Quantitative Multispektrale Fluoreszenz-Analyse Nach Gewebetransplantation zur Visualisierung von Zell Origins, Typen und Wechselwirkungen

Zusammenfassung

Komplexe Gewebemassen, von Organen, Tumoren, werden von verschiedenen zellulären Elementen. Wir erläutert den Beitrag von zellulären Phänotypen innerhalb eines Gewebes unter Verwendung von Multi-markierte Fluoreszenz-transgenen Mäusen in Kombination mit Multiimmunfluoreszenzfärbung gefolgt von Entmischung, den Zellursprung sowie Zelleigenschaften auf der Basis der Proteinexpression zu entschlüsseln.

Zusammenfassung

Mit dem Wunsch, die Beiträge von mehreren Zellelemente auf die Entwicklung eines komplexen Gewebe zu verstehen, wie die zahlreichen Zelltypen, die bei der Regeneration von Gewebe, Tumorbildung oder Vaskulogenese zu beteiligen, entwickelten wir ein mehrfarbiges Zelltransplantationsmodell der Tumorentwicklung in welche Zellpopulationen stammen aus verschiedenen fluoreszierend gefärbten Reportergen-Mäusen transplantiert und, gepfropft oder in und um einen Tumor zu entwickeln injiziert. Diese farbigen Zellen werden dann rekrutiert und in den Tumor Stroma eingearbeitet. Um die quantitative Erfassung Knochenmark Tumor Stroma-Zellen transplantiert wir GFP-exprimierenden transgenen ganze Knochenmark in letal bestrahlten Mäusen RFP exprimieren wie IACUC genehmigt. 0ovarian Tumoren, die orthotop in die transplantierten Mäusen injiziert wurden, wurden 6-8 Wochen nach der Transplantation entnommen und für die Knochenmark-Marker der Herkunft (GFP) sowie Antikörper-Markierungen, um Tumor-assoziierte erkennen analysiertStroma mit multispektrale Imaging-Techniken. Wir haben dann eine Methodik angepasst nennen wir MIMicc-Multispektrale Abfrage der Multiplex-Zellmassen mit multispektralen Entmischung fluoroprobes quantitativ zu beurteilen, welche Zelle kam, von dem ausgehend Populationen (basierend auf Original-Reportergens Etiketten), und unsere Fähigkeit, entmischen 4, 5 beschriftet , 6 oder mehr Spektren pro Folie steigt, haben wir zusätzliche Immunhistochemie mit Zelllinien oder Differenzierung, um eine höhere Präzision assoziiert aufgenommen. Den Einsatz von Software zu co-lokalisiert Multiplex-Fluoreszenzsignale, Tumor-Stroma-Bevölkerung verfolgt, aufgezählt und auf der Grundlage Marker Färbung charakterisiert werden zu erkennen. ¹

Einleitung

Das Verständnis der Gewebeentwicklung und Reparatur ist wichtig, um die Aufklärung beteiligten zellulären Komponenten in der Wundheilung, ^2,3 regenerativen Medizin, Entwicklungsbiologie und Tumorbiologie. Unter Umständen, der Reparatur, zahlreiche Zelltypen zu infiltrieren das umgebende Mikromilieu in Vaskularisation, ECM-Ablagerung, Proliferation und Umstrukturierung des Gewebes zu unterstützen. Zellulären Faktoren und Phänotypen kann basierend auf Multi Multiplex-Marker, die die Lokalisierung identifizieren, Differenzierungsstatus und die Interaktion zwischen Zellkomponenten innerhalb des untersuchten Mikro identifiziert werden. Hier beschreiben wir die Tumorentwicklung als prototypisches Beispiel für diese multicolor-vielzelligen Transplantationsmodell gefolgt von multispektrale Bildgebung und Entmischung Methodik.

