세포의 기원, 종류, 그리고 상호 작용의 시각화를위한 형광 조직 이식에 따라 정량 멀티 스펙트럼 분석

요약

복잡한 조직 대중은 장기에서 종양, 다양한 세포 요소로 구성되어있다. 우리는 세포의 기원뿐만 아니라 단백질 발현에 따라 세포의 특성을 해독 스펙트럼 unmixing 다음 다중 매개 면역 형광 염색과 함께 멀티 라벨 형광 형질 전환 마우스를 이용한 조직 내에서 세포의 표현형의 기여를 밝혀.

초록

복합 조직의 발달로 여러 셀룰러 요소의 포스팅을 이해하는 욕망 등의 조직, 종양 형성 또는 혈관 생성의 재생에 참여할 다수의 세포 유형으로, 우리의 종양 발달의 멀티 셀룰러 이식 모델을 고안 세포 집단은 서로 다른 색깔의 형광 리포터 유전자 쥐에서 발생하고, 이식 접목 또는 개발 종양과 주위에 주입한다. 이러한 색깔의 세포는 다음 모집 종양 기질에 통합됩니다. 정량적으로 골수 유래의 종양 간질 세포를 평가하기 위하여, 우리는 IACUC 승인 한 생쥐를 발현 치명적 조사 RFP로 형질 전체 골수를 이식 GFP 발현. orthotopically 이식 된 생쥐에 주입했다 0ovarian 종양 6-8 주 포스트 생착을 절제 및 관련 종양을 감지하는 기원의 골수 마커 (GFP)뿐만 아니라 항체 마커 분석 하였다멀티 스펙트럼 화상 기술을 이용하여 기질. 우리는 그 양적 세포가있는 (원본 리포터 유전자 라벨 기준)부터 인구, 4, 5 unmix 할 수있는 능력과 함께 표시되는 평가하는 fluoroprobes의 멀티 스펙트럼 unmixing을 사용하여, 우리는 멀티 플렉스 세포 조성물의 MIMicc - 멀티 스펙트럼 심문 호출 방법을 적용 슬라이드 증가 당 6 개 이상의 스펙트럼, 우리는 세포 계통 또는 정밀도를 높이기 위해 분화와 관련된 추가 면역 조직 화학 염색을 추가했습니다. 공동화 다중 형광 신호, 종양의 기질 인구가, 추적 열거 마커 염색을 기준으로 특징 될 수있다을 감지하는 소프트웨어를 활용. ¹

서문

조직 개발 및 수리를 이해하는 것은 상처 치유, ^2,3 재생 의학, 발달 생물학, 종양 생물학에 참여하는 세포 구성 요소를 해명에 중요하다. 수리의 상황에서, 많은 종류의 세포는 혈관, ECM 증착, 확산 및 조직 구조 조정에 도움이 주변의 미세 환경에 침투. 셀룰러 요인과 표현형은 다 항목, 지역화를 식별 할 수있는 다중화 마커, 분화 상태와 조사 미세 환경 내 세포 성분 사이의 상호 작용을 기반으로 식별 될 수있다. 여기서, 우리는 다중 분광 영상과 스펙트럼 unmixing 방법론 다음이 여러 가지 빛깔의 - 다세포 이식 모델의 프로토 타입 예를 들어 종양의 발달을 설명합니다.

종양의 진행이 향상 확산을 포함 여러 인수 기능에 의해 표시되는 여러 단계의 과정이다, ntiapoptotic 침습적 혈관 속성은. ⁴ 종양 개발은 성장 인자, 구조 행렬, 혈관 네트워크와 면역 변조를 제공하기 위해 주변 환경에 모집 비 종양 세포에 의해 촉진된다. ^1,5,6이 microhabitat가에서 파생 된 세포로 구성 지역, 이웃 등 지방 등의 조직, 혈관 및 골수 유래 세포 ^1과 먼 소스. 비 종양 세포 결합의 정도는 종종 종양의 단계 / 등급에 해당하는 종양의 수요에 따라 달라집니다. 지지 종양 미세 환경의 역할을 이해하기 위해, 하나의 비종 양성 세포 집단의 기원과 분화 잠재력을 이해해야한다.

