Análise Quantitativa Multispectral Após transplante de tecido fluorescente para visualização das Origens celulares, Tipos e Interações

Resumo

Massas de tecido complexos, a partir de órgãos de tumores, são compostas de vários elementos celulares. Nós elucidada a contribuição de fenótipos celulares dentro de um tecido utilizando ratinhos transgénicos fluorescentes multi-marcados em combinação com coloração de imunofluorescência multiparamï seguido de separação espectral para decifrar origem celular, bem como características de células com base na expressão da proteína.

Resumo

Com o desejo de compreender as contribuições de múltiplos elementos celulares para o desenvolvimento de um tecido complexo, tais como os numerosos tipos de células que participam na regeneração do tecido, a formação do tumor, ou vasculogénese, concebemos um modelo de multi-colorida de transplante celular de desenvolvimento de tumores em que populações de células provenientes de diferentes camundongos gene repórter coloridas e fluorescentes são transplantadas, enxertados ou injetado e em torno de um tumor em desenvolvimento. Estas células são, então, recrutados coloridas e incorporada no estroma do tumor. Para avaliar quantitativamente derivadas da medula óssea células do estroma tumorais, nós transplantado GFP expressando transgênico medula óssea em todo RFP letalmente irradiados expressando camundongos aprovado pelo IACUC. 0ovarian tumores que foram ortotopicamente injetadas nos ratos transplantados foram excisadas 6-8 semanas pós enxerto e analisadas para o marcador de medula óssea de origem (GFP), bem como marcadores de anticorpos para detectar tumor associadoestroma usando técnicas de imagem multiespectrais. Em seguida, adaptado de uma metodologia que chamamos MIMicc-Multispectral Interrogatório de composições diversificadas celulares, usando desmistura multiespectral de fluoroprobes avaliar quantitativamente qual rotulado célula veio a partir do qual as populações iniciais (com base em rótulos originais de gene repórter), e como a nossa capacidade de unmix 4, 5 , 6 ou mais espectros por slide aumenta, nós adicionamos imunohistoquímica adicional associado com linhagens de células ou de diferenciação para aumentar a precisão. Utilizando o software para detectar sinais multiplexados fluorescente co-localizadas, as populações do estroma tumorais podem ser rastreados, enumeradas e caracterizadas com base na coloração do marcador. ¹

Introdução

Compreender o desenvolvimento e reparação dos tecidos é importante para elucidar participantes componentes celulares na cicatrização de feridas, ^2,3 medicina regenerativa, biologia do desenvolvimento e biologia do tumor. Em circunstâncias de reparação, numerosos tipos de células infiltrar o microambiente circundante para ajudar na vascularização, a deposição de ECM, a proliferação e reestruturação de tecidos. Factores celulares e fenótipos podem ser identificados com base em multiparamétrica, marcadores multiplexados que podem identificar a localização, o estado de diferenciação e a interacção entre os componentes celulares dentro do microambiente investigada. Relata-se o desenvolvimento do tumor como um exemplo prototípico para este modelo de transplante multicolor-multicelular seguido de imagens multiespectrais e metodologia desmistura espectral.

A progressão tumoral é um processo em várias etapas, que é marcada por várias capacidades adquiridas, que incluem a proliferação aumentada, umaPropriedades ntiapoptotic, invasivos e angiogénicos. ⁴ O desenvolvimento do tumor é facilitada por células não neoplásicas que são recrutadas para o ambiente circundante para fornecer factores de crescimento, as matrizes estruturais, redes vasculares e de modulação imunitária. ^1,5,6 Este microhábitat consiste de células derivadas a partir de tecidos locais, vizinhos, como adiposo e vasos sanguíneos e de fontes distantes, como medula óssea, células derivadas ^1. A extensão da incorporação de células não neoplásicas depende da demanda do tumor, o que corresponde geralmente à fase / grau do tumor. Para compreender o papel do microambiente favorável tumor, é preciso entender a origem eo potencial de diferenciação das populações de células não neoplásicas.