Tumorprogression ist ein mehrstufiger Prozess, der von mehreren erworbenen Fähigkeiten, die verbesserte Proliferation, eine umfassen markiertntiapoptotic, invasive und angiogenen Eigenschaften. ⁴ Tumorentwicklung wird durch nicht-neoplastischen Zellen, die in der Umgebung eingestellt werden, um Wachstumsfaktoren, strukturellen Matrix, Gefäßnetze und Immunmodulation bereitzustellen erleichtert. ^1,5,6 Diese Mikrohabitat besteht aus Zellen, abgeleitet von lokalen, benachbarten Geweben wie Fettgewebe und Blutgefäße und entfernten Quellen wie Knochenmark gewonnenen Zellen ^ein. Das Ausmaß der nicht-neoplastischen Zelle Aufnahme hängt von der Nachfrage aus dem Tumor, die oft mit der Bühne / Grad des Tumors entspricht. Um die Rolle der Tumormikroumgebung zu verstehen, muß man den Ursprung und das Differenzierungspotential der nicht-neoplastischen Zellpopulationen verstanden.

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um bei der Interpretation der Tumorprogression durch die Visualisierung der beiden Knochenmark abgeleiteten Zellkomponenten zu unterstützen und die lokale Gewebe derivED-Zellen. Mit Hilfe fluoreszierenden Reporter-Gen-exprimierenden transgenen Mäusen transplantiert wir GFP (grün-fluoreszierenden Proteins) Knochenmark in einem letal bestrahlten RFP (rot-fluoreszierende Protein) Maus. Nach der erfolgreichen Knochenmark Transplantation wird eine syngene Tumorzelllinie orthotop injiziert und für 4-8 Wochen einprägen. Die daraus resultierende Tumor aus der Maus herausgeschnitten und für Immunfluoreszenz-(IF)-Färbung, die Stroma-Komponenten visualisieren verarbeitet. Multiplex-IF-Marker ist eine häufig verwendete Technik, die signifikante Optimierung ^7-9 beinhaltet, jedoch unter Verwendung eines multispektrale Bild / Entmischung Plattform verbessert das Potential für fluoreszierende Markerkombinationen, die spektrale Überlappung aufweisen. Hier stellen wir eine Technik, die wir nennen MIMicc-Abfrage von multispek Multiplexed Zellzusammensetzungen zu färben und zu analysieren, bis zu acht Marker innerhalb eines Tumors Abschnitt auf einer einzelnen Folie, um die zelluläre Herkunft, Zelldifferenzierung st analysierenATUS und Zell-Zell-Wechselwirkungen von Komponenten innerhalb der Tumormikroumgebung. Dieses vereinfachte Beispiel hat das Potential auf, um fünf, sechs oder mehr Markern unter Verwendung von Antikörpern oder intrazelluläre Fluoreszenz Promotor getriebene Expression. Tabelle 1 zeigt potentielle Fluoreszenzantikörperfärbung Kombinationen mit geeigneten Arten berücksichtigt analysieren erweitert werden.

Protokoll

Syngene Murine Knochenmarktransplantation (KMT), wie von institutionellen IACUC Protokolle zugelassen (Hinweis: Der Erfolg dieses Protokoll erfordert den Einsatz aller markierten Zelltyp (en) als Ziel für die multispektrale Analyse und die nachgelagerten Analyse zu erleichtern, kann man die genetische nutzen oder stabilen Zellmarkierung. Wir schlagen vor, dass jede Zelle, Gewebe, Organ-oder-zu-sein kann zu einem Transplantationsmodell und die Transplantation kann so viele einzigartige markierten Populationen wie der Forschung für nützlich erachtet enthalten angewendet werden. Zusätzlich Multi-markierten Zellsystemen , wie sie in transgenen Mäusen gefunden, die Multiple Lineage eingeschränktem fluoreszenzmarkierten-Populationen können zur Transplantation Komplikationen für die Untersuchung von bestimmten pathologischen Zuständen zu beseitigen.