이 프로토콜은 로컬 티슈 변환 해주는 둘 골수 유래 세포 성분의 시각화를 통한 종양 진행의 해석을 돕기 위해 설계되었으며세포 에드. 형광 리포터 유전자를 발현하는 형질 전환 생쥐를 활용하여, 우리는 치명적 조사 RFP (적색 형광 단백질) 마우스로 GFP (녹색 형광 단백질)의 골수를 이식. 성공적인 골수 생착 다음, 동계 종양 세포주 orthotopically 주입 4-8 주간 생착시킨다. 그 결과 종양 마우스에서 절제와 기질 구성 요소를 시각화하는 면역 염색 (IF)에 처리됩니다. 다중 마커 그러나 스펙트럼 중복을 가지고 형광 마커의 조합에 대한 가능성을 향상시키는 다중 분광 영상 / unmixing 플랫폼을 사용하여, 상당한 최적화 ^7-9을 포함 일반적으로 사용되는 기술됩니다. 여기에서 우리는 우리가 세포의 기원, 세포 분화 성을 분석하기 위해 얼룩 하나의 슬라이드에 종양 섹션에있는 여덟 마커까지 분석하는 다중 세포 조성물을 MIMicc - 멀티 스펙트럼 심문 전화 기술을 제시ATUS와 종양 미세 환경 내에서 구성 요소의 세포 - 세포 상호 작용. 이 간단한 예는 항체를 이용하여 다섯, 여섯, 이상의 마커 또는 세포 내 프로 중심의 형광등 식입니다. 표 1은 고려 적절한 종의 잠재적 인 형광 항체 염색 조합을 분석하기 위해에 따라 확장 할 수있는 잠재력을 가지고 있습니다.

프로토콜

동계 쥐과 골수 이식 (BMT)는 기관 IACUC 프로토콜에 의해 승인 된 (주 :이 프로토콜의 성공은 멀티 스펙트럼 분석 대상으로 어떠한 라벨링 된 셀 타입 (들)의 이용을 필요로하고, 하류의 분석을 용이하게하기 위하여, 하나는 어떤 유전자를 이용할 수 또는 안정 세포 라벨링. 우리는 어떤 셀, 조직, 또는 기관 - 투 - 수 이식 모델과 연구가 유용하다고 생각 이식 등의 다양하고 독특한 레이블 인구를 포함 할 수있는 적용 할 수있는 것이 좋습니다. 또한, 셀룰러 시스템을 멀티 레이블 이러한 여러 혈통을 포함하는 형질 전환 생쥐에서 발견 된 것과 같은 제한된 형광 인구가 - 수있는 특정 병적 인 상태의 연구를위한 이식 합병증을 제거하도록 설계되어야 표시.

