alzet osmotische Pumpe

Nachdem die Pumpe erfolgt aktiv Infusion ASO, kann es entweder verändert oder vollständig entfernt.

1. Folgen Sie der gleichen pre-Chirurgie Verfahren wie oben mit folgenden Änderungen: 1) brauchen Sie nicht die gekrümmte Schere, gebogen hemostat, Ratte Knochenfräser noch die Digital Display und 2) statt prepping den Kopf der Maus, rasieren und Desinfektion der Rückseite der Maus an der Verbindung der Pumpe und Rohrleitung.
2. Machen Sie eine 1,5 cm Einschnitt auf der Rückseite der Maus, die senkrecht an der Pumpe / Schlauch Kreuzung mit einer Pinzette und Schere. Ziehen Sie die Pumpe aus dem Einschnitt ohne deutlich Ziehen / Schieben auf dem Schlauch, da sie die Katheter kann jar.
3. Um die Pumpe zu entfernen, befestigen Sie den Schlauch etwa 0,5 cm oberhalb des Flussregulierungsvorrichtung und berühren Sie die Sekundenkleber auf den Schlauch to Dichtung es geschlossen. Warten Sie 1-2 Minuten bis der Kleber trocknen. Legen Sie den Schlauch wieder in den Schnitt und Naht geschlossen. Dab antibiotische Salbe auf die Haut vernäht und platzieren Sie den Mauszeiger auf einem beheizten Erholung Pad.
4. Um die Pumpe zu ändern, haben frisch zubereiteten Pumpen bereit zusammen mit einer 10 cm Schüssel mit 95% Ethanol gefüllt. Katheter werden nicht mit den neuen Pumpen benötigt.
5. Schnappen Sie sich eine neue Pumpe mit der Pinzette. Tauchen Sie Ihre Finger in die Ethanol, greifen Sie in die Pumpe, und entsorgen Sie die Flow-Modulator. Dann vorsichtig und langsam abziehen alte Pumpe aus dem Strom-Modulator an den Schlauch und Kanüle. Sobald es ausgeschaltet ist, langsam schieben Sie die neue Pumpe auf, sicherzustellen, dass die Flussregulierungsvorrichtung berührt niemals die außerhalb der Maus.
6. Setzen Sie die neue Pumpe durch den Einschnitt in die subkutane Naht Paket und die Haut. Dab antibiotische Salbe auf die Wunde und Ort Maus auf Erholung Pad.
7. Genau wie bei der Pumpe Implantation, überwachen die Mäuse täglich nach der Operation für p prüfenain / Beschwerden und Infektionen. Gönnen mit Carprofen und Antibiotika als notwendig erachtet wird.

ICV BOLUS

6. Pre-chirurgische Verfahren

1. Folgen Sie dem gleichen Verfahren vor der Operation, wie in Abschnitt 2 oben mit folgenden Änderungen: 1) brauchen Sie nicht gekrümmte Schere, gebogen hemostat oder Ratte Knochenfräser; 2) sauber ein 10 ul Hamilton-Spritze und Nadel mit sterilem Wasser und Last mit ASO und 3) ist, die Spritze und Nadel auf den stereotaktischen Apparat, wo die Kanüle Fahrer befand.