1. Lethally bestrahlen BMT Empfängermäuse mit einer Einzeldosis von 9,5 Gy vier Stunden vor dem Auflösen mit Spender-Knochenmark. (BMT GFP Empfänger sollten 6-10 Wochen alt sein).
2. Befeuchten Sie die Maus Fell mit 70% Ethanol vor Clipping-und Schäl es zurück in die Hinterbeine mit sterilen OP-Schere aus. Entfernen Sie das gesamte Bein einschließlich der Beckenkamm am Iliosakralgelenk. Entsorgen Sie den Fuß durch Schneiden knapp über dem Knöchel und dann gründlich alle Muskeln, Bänder und überschüssiges Gewebe aus dem Knochen entfernen. Flush Mark aus der Tibia, fibia und Beckenkamm mit einer 23 G-Nadel mit 2% sterile FBS in PBS (PBS-2). (BMT RFP Geber sollten nach institutionellen Standards geopfert werden.)
3. Scheibe und sanft zu vernichten verbleibenden Knochens in Fragmente mit einem Skalpell und einer Pinzette und dann in 50 ml konischen Röhrchen stellen mit 3 ug / ml Collagenase I für 1 h bei 37 ° C bei 300 UpM.
4. Krönen Sie das Rohr mit PBS-2 und sammeln Stand in ein frisches Röhrchen und verbinden sich mit Zellen gespült. Spin down bei 250 Upm für 5 min bei 4 ° C
5. Die Zellen in PBS-2 und 40 nm Filter, durch Zellfilter. An diesem Punkt können die Zellen markiert werden FLUORESCENt-aktivierte Zellsortierung (FACS), wenn man spezifische Populationen für die BMT manipulieren möchte.
6. Resuspendieren 2 x 10 ⁶ Zellen pro 100 &mgr; l PBS pro Maus. Verwenden Sie 29 G-Nadel systemisch in bestrahlte Empfängermäuse zu injizieren GFP durch Schwanz oder retro-orbitalen Venen-Fase-side-up. Spritzen Sie eine Maus mit 100 ul PBS nur als engraftment Kontrolle. Verwenden Sie eine Wärmelampe auf Schiffe vor der Injektion zu weiten und mit einem Schwanzveneninjektion Zurückhaltung bei der Injektion. Haben steriler Gaze Verfügung leichten Druck auf den Schwanz nach Injektion.
7. Drei Wochen nach der BMT, sammeln Blut retro-orbital und durch Strömungs Zytometrie analysieren, um das Vorhandensein von GFP zirkulierenden Zellen und das Fehlen von RFP zirkulierenden Zellen bestätigen. Die Steuerung mit der Maus an dieser Stelle gestorben.

2. Tumor Engraftment Nach Institutional IACUC Richtlinien

1. Wachsen ID8 Eierstock murine Tumorzellen in vitro vor der in vivo-Injektion (1 x 10 ⁶ cEllen pro Maus). Tag der Injektion, trypsinize Zellen, Waschen mit PBS und Resuspendieren in PBS mit 1 × 10 ⁶ Zellen pro 100 &mgr; l.
2. Inject Tumorzellen in intaperitoneal Hohlraum der Maus, sollte Nadelkegel-side-up sein. Sterilisieren Injektion Anblick mit 70% Ethanol. Spritzen Sie in der unteren linken oder rechten unteren Quadranten des Bauches (Schädel und der unteren Reihe von Bauch Brustwarzen der weiblichen Maus etwas medial), vermeiden, dass die Organe. Rain Maus durch Greifen durch das Genick und Halten der Schwanz mit dem kleinen Finger oder Ringfinger. Mäuse mit Isofluran anästhesiert für dieses Verfahren ist.
3. Opfere die Mäuse, wenn Anzeichen von Tumor Transplantation, wie leichte Blähungen, sind offensichtlich. Dies wird auftreten, über 4-12 Wochen.
4. Verbrauch Tumoren von IP Höhle. Tumoren innerhalb des Hohlraums wie weiße Knötchen auf und um die Oberfläche der Organe aussehen. Mit einem Skalpell, entfernen Sie die Tumoren und legen in einem Rohr / Glas 10% Formalin für 24 h Fixierung. Die histologische pWiedergutmachung kann die Pathologie / Histologie Kern ausgelagert werden, wenn Reagenzien und Materialien sind nicht für Paraffineinbettung und Rutsche Vorbereitung zur Verfügung stehen. Gewebe in Abschnitt 8.5 um Scheiben auf Glasobjektträger für nachfolgende Färbeverfahren.