1. 치명적 기증자의 골수와 재구성하기 전에 9.5 Gy를 4 시간 단일 용량으로 BMT받는 사람 쥐를 조사. (BMT GFP받는 연령 6 ~ 10 주 정도합니다.)
2. 클리핑 및 무균 수술 가위로 두 다리를 노출 다시 그것을 풀기 전에 70 % 에탄올로 마우스 펠트를 적 십니다. 천장 관절의 장골을 포함하여 다리 전체를 제거합니다. 다만 발목 위하고 철저하게 뼈의 모든 근육, 인대 및 초과 조직을 제거 절단하여 발을 폐기하십시오. PBS (PBS-2)에서 2 % 멸균 FBS를 사용하여 23 G 바늘 경골, fibia과 장골의 문장에서 세척 골수. (BMT의 RFP 기증자 기관의 기준에 따라 희생해야합니다.)
3. 부드럽게 조각과는 메스와 집게를 사용하여 조각으로 남아있는 뼈를 분쇄 한 후 300 rpm에서 37 ° C에서 나는 1 시간 동안 3 ㎍ / ㎖의 콜라게나 제와 50 ㎖에 원뿔 튜브를 놓습니다.
4. PBS-2 튜브를 위로하고 새로운 튜브에 뜨는을 수집하고 플러시 세포와 결합. 4 ℃에서 5 분 동안 250RPM에서 스핀 다운
5. PBS-2 세포를 재현 탁하고 40 nm의 셀 필터를 통해 필터링. 이 시점에서, 세포는 fluorescen 표지 할 수있다t는 하나 BMT 특정 인구를 조작하고자하는 경우 (FACS)를 정렬 셀을 활성화.
6. 마우스 당 100 ㎕의 PBS 당 2 × 10 ⁶ 세포를 재현 탁. 체계적으로 꼬리 또는 복고풍 궤도 정맥 베벨 사이드 업에 의해 조사 GFP받는 사람 생쥐에 주입하기 위해 29 G 바늘을 사용합니다. 만 생착 컨트롤로 100 ㎕의 PBS와 함께 하나의 마우스를 주입한다. 주사 전에 혈관을 팽창 및 사출에 꼬리 정맥 주입 억제를 사용하는 가열 램프를 사용합니다. 꼬리 포스트 분사에 가벼운 압력을 적용 할 수 멸균 거즈가있다.
7. 3 주는 BMT를 게시 혈액 복고풍 궤도를 수집하고 GFP 순환 세포의 존재 및 RFP 순환 세포의 유무를 확인하기 위해 유동 세포 계측법에 의해 분석한다. 컨트롤 마우스는이 시점에서 사망 한 것입니다.

2. 종양 생착 기관 IACUC 가이드 라인에 따르면,

1. ID8에게 사전에 생체 주입 (1 × 10 ⁶ C에 체외에서 생쥐 난소 종양 세포를 성장마우스 당 ELL 학생). 주입의 날,를 Trypsinize 세포는 100 μL 당 1 × 10 ⁶ 세포를 PBS에 PBS 세척에 resuspend.
2. 마우스 intaperitoneal 공동으로 종양 세포를 주입, 바늘 베벨 사이드 업해야합니다. 70 % 에탄올을 주입 광경을 소독. 왼쪽 아래 또는 복부의 오른쪽 아래 사분면에 주사 (두개골 약간 여성 마우스의 복부 젖꼭지의 하부 집합으로 내측), 장기를 타격하지 마십시오. 목덜미에 의해 잡아 새끼 손가락이나 반지 손가락으로 꼬리를 잡고 마우스를 억제합니다. 마우스는이 절차에 이소 플루 란으로 마취 할 수 있습니다.
3. 이러한 약간의 복부 팽만감 등의 종양 생착의 징후가 명백 할 때 쥐를 희생. 이 4-12 주 이상을 발생합니다.
4. IP 캐비티에서 소비세 종양. 캐비티 내의 종양은 장기의 표면에 주변에 흰색 결절과 같이 표시됩니다. 메스, 종양을 제거하고 24 시간 고정 10 % 포르말린의 튜브 / 항아리에 넣습니다. 조직 학적 P배상은 병리 / 조직학 코어에 아웃 소싱 할 수있는 시약 및 재료는 파라핀의 임베딩 및 슬라이드 준비를 위해 쉽게 사용할 수없는 경우. 이후 염색 절차 유리 슬라이드에 5-8 μm의 조각으로 장 조직.

