Bestimmung mikrobieller extrazelluläre Enzymaktivität in Wasser, Böden und Sedimente mit hohem Durchsatz Mikrotiterplatten-Assays

Zusammenfassung

Mikroplatten-basierten Verfahren werden für die farbmetrische oder fluorimetrische Analyse der extrazellulären Enzymaktivität beschrieben. Diese Verfahren ermöglichen die Schnelltest an einer solchen Tätigkeit in großer Zahl von Umweltproben in einem überschaubaren Zeitrahmen.

Zusammenfassung

Ein Großteil der Nährstoffkreislauf-und Kohlenstoffverarbeitung in natürlichen Umgebungen erfolgt durch die Aktivität extrazellulärer Enzyme, die von Mikroorganismen freigesetzt. So kann die Messung der Aktivität der extrazellulären Enzyme Einblicke in den Sätzen der Ökosystemebene Prozesse, wie den Abbau organischer Materie oder Stickstoff-und Phosphor-Mineralisierung geben. Assays der extrazellulären Enzymaktivität in Umweltproben beinhalten typischerweise das Aussetzen der Proben gegenüber künstlicher kolorimetrische oder fluorometrische Verfolgung Substrate und die Geschwindigkeit der Substrathydrolyse. Hier beschreiben wir auf Mikrotiterplatte Methoden für diese Verfahren, die die Analyse einer großen Anzahl von Proben innerhalb eines kurzen Zeitrahmens zu ermöglichen. Die Proben dürfen mit künstlichen Substraten innerhalb von 96-Well-Mikroplatten oder tiefe Well-Mikroblöcke reagieren, und die Enzymaktivität wird anschließend durch Absorption oder Fluoreszenz der resultierende Endprodukt unter Verwendung eines typischen Mikro reade bestimmtr oder Fluorometer. Solche hohen Durchsatzverfahren erleichtern nicht nur Vergleiche zwischen den räumlich getrennten Stellen oder Ökosysteme, sondern auch die Kosten für solche Tests wesentlich zu reduzieren, indem Gesamtreagenzienvolumina pro Probe benötigt.

Einleitung

Mikroorganismen wie Bakterien und Pilzen zu erhalten Nährstoffe und Kohlenstoff von komplexen organischen Verbindungen, durch die Produktion von extrazellulären Enzymen. Diese Enzyme hydrolysieren typischerweise Polymere in kleinere Untereinheiten, die in die Zelle aufgenommen werden können. Daher wird bei einer ökologischen Ebene sind diese mikrobiellen extrazelluläre Enzyme, die für einen Großteil der Nährstoffmineralisierung und den Abbau organischer Materie, die in natürlichen Umgebungen auftritt verantwortlich. Enzyme wie Cellobiohydrolase (CBH) und β-Glucosidase sind für Celluloseabbau und arbeiten gemeinsam, um die Hydrolyse von Cellulose zu Glucose ^1,2, das eine verwertbare Kohlenstoffsubstrat zur Aufnahme und mikrobielle Assimilierung bietet katalysieren. Das Enzym Phosphatase Mitteilungen löslichen anorganischen Phosphatgruppen von Organophosphaten wesentlichen Mineralisierung Phosphat und macht es für die Verwendung durch die meisten Organismen ³ verfügbar. Andere Enzyme, wie N-Acetylglucosaminidase (NAGase), sind important in Chitin-Abbau und kann sowohl Kohlenstoff und Stickstoff für die mikrobielle Erwerb ⁴ verfügbar zu machen.

Eines der Verfahren zur Bestimmung von mikrobiellen extrazelluläre Enzymaktivität in natürlichen Umgebungen ist die Verwendung von künstlichen p-Nitrophenyl (p NP) verbunden Substrate, ein Ansatz, der ursprünglich entwickelt wurde, um ^{Boden-5-Phosphatase-Aktivität} zu erkennen. Dieser Ansatz beruht auf dem Nachweis einer farbigen Endprodukt, p-Nitrophenol, die freigesetzt wird, wenn das künstliche Substrat durch das geeignete Enzym hydrolysiert. Das p-Nitrophenol kann anschließend kolorimetrisch durch Messung der Absorption bei etwa 400-410 nm quantifiziert werden. Dieses Verfahren ist seit angewandt, um andere Enzyme, wie NAGase ⁶ zu erfassen, und wurde in verschiedenen Studien verwendet worden betrachten mikrobielle extrazelluläre Enzymaktivität in Böden und Sedimenten ^7-9.