3. Multiparameter-Immunfluoreszenzfärbung

1. Bereiten Einzelfarbsteuerung Folien für jeden Fluoreszenzsonde im Experiment eingesetzt. In diesem Szenario werden vier Farben verwendet. Daher vier Objektträger für jede einzelne Farbe als auch eine Folie für die Hintergrundgeräusche Kontrolle und schließlich eine Folie für die volle Kombination Färbung. (Total Dias = 6) Alle Folien nebeneinander verarbeitet werden, in identischer Weise auf experimentelle Variation zu minimieren.
2. Backen Paraffinschnitte bei 56 ° C für 1 Stunde.
3. Waschen Folien 3x 10 min in Xylol.
4. 100% Ethanol waschen 2x 5 min.
5. Waschen 1x 3 min 95% Ethanol
6. Waschen Sie 1x 2 min90% Ethanol.
7. Waschen Sie 1x 2 min70% Ethanol.
8. Wash 1x 2 min in Wasser. Langsam tauchen die Färbung Zahnstange in und aus dem Wasser 10x.
9. Während des letzten Wasch Serie, Pre-Kochen Natriumcitrat-Puffer für 2 min (Mikrowelle auf hoch). (Kann mit dem Tris-EDTA-Puffer je nach den verwendeten Antikörpern ersetzen)
10. Kochen Sie die Objektträger für 20 min in Natriumcitrat-Puffer (Mikrowelle auf 10% der Leistung oder im Schnellkochtopf). Wenn der Puffer kocht, schalten Mikrowelle und lassen Sie sich.
11. Von der Wärmequelle entfernen und lassen Sie die Objektträger für 30 Minuten ruhen in der Natrium-Citrat-Puffer abkühlen.
12. Spülen Sie die Folien in Wasser für 5 min.
13. Mark um Tumorschnitte mit Pap-Pen und legte 2% BSA / 1% FBS Maleinsäure Blocking-Puffer für 1 Stunde. Bereiten Sie die Folien einzeln als sie nicht austrocknen bei diesem Schritt lassen.
14. Bereiten primären Antikörpern bei optimale Verdünnung in Blockierungspuffer. (Wenn die Antikörper in Gebrauch sind verschiedene Arten (oder IgG-Kette Variation ex: IgG1 IgG2a vs der gleichen Spezies) können sie in Kombination verwendet werden, wie iningle Inkubationszeit. Wenn Antikörper-Spezies überschneiden, dann Inkubationen müssen nacheinander durchgeführt, um Antikörper-Kreuzreaktion zu minimieren.)
15. An dieser Stelle verlassen zwei Folien mit Sperr nur Puffer. Diese beiden Folien werden als ungefärbte Kontrolle und Kernfärbung Kontrolle dienen. Die anderen Einzelfarbsteuerung mit einzelnen primären Antikörpern inkubiert werden. Nur die Analyseschlitten wird eine Kombination von primären Antikörpern.
16. Folien mit primären Antikörper inkubieren in einer Feuchtekammer-Box auf langsam rotierenden Schüttler bei 4 ° C über Nacht (~ 16-20 h) (Hinweis: bei der Arbeit mit 4 + Fluorophore, sequentielle Färbung oder direkte Konjugation kann notwendig sein, Antikörper-Kreuzreaktion zu minimieren . Unter diesen Bedingungen zu wiederholen, bis alle Schritte 1,16-1,21 Antikörper werden auf die Folien aufgebracht.)
17. Waschen Sie Folien für 10 min in PBST (2x) sanft auf Schüttler
18. Während Wasch wird, bereiten AlexaFluor 488, 594 und 647 Sekundärantikörper für einen endgültigen Verdünnungvon 1:1000 in Blockierungspuffer. (Stellen Sie sicher, dass diese Antikörper und Verdünnungen werden bei 4 ° C und im Dunkeln zu allen Zeiten gehalten, um die Fluoreszenz über Chargen und im Laufe der Zeit zu bewahren.)
19. Auf den einzelnen Farbkontrollobjektträger, legen Einzel AlexaFluor Verdünnungen Anpassung der Spezies des primären Antikörpers eingesetzt. Alle Sekundärantikörper wird auf der Analyse Folie platziert werden. Die ungefärbten und die Kern gebeizt Steuerschieber mit Blocking-Puffer in diesem Schritt bleiben.
20. Inkubation in einer feuchten Kammer-Box (mit Aluminiumfolie abgedeckt, um Lichteinfall zu vermeiden) auf langsam rotierenden Schüttler bei RT für 2 Stunden.
21. Waschen Sie Folien für 5 min in PBST (2x) sanft auf Shaker. Deckel mit Aluminiumfolie vor Licht zu schützen.
22. Hinzufügen DAPI (1:10.000) 1 min an das DAPI-only Schieber und dem Analyseschlittens. Deckel mit Aluminiumfolie vor Licht zu schützen. Die anderen Folien können in den Waschbehälter fallen gelassen werden.
23. Waschen Sie die zwei DAPI-inkubiertFolien in einem separaten Behälter für die ersten 5 min waschen, um nicht mit der DAPI-Färbung verunreinigen die anderen Folien. Für den zweiten 5 min waschen, können die Folien in PBST kombiniert werden (alle Wäschen sollte auf einem Schüttler durchgeführt werden). Deckel mit Aluminiumfolie vor Licht zu schützen.
24. Kurz Dip Slides in Wasser vor cover-Rutschen (1,5 Dicke mit wässrigen Medien Montage, um die Fluoreszenz zu erhalten)
25. Trocknen lassen 3 Stunden in Dunkelheit bei RT.
26. Seal die Ränder des Deckglases mit Nagelhärter. (Verwenden Sie keine Nagellack als das Aceton kann das Fluoreszenzsignal zu stillen).
27. Analysieren Sie Folien sofort oder lagern bei 4 ° C für eine spätere Analyse.