3. 다중 매개 변수 면역 형광 염색법

1. 실험에 사용 모든 형광 프로브 단일 색상 제어 슬라이드를 준비합니다. 이 시나리오에서는, 4 개의 색깔이 사용됩니다. 따라서, 각각의 색에 대한 네 개의 슬라이드뿐만 아니라 배경 소음 제어하고 전체 조합의 염색을 위해 마지막으로 하나의 슬라이드에 대한 하나의 슬라이드. (총 슬라이드 = 6) 슬라이드는 실험적인 변화를 최소화하기 위해 동일한 방식으로 나란히 처리됩니다.
2. 1 시간 동안 56 ° C에서 파​​라핀 섹션을 굽는다.
3. 흘려 슬라이드 크실렌에 10 분간 3 배.
4. 배 5 분 100 % 에탄올을 씻으십시오.
5. 1X 3 분 95 % 에탄올 세척
6. 1X 2 min90 % 에탄올을 씻으십시오.
7. 1X 2 min70 % 에탄올을 씻으십시오.
워시 1X 2 분. 천천히 물 10 배 안팎으로 염색 랙을 몰두.
8. 마지막 세척 시리즈 중, 2 분 (고에 전자 레인지)에 대한 사전 종기 구연산 나트륨 완충액. (사용되는 항체에 따라 트리스-EDTA 완충액으로 대체 할 수있다)
9. 구연산 나트륨 완충액 (10 % 힘 또는 압력 밥솥 전자 레인지)에서 20 분 동안 슬라이드를 끓인다. 버퍼가 비등하면, 전자 렌지를 끄고 앉아 보자.
10. 열원에서 제거하고 슬라이드가 식을 때까지 구연산 나트륨 완충액에 30 분간 휴식을 할 수 있습니다.
11. 5 분 동안 물에 슬라이드를 씻어.
12. 자궁 펜 종양 부분의 주위에 표시하고 1 시간 동안 차단 버퍼 2 % BSA / 1 % FBS 말레 산을 넣어. 그들이이 단계에서 건조시키지 않는 개별적으로 슬라이드를 준비합니다.
13. 버퍼를 차단에 최적의 희석에 기본 항체를 준비합니다. (사용 된 항체는 다른 종의 모든 (또는 IgG의 사슬 바리에이션 EX다면 : 동일한 종의 IgG2a VS의 IgG1)들이 같은 과정을 조합하여 사용할 수있다화롯불의 잠복기. 항체 종가 겹치는 경우에, 배양 항체는 교차 반응을 최소화하기 위해 순차적으로 수행되어야한다.)
14. 이 시점에서, 전용 버퍼를 차단하는 두 개의 슬라이드를 둡니다. 이 두 슬라이드 흠 제어 및 핵 오염 제어 역할을합니다. 다른 하나의 컬러 컨트롤은 개별 차 항체와 함께 배양한다. 남은 분석 슬라이드 일차 항체의 조합을 가질 것이다.
15. 에서 천천히 회전하는 통에 습기 챔버 상자 1 차 항체로 슬라이드를 품어 4 ° 하룻밤 (~ 16 ~ 20 시간) (주 : 4 + 형광, 연속 염색 또는 직접 활용하여 작업 할 때하는 항체 교차 반응을 최소화 할 필요가있다 . 모든 항체가 슬라이드에 적용 될 때까지 이러한 상황이 단계를 반복 1.16-1.21에서.)
16. 부드럽게 진탕 PBST에서 10 분 (배)에 슬라이드를 씻으십시오
17. 세척이 진행되는 동안, 최종 희석 Alexafluor 488, 594 및 647 차 항체를 준비버퍼를 차단하는 1:1,000의. (이 항체와 희석이 일괄 처리를 통해 시간이 지남에 형광을 유지하기 위해 항상 4 ° C에서 어두운에 보관되어 있는지 확인하십시오.)
18. 단일 색상 제어 슬라이드에 사용 된 일차 항체의 종류와 일치하는 단일 Alexafluor 희석을 배치합니다. 모든 차 항체는 분석 슬라이드에 배치됩니다. 흠 핵 스테인드 제어 슬라이드는이 단계를 통해 차단 버퍼에 남아있을 것입니다.
19. 2 시간 동안 실온에서 천천히 회전하는 통에 (빛의 노출을 피하기 위해 알루미늄 호일로 덮여) 수분 챔버 상자에 품어.
20. 부드럽게 진탕 PBST에서 5 분 (배)에 슬라이드를 씻으십시오. 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 커버.
21. 1 DAPI 전용 슬라이드로 분하고 분석 슬라이드 DAPI (1:10,000)를 추가합니다. 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 커버. 다른 슬라이드는 세척 용기에 덮여 남아있을 수 있습니다.
22. 두 DAPI-배양을 씻으DAPI의 얼룩과 다른 슬라이드를 오염시키지로서 처음 5 분 세척을위한 별도의 용기에 슬라이드. 제 5 분간 세척을 위해, 슬라이드는 (모든 세척은 쉐이커에 수행되어야한다) PBST로 결합 될 수있다. 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 커버.
23. 물에 간단히 딥 슬라이드 전에 덮개를 미끄러지는 (형광을 유지하기 위해 수성 장착 매체와 1.5 두께)
24. RT 어두운 건조 3 시간을 보자.
25. 손톱 경화제와 커버 슬립의 가장자리를 밀봉. (아세톤 형광 신호를 해소 할 수 있습니다로 매니큐어를 사용하지 마십시오).
26. 바로 슬라이드를 분석하거나 미래 분석을 위해 4 ° C에 저장할 수 있습니다.