Este protocolo foi concebido para auxiliar a interpretação da progressão do tumor por meio da visualização de ambas as da medula óssea derivadas de componentes celulares, e o local do tecido derivcélulas ed. Utilizando camundongos fluorescentes expressando gene repórter transgênicos, nós transplantados de medula GFP (proteína verde fluorescente) osso em uma RFP letalmente irradiados (proteína vermelha fluorescente) do mouse. Seguindo o enxerto de medula óssea com êxito, uma linha de células de tumor singeneico é injectado ortotopicamente e deixou-se enxertar por 4-8 semanas. O tumor resultante é excisado do rato e processada para imunofluorescência (IF) de coloração para visualizar os componentes do estroma. Multiplexing IF marcadores é uma técnica comumente usada que envolve otimização significativa ^7-9, porém utilizando uma plataforma de imagem / desmistura multiespectral melhora o potencial de combinações de marcadores fluorescentes que possuem sobreposição espectral. Apresentamos aqui uma técnica que chamamos de interrogatório MIMicc-multiespectral de composições celulares multiplexados para manchar e analisar até oito marcadores dentro de uma seção de tumor em um único slide, a fim de analisar as origens celulares, diferenciação celular rualhos e as interações célula-célula de componentes dentro do microambiente do tumor. Este exemplo simplificado tem o potencial para ser expandida a fim de analisar cinco, seis ou mais marcadores, utilizando anticorpos ou expressão fluorescente-driven promotor intracelular. Tabela 1 apresenta potenciais combinações de coloração de anticorpos fluorescentes com espécies adequadas, tomadas em conta.

Protocolo

Singênico Murino Transplante de Medula Óssea (TMO), aprovado pela protocolos IACUC institucionais (Nota: O sucesso deste protocolo requer a utilização de qualquer tipo de célula marcada (s) como alvo para análise multiespectral, e para facilitar a análise a jusante, pode-se explorar qualquer genética ou rotulagem celular estável. Sugerimos que qualquer célula, tecido ou órgão pode ser aplicado para ser de um modelo de transplante e que o transplante pode conter tantas populações únicas rotulados como a pesquisa considere útil. Além disso, vários sistemas de telefonia celular marcado , tais como aqueles encontrados em ratinhos transgénicos contendo linhagem múltipla de restrição marcado por fluorescência-populações pode ser concebido para eliminar as complicações de transplante para o estudo de certos estados patológicos.

1. Letalmente irradiar ratinhos receptores de BMT com uma única dose de 9,5 Gy, quatro horas antes da reconstituição com medula óssea do dador. (Receptores de BMT GFP deve ser de 6-10 semanas de idade).
2. Molhar a pele do rato com etanol 70% antes do clipping e descascando-o de volta para expor os membros posteriores com tesouras cirúrgicas estéreis. Remova toda a perna, incluindo a crista ilíaca na articulação sacro-ilíaca. Descarte a pé, cortando logo acima do tornozelo e, em seguida, remover completamente todos os músculos, ligamentos e excesso de tecido ósseo. Lave medula da crista da tíbia, e fibia ilíaca com uma agulha 23 G, utilizando 2% de FBS em PBS estéril (PBS-2). (Doadores de TMO RFP deve ser sacrificado de acordo com as normas institucionais.)
3. Fatia e suavemente esmagar o osso remanescente em fragmentos, usando um bisturi e uma pinça e, em seguida, colocar em tubo de 50 ml com 3 ug / ml de colagenase I por 1 hora a 37 ° C a 300 rpm.
4. Top fora do tubo com PBS-2 e recolher o sobrenadante para um novo tubo e combinam com células coradas. Girar para baixo a 250 rpm durante 5 min a 4 ° C.
5. Ressuspender as células em PBS-2 e filtra-se através de filtro de 40 nm de células. Neste ponto, as células podem ser marcadas por fluorest ativado celular (FACS), se alguém quiser manipular populações específicas para o TMO.
6. Ressuspender 2 x 10 ⁶ células por 100 mL PBS, por mouse. Use 29 G agulha para injetar sistemicamente em ratos GFP destinatário irradiados por cauda ou retro-orbital veia-bisel-side-up. Injetar um mouse com 100 mL PBS apenas como controle de enxerto. Use uma lâmpada de aquecimento para dilatar os vasos antes da injecção e usar um sistema de retenção de injecção na veia da cauda após a injecção. Tenha gaze estéril disponíveis para aplicar uma leve pressão para a injeção de pós cauda.
7. Três semanas após a BMT, recolha de sangue retro-orbital e analisar por citometria de fluxo, para confirmar a presença de células circulantes para GFP e a ausência de células circulantes RFP. O mouse de controle terão morrido neste momento.