4. Multispektrale Bildgebung

1. Sammeln multispektrale Bilder unter Verwendung einer Nuance EX-Kamera (mit einem Flüssigkristall abstimmbaren Filter) auf einer Olympus X-63 aufrechten Mikroskop mit Nuance-Software für die Datenerfassung.
2. Sammeln Sie Bilder mit einem Öl-Objektiv, um die Auflösung zu erhöhen.
3. Initial Set-up umfasst die Einstellung der spektralen Bereich für jedes Fluorophor im Einsatz.
   1. Für 4-Farben:
      1. DAPI: 420-480nm
      2. AF488: 490-580nm
      3. AF594: 590-640nm
      4. AF647: 650-720nm
4. Nehmen ein Anfangsbild der Analyseschlittens, um die richtigen Belichtungszeiten für jeden der Spektralbereiche erhalten.
5. Erstellen "Spektrenbibliothek", dass die Software verwenden, um zu identifizieren und trennen das Signal-zu-Rausch-Verhältnis der Fluorophore voneinander und Hintergrundsignal. (Anmerkung: 3 = 4 Fluorophore Steuerschieber; Fluorophore 5 = 6 Kontrollobjektträger: Jeder muss seine eigene Fluorochrom einfarbig Steuerschieber, um eine Spektrenbibliothek mit geeigneter Wellenlänge Kurven versammeln, um korrekte Analyse des Datensatzes Beispiel zu gewährleisten.).
   1. Bild zunächst den ungefärbten Rutsche. Diese Folie wird innerhalb der spektralen Bibliotheken bezeichnet werdeny als Hintergrund.>
   2. Bild der DAPI-nur Sekunden gleiten. Diese Folie wird verwendet, um die DAPI-gefärbten Zellkernen mit dem "zeichnen" Werkzeug zu bezeichnen und wird innerhalb der spektralen Bibliothek DAPI gespeichert werden.>
   3. Bild der AF488 nur schieben Drittel. Diese Folie wird verwendet, um die AF488-gefärbten Regionen mit dem "zeichnen" Werkzeug zu bezeichnen und wird innerhalb der spektralen Bibliothek als AF488 gespeichert werden.>
   4. Bild der AF594-only vierten gleiten. Diese Folie wird verwendet, um die AF594-gefärbten Regionen mit dem "zeichnen" Werkzeug zu bezeichnen und wird innerhalb der spektralen Bibliothek als AF594 gespeichert werden.>
   5. Bild der AF647-only fünften gleiten. Diese Folie wird verwendet, um die AF647-gefärbten Regionen mit dem "zeichnen" Werkzeug zu bezeichnen und wird innerhalb der spektralen Bibliothek als AF647 gespeichert werden.>
   6. Nach der Sammlung der einzelnen spektralen Komponenten,speichern Sie die Spektrenbibliothek und das Protokoll.>
6. Sobald die Spektrenbibliothek abgeschlossen ist, finden Bereiche von Interesse auf der Analyse Folie auf dem Mikroskop und sammeln / Bilder zu speichern.>