4. 다중 분광 영상

1. 데이터 수집을 위해 뉘앙스 소프트웨어 올림푸스 X-63 수직 현미경 (액정 조정할 수있는 필터를 포함) 뉘앙스 EX 카메라를 이용하여 멀티 스펙트럼 이미지를 수집합니다.
2. 해상도를 높이기 위해 오일 대물를 사용하여 이미지를 수집한다.
3. InitiaL 세트 업 사용의 각 형광의 스펙트럼 범위 설정이 포함되어 있습니다.
   1. 4 색 :
      1. DAPI : 420 - 480 ㎚
      2. AF488 : 490 - 580 ㎚
      3. AF594 : 590-640nm의
      4. AF647 : 650-720nm
4. 스펙트럼 범위의 각각에 대해 적절한 노출 시간을 구하는 분석 슬라이드의 초기 이미지를 취할.
5. 소프트웨어는 서로 형광체의 신호 대 잡음비 및 백그라운드 신호를 식별하고 분리하는 데 사용하는 "스펙트럼 라이브러리"를 만들기. (참고 : 3 형광 = 4 제어 슬라이드, 5 형광 = 6 제어 슬라이드 : 각 형광 색소는 데이터 세트의 적절한 분석 예를 보장하기 위해 적절한 파장 곡선 스펙트럼 라이브러리를 조립하기 위해 자신의 단일 색상 제어 슬라이드가 있어야합니다.).
   1. 첫 번째 이미지 흠없는 슬라이드를. 이 슬라이드는 스펙트럼 librar 내에서 지정됩니다배경으로 y를 입력합니다.>
   2. 이미지 DAPI 전용 두 번째 슬라이드. 이 슬라이드는 "그리기"도구를 사용하여 DAPI 염색 핵을 지정하는 데 사용됩니다 및 DAPI로 스펙트럼 라이브러리에 저장됩니다.>
   3. 이미지 AF488 만 세 번째 밀어 넣습니다. 이 슬라이드는 "무승부"도구를 사용하여 AF488-스테인드 영역을 지정하는 데 사용되며 AF488과 스펙트럼 라이브러리에 저장됩니다.>
   4. 이미지 AF594-4 위에 밀어 넣습니다. 이 슬라이드는 "무승부"도구를 사용하여 AF594-스테인드 영역을 지정하는 데 사용되며 AF594과 스펙트럼 라이브러리에 저장됩니다.>
   5. 이미지 AF647 전용 다섯 번째십시오. 이 슬라이드는 "무승부"도구를 사용하여 AF647-스테인드 영역을 지정하는 데 사용되며 AF647과 스펙트럼 라이브러리에 저장됩니다.>
   6. 각 스펙트럼 성분의 컬렉션을 이어스펙트럼 라이브러리와 프로토콜을 저장합니다.>
6. 스펙트럼 라이브러리가 완료되면, 이미지를 저장 / 현미경 분석 슬라이드에 관심 영역을 찾아 수집합니다.>