2. Tumor Enxerto De acordo com as Diretrizes Institucionais IACUC

1. Grow ID8 células tumorais murinas ovário in vitro antes da injecção in vivo (1 x 10 ⁶ cvaras por mouse). Dia de injecção, Tripsinizar as células, lava-se com PBS e ressuspender em PBS a 1 x 10 ⁶ células por 100 ul.
2. Injetar células tumorais na cavidade intaperitoneal do mouse, agulha deve estar virado bisel-up. Esterilizar vista injeção com álcool 70%. Injetar no canto inferior esquerdo ou no quadrante inferior direito do abdômen (cranial e ligeiramente medial ao conjunto inferior dos mamilos abdominal de rato fêmea), evitar bater os órgãos. Contenha rato, agarrando pelo pescoço e segurando a cauda com o dedo mindinho ou anel. Os ratos podem ser anestesiados com isoflurano para este procedimento.
3. Sacrificar os ratos quando os sinais de pega do tumor, como ligeiro inchaço abdominal, são aparentes. Isso ocorrerá mais de 4-12 semanas.
4. Ressecção de tumores da cavidade IP. Os tumores dentro da cavidade será parecido com nódulos brancos sobre e ao redor da superfície dos órgãos. Com um bisturi, remove o tumor e coloque em um tubo / frasco de formol a 10% por 24 horas de fixação. Histológica preparação pode ser externalizadas a principal patologia / histologia se reagentes e materiais não estão prontamente disponíveis para inclusão em parafina e preparação da lâmina. Tecido Seção em 5-8 mM fatias em lâminas de vidro para procedimentos de coloração subseqüentes.

3. Multi-parâmetro Immunofluorescent Coloração

1. Preparar lâminas de controlo única cor para cada sonda fluorescente utilizado no experimento. Neste cenário, as quatro cores são usadas. Portanto, quatro slides para cada cor individual, bem como um slide para o controle de ruído de fundo e, finalmente, um slide para a combinação coloração completa. (Total de lâminas = 6) Todas as lâminas serão processados ​​de lado a lado de um modo idêntico para minimizar a variação experimental.
2. Asse secções de parafina, a 56 ° C durante 1 hora.
3. Lavagem das lâminas 3x 10 min em xileno.
4. Lavar 2x 5 min 100% de etanol.
5. Lavar 1x 3 min 95% de etanol
6. Lavar 1x etanol min90 2%.
7. Lavar 1x etanol min70 2%.
8. Wash 1x 2 min em água. Lentamente mergulhe o suporte de coloração dentro e fora da água 10x.
9. Durante a última série de lavagem, tampão citrato de sódio pré-ferver por 2 minutos (no microondas). (Pode substituir com tampão de tris-EDTA, dependendo dos anticorpos em uso)
10. Ferver as lâminas durante 20 minutos em tampão de citrato de sódio (10% em micro-ondas de energia ou de uma panela de pressão). Se tampão ferver, desligue microondas e deixe descansar.
11. Remover da fonte de calor e deixar os slides descansar por 30 min no tampão citrato de sódio para esfriar.
12. Lavar as lâminas em água por 5 min.
13. Mark em torno de secções de tumor com Pap Pen e colocar 2% BSA / 1% FBS ácido maleico tampão de bloqueio por 1 hora. Prepare os slides individualmente, para não deixá-los secar durante esta etapa.
14. Preparar anticorpos primários a diluição óptima em tampão de bloqueio. (Se os anticorpos em uso são de espécies diferentes (ou IgG-cadeia variação ex: IgG1 IgG2a vs da mesma espécie), eles podem ser utilizados em combinação durante quantoingle período de incubação. Se as espécies de anticorpos se sobrepõem, então as incubações devem ser realizadas sequencialmente de minimizar cruzada de anticorpos de reacção.)
15. Neste ponto, deixar dois slides com apenas tampão de bloqueio. Estas duas lâminas servirá como controle sem mácula e controle de mancha nuclear. Os outros controles de cor individuais serão incubadas com anticorpos primários individuais. Apenas a corrediça análise terá uma combinação de anticorpos primários.
16. Incubar com o anticorpo primário em uma caixa de câmara de humidade, num agitador lento rotativo a 4 ° durante a noite (~ 16-20 h) (Nota: quando se trabalha com 4 + fluoróforos, coloração sequencial ou conjugação directa pode ser necessário para minimizar cruzada de anticorpos de reacção . Sob estas circunstâncias, repetir os passos 1,16-1,21 até todos os anticorpos são aplicadas às lâminas.)
17. Lave as lâminas durante 10 min em PBST (2x) suavemente sobre shaker
18. Enquanto lavagem vai, prepare AlexaFluor 488, 594 e 647 anticorpos secundários para uma diluição finalde 1:1000 em tampão de bloqueio. (Certifique-se que estes anticorpos e diluições são mantidos a 4 ° C e no escuro em todos os momentos para preservar a fluorescência através de lotes e ao longo do tempo.)
19. Sobre as lâminas de controlo de cor individuais, coloque diluições AlexaFluor individuais correspondentes as espécies do anticorpo primário utilizado. Todos os anticorpos secundários serão colocados na corrediça análise. As lâminas de controlo manchadas não coradas eo nucleares permanecerá com tampão de bloqueio ao longo desta etapa.
20. Incubar em uma caixa de câmara de humidade (cobertas com folha de alumínio para evitar a exposição à luz) num agitador rotativo lento à TA durante 2 horas.
21. Lave as lâminas por 5 min em PBST (2x) suavemente em shaker. Cubra com papel alumínio para proteger da luz.
22. Adicionar DAPI (1:10.000) por 1 min para o slide de DAPI eo slide análise. Cubra com papel alumínio para proteger da luz. As outras lâminas podem ser deixadas cobertas nos recipientes de lavagem.
23. Lava-se a dois DAPI-incubadasslides em um recipiente separado para o primeiro 5 min de lavagem, para não contaminar os outros slides com DAPI mancha. Para a segunda lavagem de 5 minutos, as lâminas podem ser combinados em PBST (todas as lavagens devem ser realizadas num agitador). Cubra com papel alumínio para proteger da luz.
24. Lâminas brevemente mergulho na água antes (1,5 espessura com meios aquosos de montagem para preservar a fluorescência)-escorregar cobertura
25. Deixe secar 3 horas no escuro à temperatura ambiente.
26. Selar as bordas da lamínula com endurecedor de unhas. (Não use unha polonês como a acetona pode saciar o sinal fluorescente).
27. Analisar os slides imediatamente ou armazenar a 4 ° C para análise futura.