7. Bolus-Injektion von ASO

1. Mit einer Pinzette und eine kleine Schere, einen Einschnitt von der Basis des Halses bis zu zwischen den Augen.
2. Wischen Sie den Schädel sauber mit sterilen Wattestäbchen, von einem Wattestäbchen in Wasserstoffperoxid getaucht, um Bregma verbessern gefolgt.
3. Bewegen Sie die Spritze / Nadel in ein und sichern. Stellen Sie sicher, dass die abgeschrägte Teil der Nadel hinteren Gesichter. Senkendie Nadel bis sie berührt Bregma. Null alle Koordinaten. Bewegen der Nadel seitlich nach rechts 1,0 mm und 0,3 mm vorderen (3A).
4. Langsam fahren die Nadel durch den Schädel nur, bis die Nadel Loch bündig mit der Oberseite des Schädels. Auch dies kann aufgrund der geringen Dicke der Maus Schädel erfolgen. Null die z-Koordinate und Senken der Nadel bis -3,0 mm mit einer Geschwindigkeit von 1 mm / sec (3B). Warten Sie 2-3 Minuten für das Gehirn um die Nadel zu versiegeln.
5. Liefern Sie den vollen 10 ul ASO mit einer Rate von 1 ul pro Sekunde. Warten Sie 2-3 min. Wir verwenden eine 1 ul Infusionsrate für ASOs in die Herzkammer, obwohl diese Rate zwischen verschiedenen Drogen unterscheiden können. Beim Üben für die richtige Platzierung der Nadel durch die Bereitstellung überprüfen 10-20 ul 2,5% FastGreen Dye. Versorgen die Maus mit 1X PBS 0,03% Heparin bald nach Farbstoff Infusion und machen Kranzschnitte des Gehirns, um zu überprüfen, dass der Farbstoff in der ventrikulären System (3C) ist.
6. Halten Sie ein Wattestäbchen gegen den Schädel an der Basis der Nadel. Heben Sie die Nadel mit einer Geschwindigkeit von 1 mm pro Sekunde. Sobald die Nadel außerhalb des Schädels, rollen die Wattestäbchen über die Nadel Loch und halten Sie für 1 min, jede ASO Austreten zu verhindern.
7. Naht der Haut geschlossen, gelten antibiotische Salbe und Ort Maus auf beheizten Erholung Pad. Je nach Konzentration ASO, kann es 20 Minuten, um ein paar Stunden dauern, um sich vollständig zu erholen.
8. Genau wie bei der Pumpe Implantation, überwachen die Mäuse täglich nach der Operation für Schmerzen / Beschwerden und Infektionen zu überprüfen. Gönnen mit Carprofen und Antibiotika als notwendig erachtet wird.

Ergebnisse

Nach Pumpe Infusion oder einer bestimmten Zeit nach dem ICV Bolusinjektion (wir verwenden routinemäßig vier Wochen), ist es wichtig, die Wirksamkeit der ASOs testen. Wir empfehlen, die verschiedenen Regionen des Gehirns und des Rückenmarks zu Ebenen / Isoformen des Zielgens zu messen, sowohl auf mRNA-Ebene mittels quantitativer real-time PCR sowie der Protein-Ebene entweder mit Western Blot oder ELISA (Abbildung 4 Beispiel für eine veröffentlichte ). Dies wird Ihnen helfen zu bestimmen ASO Wirksamkeit in den verschiedenen Regionen CNS. Wenn die Halbwertszeit des Proteins gezielt lang ist, raten wir länger warten nach ASO Infusion, um eine maximale Protein Knockdown oder Spleißen beurteilen.

Es ist auch wichtig, Oligo Verteilung testen. Pump Infusionen in den Vertrieb über sowohl ipsi-und kontralateralen Hemisphäre führen, obwohl eine höhere Konzentration ASO wird häufig in Bereichen gesehen näher an der ventrikulären System ^16. ICV Bolusinjektionen ergeben eine uniform Verteilung von Oligo durch die CNS ^16, obwohl die Effekte können nicht so lange dauern. Wir weisen den Leser auf Southwell et al., Um einen direkten Vergleich der Pumpe gegenüber Bolus Oligo Verteilung ¹⁶ zu sehen.