Ein alternativer Ansatz, die originall wary entwickelt, um extrazelluläre Glucosidase-Aktivität zu beurteilen in Gewässern ^10,11 macht Gebrauch von 4-Methylumbelliferon (MUB) verbunden Substraten. Das Endprodukt freigesetzt (4-Methylumbelliferon) ist stark fluoreszierend und können mit einem Fluorometer bei einer Anregungs / Emissionseinstellung um 360/460 nm detektiert werden. Eine Vielzahl von MUB vernetzt künstlichen Substrate zur Verfügung stehen, wodurch die fluorometrische Messung der Aktivität mindestens so viele Enzyme (z. B. β-Glucosidase, Cellobiohydrolase, Nagase Phosphatase) wie mit dem p-Substrat NP kolorimetrischen Verfahren analysiert werden. Andere mikrobielle extrazelluläre Enzyme, wie das Protein abbau Leucin-Aminopeptidase kann fluorometrisch unter Verwendung von 7-Amino-4-methyl (COU) verbunden Substrate getestet werden. Sowohl MUB-und COU-verknüpften Substraten wurden verwendet, um die Enzymaktivität in verschiedenen terrestrischen und aquatischen ^12,13 Proben zu bestimmen.

Während frühere Studien haben described fluorometrischer oder farbmetrischen Mikro Ansätze zur extrazellulären Enzymaktivität ¹⁴ zu bestimmen, es gibt eine Notwendigkeit für eine klare Darstellung, wie solche Tests durchzuführen. Hier zeigen wir, Verfahren für eine Hochdurchsatz-Mikrotechniken für die Analyse von extrazellulären Enzymaktivität in Böden und Sedimenten unter Verwendung des kolorimetrischen p-NP verbunden Substrate Ansatz und in natürlichen Gewässern mit Hilfe der Fluoreszenz MUB-verknüpfte Substrate Technik. Wir konzentrieren uns auf die Messung der Aktivitäten der β-Glucosidase, NAGase und Phosphatase als diese Enzyme an Kohlenstoff, Stickstoff, Phosphor und Radfahren gebunden sind. Jedoch können die hier beschriebenen Verfahren auf die Messung anderer extrazellulärer Enzyme mit verschiedenen künstlichen Substrate aufgebracht werden.

Protokoll

Farbmetrische Analyse der extrazellulären Enzymaktivität in Böden und Sedimenten

1. Vorbereitung der Substrat-und Pufferlösungen für farbmetrische Analysen der Enzymaktivität

1. Vorbereitung 50 mM Acetat-Puffer (pH 5,0-5,5), die durch Mischen von 50 ml 0,1 M Essigsäure (2,87 ml Eisessig in 500 ml Wasser), 150 ml 0,1 M Natriumacetat und 200 ml destilliertem H ₂ O. PH-Wert auf 5,0-5,5 mit 0,1 M Essigsäure, falls erforderlich.
2. Es wird eine Lösung von 1 M Natriumhydroxid (NaOH) in destilliertem H ₂ O.
3. Vorbereitung p NP-verknüpften Substratlösungen in 50 mM Acetat-Puffer. Um zu testen Phosphatase vorzubereiten 5 mM p NP-Phosphat in 50 mM Acetat-Puffer, dem Test β-Glucosidase vorzubereiten 5 mM p NP-β-glucopyranosid, dem Test vorzubereiten NAGase 2 mM pNP-β-N-acetylglucosaminide. Bereiten Sie alle Substratlösungen in sterilen 15 ml oder 50 ml Zentrifugenröhrchen. Lösungen bei 4 ° C für 2-3 Wochen gelagert werden.