4. Imagens multiespectrais

1. Coletar imagens multiespectrais utilizando uma câmera Nuance EX (contendo um filtro sintonizável de cristal líquido) em uma Olympus X-63 microscópio vertical com o software Nuance para a coleta de dados.
2. Coletar imagens utilizando uma objectiva de óleo para aumentar a resolução.
3. Iniciatival set-up inclui definir a faixa espectral para cada fluoróforo em uso.
   1. Para 4 cores:
      1. DAPI: 420-480nm
      2. AF488: 490-580nm
      3. AF594: 590-640nm
      4. AF647: 650-720nm
4. Tomar uma imagem inicial da lâmina análise para obter os tempos de exposição adequados para cada uma das gamas espectrais.
5. Criar "biblioteca espectral" que o software utilizado para identificar e separar a relação sinal-ruído dos fluoróforos um do outro e do sinal de fundo. (Nota: Cada fluorocromo deve ter sua própria único slide controle de cor, a fim de montar uma biblioteca espectral de comprimento de onda com curvas apropriadas para assegurar a devida análise do conjunto de dados Exemplo: 3 fluoróforos = 4 lâminas de controlo; 5 fluoróforos = 6 lâminas de controlo.).
   1. Imagem do slide unstained primeiro. Este slide será designado dentro do librar espectraly como pano de fundo.>
   2. Imagem do DAPI somente deslizar segundo. Este slide será usado para designar os núcleos DAPI-manchadas com a ferramenta de "desenhar" e será salvo dentro da biblioteca espectral como DAPI.>
   3. Imagem a deslizar terceiro AF488-only. Este slide será usado para designar as regiões AF488-coradas com a função "desenhar" e será salvo dentro da biblioteca espectral como AF488.>
   4. Imagem do AF594 somente deslizar quarta. Este slide será usado para designar as regiões AF594-coradas com a função "desenhar" e será salvo dentro da biblioteca espectral como AF594.>
   5. Imagem do AF647 somente deslizar quinto. Este slide será usado para designar as regiões AF647-coradas com a função "desenhar" e será salvo dentro da biblioteca espectral como AF647.>
   6. Após a recolha de cada componente espectral individual,salvar a biblioteca espectral eo protocolo.>
6. Uma vez que a biblioteca espectral estiver concluída, encontrar regiões de interesse no slide análise no microscópio e recolher / salvar imagens.>