Wir empfehlen auch die Prüfung mehrerer Dosen sowie die Dauer der Wirkung der ASOs da jeder ASO etwas anders verhalten wird in vivo. ASOs haben in der Regel eine relativ lange Wirkungsdauer, mit Ziel-Knockdown oder Spleißen mehrmonatige Beitrag ASO Lieferung. Darüber hinaus werden einige ASOs besser funktionieren als andere, und einige Gen-Targets wird es leichter sein Knockdown als andere. Aus diesem Grund, wenn Screening die Lead-Kandidaten bestimmen Asos, empfehlen wir die Prüfung mindestens 3-5 ASOs in vivo mit n = 4-6 erwachsenen Mäusen pro ASO als ersten Durchgang.

Wenn mit einem Medikament außer ASOs, wird es auch wichtig sein, um Pilot die ideale Wirkstoffkonzentration, Drogen Wirkdauer und ZNSVerteilung für die jeweilige Verbindung.

Tabelle 1. Chirurgie Koordinaten. Die Koordinaten verwendet, um den rechten lateralen Ventrikel in beiden Mäusen und Ratten traf beim Einsetzen osmotischen Pumpen sowie die Durchführung einer intracerebroventricular (ICV) Bolus. Beide Koordinaten, für Pumpen und ICV Bolus, auf die richtige lateralen Ventrikel. Wir verwenden zwei verschiedene Sätze, weil das sind, was wir die meiste Erfahrung mit und wissen, bieten eine ausgezeichnete Verteilung der ASO.

Abbildung 1. Stereotaktische einrichten. (A) Die notwendige Ausrüstung für die stereotaktische Alzet Pumpe und Bolus Injektion Operationen. I) Glasperlen Sterilisierenr. ii) Digitalanzeige. iii) Stereotaktische Basis mit beweglichen Armen. iv) Temperature Controlled Heizkissen. v) Isofluran / Sauerstoff-System. vi) Isofluran Kammer. (B) Nahaufnahme von der Nase und Ohr Kegel Bars. (C) Zwei Anhänge erforderlich. Links: Spritze / Nadel Halter für ICV Bolusinjektionen. Rechts: Kanüle Treiber für osmotische Pumpe Implantation.

Abbildung 2. Alzet osmotische Pumpe Implantation. (A) Alzet osmotische Pumpe Optionen für Mäuse. . Pumpen 14 Tage (0,25 ul / h), 28 Tage Pumpen (0,25 ul / h), 42 Tage Pumpen (0,15 ul / hr) (B) Koordinaten für Pumpe Implantation von Bregma: -0.5 mm Posterior, -1.1 mm Lateral ( rechts) und -2.5 mm Ventral (Länge des Katheters). (C) Nach der Fahrt den Katheter durch dieSchädel und Verkleben der Kanüle ist Farbstoff durch den Katheter gespült, um die richtige Platzierung des Katheters in den lateralen Ventrikel zu beurteilen. (D) perfundierten Gehirn unmittelbar nach Farbstoff wie in (C) angewendet. Wenn Katheter erfolgreich Ventrikel platziert, wird der Farbstoff in der Maus ventrikulären verteilt werden.

Abbildung 3. Intracerebroventricular Bolus Injection. (A) Koordinaten für Bolus-Injektion von Bregma: +0,3 mm Anterior, -1.0 mm Lateral (rechts) und -3.0 mm Ventral (B) Nach der Fahrt die Nadel durch den Schädel -3.0 mm ventralen, Farbstoff durch die Spritze geschoben wird. auf die richtige Platzierung der Nadel in der späteren Ventrikel. (C) perfundierten Gehirn kurz nach Farbstoff wie in (B) verabreicht bewerten. Wenn Nadel wird erfolgreich in Ventrikels, der platziertFarbstoff wird in der Maus ventrikulären verteilt werden.