2. Bestimmung der Absorption zu einem Standard zu p NP Konzentration konvertieren

1. Standardlösungen von p-Nitrophenol in 50 mM Acetat-Puffer. Konzentrationen von 0,025 bis 1 mM sollte reichen.
2. Über drei Wiederholungen von 100 ul jeder Konzentration zu einer klaren 96-Well-Mikroplatten. In 10 ul 1 M NaOH und 190 ul destilliertem H ₂ O in jede Vertiefung.
3. Rekord Absorption bei 410 nm mit einem Mikroplatten-Reader.
4. Multiply-Konzentrationen in der Standardkurve von 0,3 bis umol p NP pro 300 ul Reaktionsvolumen zu erhalten. Zeichnen Sie eine Kurve der Absorption gegen umol p NP. Die Steigung der Kurve dient als Umrechnungsfaktor (C), die Absorption beziehen wird von p NP in jedem Enzymreaktion umol.

3. Die Durchführung der Enzym-Assay

1. Boden, bereiten eine Aufschlämmung von jeder Probe in einem sterilen 15 ml-Zentrifugenröhrchen auf einer Konzentr untersucht werdenation von etwa 1 g / ml ^-1 unter Verwendung von 50 mM Acetatpuffer. Für Sedimente, fügen Sie genug Acetatpuffer der Schlamm leicht pipettierbaren zu machen. Das genaue Volumen der Aufschlämmung benötigt wird, gemäß der Anzahl von Enzymen getestet variieren, aber ein Minimum von 5 ml empfohlen. Vortex jeder Brei, bis alle Klumpen von Boden oder Sediment aufgelöst haben und beachten Sie die endgültige Volumen.
2. Wiederwirbel jeder Aufschlämmung pipettiert und sofort 150 &mgr; l in jede von sechs Vertiefungen auf einer 96-well Deepwell-Block (1). Es ist wichtig, Vortex gründlich und häufig, um Schmutzpartikel in der Schwebe zu halten. Lassen Sie mindestens zwei Vertiefungen pro Block leer als Substrat Kontrolle dienen. Hinweis: Clip das Ende von Pipettenspitzen mit einer Schere vor dem Pipettieren als Boden Schlämme neigen, um Tipps zu verstopfen. Vorbereitung einer 96-Well-Block für jedes Enzym untersucht werden.
3. Pour etwa 5 ml Acetatpuffer in einer Pipettenreservoir und einen 8-Kanal-Pipette 150 ul des Puffers auf den L hinzufügenast zwei Vertiefungen jeder Probe (diese wird Probenpuffer steuert) und die beiden Substrat-Kontrollvertiefungen (Fig. 1)
4. Pour etwa 10 ml des geeigneten p NP-Substratlösung in eine Pipettenreservoir und einen 8-Kanal-Pipette 150 ul der Substratlösung zu den ersten vier Vertiefungen für jede Probe und den beiden Substratkontrollvertiefungen hinzu (Abbildung 1). Die verstrichene Zeit, wenn die Reaktion beginnt, wenn die Substratlösung zugegeben.
5. Platten bei RT (22 ° C) für 0,5-4 Stunden. Genaue Inkubationszeit variiert je nach Aktivität in den Proben und dem Enzym, die untersucht werden soll, variieren. Für die meisten Böden und Sedimenten, Phosphatase und β-Glucosidase Inkubationszeiten von 0,5-1,5 h, während NAGase und andere Enzyme benötigen Inkubationszeiten von> 2 Stunden.
6. Während Tests sind Inkubation vorbereiten klare 96-Well-Mikroplatten, um die Absorption zu lesen. Bereiten Sie eine Mikroplatte für jeden Deepwell-Block (dh für jede Enzyme getestet). Je 10 ul 1 M NaOH und 190 ul destilliertem Wasser in jedes Well der Mikrotiterplatte. Hinweis: NaOH verlangsamt die enzymatische Reaktion und erhöht den pH-Wert, der die Farbe des p NP während der Reaktion frei verbessert.
7. Nach der Inkubation zentrifugiert, die 96-Well-Blocks bei 2000-5000 × g für 5 min pelletiert Bodenteilchen.
8. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette zu 100 ul von jedem gut zurückziehen, wobei darauf geachtet, um das Pellet zu vermeiden, und übertragen sie an die entsprechende gut vorbereitet klare 96-Well-Mikroplatten.
9. Schalten Sie den Mikroplatten-Reader und die Einsetzung von Software notwendig. Rekord Absorption bei 410 nm auf. Wenn die Absorption einer bestimmten auch über dem linearen Nachweisgrenze des Plattenlesegerät, verdünnen, dass auch 1:1 mit Wasser und Re-Maßnahme. Wenn die Absorption noch zu hoch ist, sollte der Test mit einer kürzeren Inkubationszeit wiederholt werden.