5. Análise Quantitativa de imagens multiespectrais

1. Importar uma variedade representativa de imagens Nuance adquiridos usando InForm Software.
2. Abra a biblioteca espectral salvo como dirigido pelo programa
3. Identificar regiões de tecido de interesse a ser analisado. (Por exemplo, tecido de tumor contra o tecido adiposo).
4. Identificar as células individuais com base em DAPI-mancha. Citoplasma será definido automaticamente com base na forma do núcleo.
5. Escolha a intensidade de fluorescência de leitura de escolha para cada parâmetro fluorescente (por exemplo, média, desvio padrão)
6. Batch a imagens adquiridas e deixar o processo de software usando o algoritmo proposto.
7. Quando o processamento de imagem está terminado, fundiros arquivos de resultados.
8. Abra os resultados no Excel (ou qualquer outro pacote de software analítico) e trace duas intensidades fluorescentes uns contra os outros no eixo XY. Cada intensidade de fluorescência é dado por célula. As células positivas dupla aparecerá no quadrante superior direito. O usuário deve definir as intensidades fluorescentes de base.

Resultados

Usando uma técnica de imagem multiespectral para analisar tumores enxertados em nosso modelo de camundongo transgênico BMT, somos capazes de discernir os componentes do tumor do estroma, que são de origem medula óssea. O TMO foi confirmada inicial três semanas pós-transplante, por citometria de fluxo (Figura 1). Ortotopicamente injetado tumores ovarianos não marcados seguinte BMT confirmações de enxertia foram excisadas e fixadas em formalina seis semanas após a injeção inicial do tumor. Se?...

Discussão

Aqui nós descrevemos a aplicação de imagens multiespectrais que descrevemos como interrogatório MIMicc-multiespectral de composições celulares diversificadas, para analisar as da medula óssea componentes estromais derivadas do microambiente do tumor, porém essa metodologia e conceito pode ser aplicado a decifrar outros elementos celulares que compõem um complexo tecidos, tais como os observados durante a cicatrização de feridas ou reacções durante um tecido regenerativo. Nestas experiências que utilizam ra...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
.2 μm filter	Fisher	09-740-35A
10 ml lure lock	BD	309604
25 G needle	Cardinal	BF305122
40nm filter	BD	352340
50 ml conical tube	Fisher	1495949A
Alexafluor 488-ms1	invitrogen	A21121
Alexafluor 594-Rb	invitrogen	A21207
Alexafluor 647-ch	Invitrogen	A21449
BSA	Sigma	A7906-500G
Cover slips	Corning	2940-243
CRI-Nuance	Caliper Life Sciences
Dapi	Invitrogen	D1306
DMEM	CellGro	10-017-CV
Ethanol	Dharmacon	4004-DV
FBS	invitrogen	16000-044
GFP-ms1	Abcam	ab38689
Insulin needle	BD	329424
Maleic acid	Acros	100-16-7
Moisture chamber box	Evergreen	240-9020-Z10
Mounting media	dako	S3023
Nail hardener	Sally Hansen	2103
Pap pen	Abcam	Ab2601
Pen/Strep L Glut	invitrogen	10378016
Steril PBS	invitrogen	14040-182
Trypsin	invitrogen	252000-56
Blocking Buffer maleic acid 14.51 g NaCl 10.95 g NaOH pellets (to 7.5pH) 9+g Distilled water 250 ml *add 0.2% Tween-20 to 1x solution for blocking buffer with 2%BSA/2%FBS. Stir and filter. Antigen retrieval buffers: Tris-EDTA Buffer (10 mM Tris Base, 1 mM EDTA Solution, 0.05% Tween 20, pH 9.0) Tris Base 1.21 g EDTA 0.37 g Distilled water 1000 ml (100 ml to make 10x, 50 ml to make 20x) Tween 20 0.5 ml *Store at RT for 3 months or at 4 ° C for longer Sodium Citrate Buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0) Tri-sodium citrate (dihydrate) 2.94 g Distilled water 1000 ml HCl (adjust pH to 6.0) 1N Tween 20 0.5 ml