Abbildung 4. Antisense Oligonukleotide reduzieren Ratte SOD1 in vivo (Abbildung direkt von Smith et al. ⁷ genommen). (AD) Antisense Oligonukleotide SOD1 SOD oder SOD ^{r146192 verschlüsselt} wurden für 28 Tage in den rechten lateralen Ventrikel von normalen Ratten bei 100 ug / Tag infundiert. (A) Endogene SOD1-mRNA-Spiegel von Gehirn und Rückenmark durch qRT-PCR gemessen. ( B) SOD1 und a-Tubulin-Protein-Spiegel nach Infusion ASO. (C und D) Proteinspiegel für Tubulin und SOD1 quantifiziert verschiedenen Regionen des Gehirns nach der Infusion. (E) ASOs gegen Presenilin 1 oder GSK-3-beta; Wurden für 2 Wochen in den rechten lateralen Ventrikel von transgenen Mäusen und mRNA-Spiegel in der rechten frontalen / temporalen Kortex beurteilt infundiert. Wiedergabe mit freundlicher Genehmigung von der American Society for Clinical Investigation. Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 5. Laufen Horizontal Matratzennaht. 5-0 Nylon Faden gesponnen wird in und aus der Haut, beginnend vorderen und hinteren arbeiten, konzentriert sich mehr über die Kanüle. Einmal mit dem hintersten Punkt erreicht ist, wird der Faden dann zurück gebracht und Gewinde über die Kanüle noch einmal. Dies gewährleistet die einwandfreie Wundverschluss und verhindert, dass die Kanüle / Schlauch von der Arbeit durch die Haut.

Diskussion

Die Fähigkeit, global zu liefern Drogen im ZNS, wie in dem Video zu sehen ist eine äußerst leistungsfähige Technik, die einfach zu erlernen und zu bedienen beide ist. Mit etwas Übung kann eine einzelne Pumpe oder eine Implantation ICV Bolus in 10 min abgeschlossen sein, so dass für große Kohorten von Mäusen zur gleichen Zeit behandelt werden. Dies ist besonders nützlich für Studien mit einer Verhaltens-Anzeige, wie eine größere Anzahl für Mausverhalten kritisch, um zu einer wesentlichen Unterschiede.

Basierend auf unseren Erfahrungen liefern ASOs über Pumpen und Bolus-Injektionen, haben wir einige Vor-und Nachteile jeder Methode beobachtet. Es sollte angemerkt werden, dass diese die Meinungen in unserem Labor sind und möglicherweise nicht für alle Maus und Ratte Modelle wahr werden.

Wir finden, ein Vorteil der Verwendung der Pumpen ist ihre Fähigkeit, eine große Menge an ASO, da die ASO über einen viel längeren Zeitraum verteilt liefern. Diese Regel entspricht länger anhaltende Knockdown oder Spleißen nach aktiverASO Infusion, obwohl dies nicht immer der Fall sein. Die Pumpen ermöglichen auch einen genauen Zeitrahmen von ASO Lieferung (14 Tage, 28 Tage, oder 42 Tage) und die Pumpen einmal geändert werden, um für noch mehr aktiv ASO Infusion zu ermöglichen. Wir haben jedoch festgestellt, dass eine Änderung Pumpen mehr als einmal erhöht die Variabilität aufgrund der Bildung von faserigen Taschen um die Pumpe, die Pumpe ordnungsgemäß Absorptionsflüssigkeit zu verhindern. Ein Nachteil der Pumpen ist, dass einige Mäuse nicht dulden, die Pumpe sowie andere. Wenn die transgene Linie mit dem Sie arbeiten ist zerbrechlich, kann eine Pumpe zu umständlich. Die Pumpen müssen auch nach dem letzten Infusion entfernt werden, unterwirft die Mäuse zu einer anderen Operation und Anästhesie added. Wenn dabei Verhalten zu umgehen, ist es besonders wichtig, um die Pumpe zu entfernen und damit für mindestens 1-2 Wochen der Erholung, da die Anwesenheit der Pumpe einige Verhaltensweisen in den Mäusen beeinflussen.