5. Quantitative Analyse der multispektrale Bilder

1. Importieren Sie eine repräsentative Auswahl von Bildern mit Nuance erworben InForm Software.
2. Öffnen Sie die gespeicherte Spektrenbibliothek durch das Programm geleitet
3. Identifizieren Gewebebereiche von Interesse analysiert werden. (ZB Tumorgewebe im Vergleich zu Fettgewebe).
4. Identifizieren einzelner Zellen auf Basis von DAPI-Fleck. Zytoplasma wird automatisch auf Grundlage der Form des Kerns bestimmt werden.
5. Suchen Sie sich die Fluoreszenzintensität Auslesen der Wahl für jeder Leuchtstoffparameter (z. B. Mittelwert, Standardabweichung)
6. Batch die aufgenommenen Bilder und lassen Sie die Software-Prozess unter Verwendung des vorgeschlagenen Algorithmus.
7. Wenn die Bildverarbeitung abgeschlossen ist, verschmelzendie Ergebnis-Dateien.
8. Öffnen Sie die Ergebnisse in Excel (oder einem anderen Analysesoftware-Paket) und zeichnen zwei Fluoreszenzintensitäten gegeneinander auf XY-Achse. Jeder Fluoreszenzintensität pro Zelle angegeben. Die Doppel-positiven Zellen wird in der oberen rechten Quadranten erscheinen. Der Benutzer muss die Grundlinie Fluoreszenzintensitäten zu definieren.

Ergebnisse

Mit einem multispektrale Imaging-Technik, um Tumore in unserem BMT transgenen Mausmodell eingepflanzt zu analysieren, können wir Stromatumoren Komponenten, die von Knochenmark Herkunft zu erkennen. Die Anfangs BMT wurde 3 Wochen nach der Transplantation mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 1) bestätigt. Orthotop injiziert unmarkierten Eierstock-Tumoren nach Transplantation BMT Bestätigungen wurden herausgeschnitten und Formalin fixiert 6 Wochen nach der ersten Tumorinjektion. Paraffin eingebettete...

Diskussion

Hier beschreiben wir die Anwendung der multispektralen Bildgebung beschreiben wir, wie multispektrale MIMicc-Abfrage der Multiplex-Zellmassen, die Knochenmark Stromazellen Komponenten der Tumor-Mikroumgebung zu analysieren, aber diese Methode und Konzept kann auf die Entschlüsselung anderen zellulären Elemente, die eine komplexe Komposition angewendet werden Gewebe, wie sie bei Wundheilungsreaktionen oder während eines regenerierbaren Gewebes gesehen. In diesen Experimenten verwenden wir transgene Mäuse fluoreszenz ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
.2 μm filter	Fisher	09-740-35A
10 ml lure lock	BD	309604
25 G needle	Cardinal	BF305122
40nm filter	BD	352340
50 ml conical tube	Fisher	1495949A
Alexafluor 488-ms1	invitrogen	A21121
Alexafluor 594-Rb	invitrogen	A21207
Alexafluor 647-ch	Invitrogen	A21449
BSA	Sigma	A7906-500G
Cover slips	Corning	2940-243
CRI-Nuance	Caliper Life Sciences
Dapi	Invitrogen	D1306
DMEM	CellGro	10-017-CV
Ethanol	Dharmacon	4004-DV
FBS	invitrogen	16000-044
GFP-ms1	Abcam	ab38689
Insulin needle	BD	329424
Maleic acid	Acros	100-16-7
Moisture chamber box	Evergreen	240-9020-Z10
Mounting media	dako	S3023
Nail hardener	Sally Hansen	2103
Pap pen	Abcam	Ab2601
Pen/Strep L Glut	invitrogen	10378016
Steril PBS	invitrogen	14040-182
Trypsin	invitrogen	252000-56
Blocking Buffer maleic acid 14.51 g NaCl 10.95 g NaOH pellets (to 7.5pH) 9+g Distilled water 250 ml *add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. Antigen retrieval buffers: Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0) Tris Base 1.21 g EDTA 0.37 g Distilled water 1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x) Tween 20 0.5 ml *Store at RT for 3 months or at 4 ° C for longer Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0) Tri-sodium citrate (dihydrate) 2.94 g Distilled water 1000 ml HCl (adjust pH to 6.0) 1N Tween 20 0.5 ml