5. 멀티 스펙트럼 화상의 정량 분석

1. 소프트웨어 통보하여 획득 한 뉘앙스 이미지의 대표 구색을 가져옵니다.
2. 프로그램의 지시에 따라 저장 스펙트럼 라이브러리를 엽니 다
3. 분석 할 그 조직의 영역을 식별합니다. (지방 조직에 비해 예를 들어 종양 조직).
4. DAPI 얼룩을 기준으로 각각의 세포를 식별합니다. 세포질 핵의 형태에 기초하여 자동으로 정의 될 것이다.
5. 각 형광 매개 변수에 대한 선택의 형광 강도 판독을 선택 (예 : 평균, 표준 편차)
6. 일괄 이미지를 획득하고 제안 된 알고리즘을 이용하여 소프트웨어 프로세스를 보자.
7. 화상 처리가 종료되면, 병합결과 파일.
8. 엑셀 (또는 다른 분석 소프트웨어 패키지)에 결과를 열고 XY 축에서 서로에 대해 두 형광 강도를 음모. 각각의 형광 강도는 셀 당 주어진다. 이중 양성 세포는 오른쪽 상단 사분면에 나타납니다. 사용자는베이스 라인 형광 강도를 정의해야합니다.

결과

우리 형질 BMT 마우스 모델에서 종양 접목을 분석하는 멀티 스펙트럼 영상 기술을 사용하여, 우리는 골수 유래의 아르 간질 종양 성분을 식별 할 수있다. 초기 BMT는 유동 세포 계측법에 의해 3 주 후 이식 (그림 1)을 확인 하였다. Orthotopically는 BMT의 생착 확인서가 초기 종양 주사 다음 절제 포르말린이 육주 수정 된 다음과 같은 레이블이없는 난소 종양을 주입했다. 파라핀 종양 섹션은 &...

토론

여기서 우리는 종양 미세 환경의 골수 유래 기질 성분을 분석하기 위해, 멀티 플렉스 셀룰러 조성물 MIMicc - 멀티 스펙트럼 심문으로 서술 멀티 스펙트럼 영상의 응용을 설명하지만 이러한 방법론과 개념은 복잡한 구도 다른 세포 성분을 해독에 적용될 수있다 이러한 상처 치유 반응 중 또는 재생 조직 중에 본 것과 같은 조직. 이 실험에서 우리는 형광 접목 종양 미세 환경 내의 호스트 유래 세포?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
.2 μm filter	Fisher	09-740-35A
10 ml lure lock	BD	309604
25 G needle	Cardinal	BF305122
40nm filter	BD	352340
50 ml conical tube	Fisher	1495949A
Alexafluor 488-ms1	invitrogen	A21121
Alexafluor 594-Rb	invitrogen	A21207
Alexafluor 647-ch	Invitrogen	A21449
BSA	Sigma	A7906-500G
Cover slips	Corning	2940-243
CRI-Nuance	Caliper Life Sciences
Dapi	Invitrogen	D1306
DMEM	CellGro	10-017-CV
Ethanol	Dharmacon	4004-DV
FBS	invitrogen	16000-044
GFP-ms1	Abcam	ab38689
Insulin needle	BD	329424
Maleic acid	Acros	100-16-7
Moisture chamber box	Evergreen	240-9020-Z10
Mounting media	dako	S3023
Nail hardener	Sally Hansen	2103
Pap pen	Abcam	Ab2601
Pen/Strep L Glut	invitrogen	10378016
Steril PBS	invitrogen	14040-182
Trypsin	invitrogen	252000-56
Blocking Buffer maleic acid 14.51 g NaCl 10.95 g NaOH pellets (to 7.5pH) 9+g Distilled water 250 ml *add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. Antigen retrieval buffers: Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0) Tris Base 1.21 g EDTA 0.37 g Distilled water 1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x) Tween 20 0.5 ml *Store at RT for 3 months or at 4 ° C for longer Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0) Tri-sodium citrate (dihydrate) 2.94 g Distilled water 1000 ml HCl (adjust pH to 6.0) 1N Tween 20 0.5 ml