Mit ICV Bolusinjektionen ist ein Vorteil Kosten. Es ist einVorab-Investition zum Kauf der Spritzen und Nadeln, aber im Laufe der Zeit, sind Bolusinjektionen kostengünstiger, da keine Pumpen / Schläuche / Katheter zu erwerben sind. Insgesamt gibt es weniger mit den ICV Bolusinjektionen aufgrund des Fehlens von Kanülen und pumpt-halten. Wir finden auch, dass ICV Bolus verwendet werden, um ASOs zu jüngeren und / oder anfälliger Mäuse liefern werden. Ein Nachteil des ICV Bolus ist, dass es nur eine Injektion. Nicht so viel, insgesamt ASO kann auf diesem Weg geliefert werden, und wenn die Wirkdauer des ASO verwendet ist kurz, die Knockdown / Spleißen Effekte werden auch von kurzer Dauer sein.

Sowohl die osmotische Pumpen sowie die ICV Bolus haben die Fähigkeit, ASOs liefern, dass Can Knockdown Proteine ​​oder ändern Spleißen von Genen im gesamten ZNS Nagetier, eine Technik, die breite Anwendungen in mehreren verwandten Bereichen Neurowissenschaften hat. Wir empfehlen Pilotierung beide Methoden der Lieferung, wenn Sie unsicher sind, welche Art der Verabreichung ist am besten geeignet für Ihre specific Studie.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
PREPARING ALZET OSMOTIC PUMPS
Alzet Osmotic Pump 14 days	DURECT	Model 1002
Alzet Osmotic Pump 28 days	DURECT	Model 2004
Alzet Osmotic Pump 42 days	DURECT	Model 2006
2.5 mm Catheters	PlasticsOne	3280PM/SPC	Custom ordered to 2.5 mm Catheter Length
Vinyl Catheter Tubing	DURECT	7760	ID: 0.027", OD: 0.045"
0.9% Sodium Chloride, Irrigation, USP	Baxter	2F7124	NOT to be used in pumps or tubing
0.9% Sodium Chloride, Injection, USP	Hospira	NDC 0409-4888-10
p60 Petri Dish (Sterilized)	TRP	93060
Surgical Blades (Sterile)	Butler Schein	#007319
Latex Surgical Gloves (Sterile)	Micro-Touch		CatNo will depend on size of the gloves needed
Sterile Towel Drape	Dynarex	4410
.2um Syringe Filters	PALL	4192
1 ml Syringe (Sterile)	BD	309625
50 ml Conical Tubes
100% Ethanol
PUMP & BOLUS SURGERY PROTOCOLS
Curved Forceps	Fine Science Tools	11001-12
Curved Hemostat	Fine Science Tools	13009-12
Fine Sharp Scissors	Fine Science Tools	14060-09
Curved Blunt Scissors	Fine Science Tools	14029-10
Bone Cutter	Fine Science Tools	16104-14
Straight Hemostat	Fine Science Tools	12002-12
Syringe	Hamilton	7653-01	10 μl gas-tight with removable needles
Needles	Hamilton	7758-04	26 gauge, Point Style: 2
5-0 Nylon Suture Thread	Covidient	SN-871
Alcohol Pads	Select	#521
Cotton Swabs (sterile)	Puritan	REF 806-WC
Super Glue	Loctite		Longneck Bottles
CAUTION: FastGreen Dye	Sigma	F7252-5G	Wear Eyeshields and Gloves when handling this product
Antibiotic Cream
Eye Ointment
Electric Shaver
70% Ethanol
10% Provadone Iodine
3% Hydogen Peroxide
Warming Pad
Bead Sterilizer	SouthPointe Surgical	GRM5-1450
Small Animal Stereotaxic	Kopf	Model 940
Nose Cone	Kopf	Model 923-B
Ear Bars	Kopf	Model 921	This model is optional
Cannula Driver	Kopf	Model 1966
Syringe Holder	Kopf	Model 1972
Temperature Control System	Kopf	Model TCAT-2LV	Optional
Oxygen/Isoflurane System