4. Bestimmung der Trockenmasse der Proben

1. Je 1 ml jeder sampl E Aufschlämmung in eine vorher gewogene Aluminiumschale.
2. Trocken in einem 75 ° C Trockenschrank für 48 Stunden und wiegen. Subtrahieren Sie das Gewicht der Pfanne von diesem Wert um die Trockenmasse an Boden oder Sediment in 1 ml der Suspension zu erhalten. Multiplizieren mit einem Faktor von 0,15, die Trockenmasse der Probe in 150 ul zu jedem im Enzymtest zugesetzt gut bestimmen.

5. Berechnung der Enzymaktivität pro Trockenmasse Boden oder Sediment

1. Berechnen endgültige Extinktion jeder Probe durch Subtraktion des Proben-Kontrolle Extinktion der Probe Assay Absorption. Wenn Substrat Kontrollen haben eine hohe Absorption (ca.> 0.060) subtrahiert dann die auch.
2. Berechnen Enzymaktivität in umol h ^-1 g ^-1 Trockenmasse aus der Gleichung:

Die Enzymaktivität = Schluss Absorption / (C x Inkubationszeit x Probentrockenmasse)

Leuchtstoff-Analyse der extrazellulären Enzymaktivität in natürlichen Gewässern

tle "> 1. Herstellung des Substrats, Standard und Pufferlösungen für Fluorometric Analysen der Enzymaktivität

1. Planen 200 uM Lösungen der MUB-verknüpften Substraten (z. B. 4-MUB-β-glucopyranosid, 4-MUB-phosphat, 4-MUB-N-Acetyl-β-D-glucosaminid) durch Auflösen des geeigneten Substrats in sterile (autoklaviert) destilliert H ₂ O in 15 ml sterile oder 50 ml Zentrifugenröhrchen. Wickeln Sie Rohre in Aluminiumfolie, um Licht auszuschließen und lagern im Kühlschrank vor der Verwendung. Grund sollte stabil sein, für mindestens 1 Woche, wenn auf diese Weise gespeichert.
2. Bereiten Sie eine MUB Standard, indem sie eine Stammlösung von 100 uM 4-Methylumbelliferon in sterilem destilliertem H ₂ O. Kühl lagern, in Bernstein oder Folie umwickelt Flasche. Unmittelbar vor der Verwendung, verdünnen das 100 uM Stammlösung von 1/10 in sterilem H ₂ O, um eine Arbeitslösung von 10 uM für Enzymtests zu machen.
3. Bereiten Sie eine Stammlösung von 100 mM Bicarbonat-Puffer durch Auflösen von 8,4 g NaHCO _{3 in 1 LH 2 O und Autoklavieren. Verdünnen dieser Stammlösung 1/20 in sterilem H 2 O als erforderlich, um eine Arbeitslösung von 5 mM für Enzymtests zu machen.}

2. Organisieren von Wasserproben auf einer 96-Well Mikroplatten-Schwarz

1. Organisation einer Mikrotiterplatte für jedes Enzym nach dem in 2 gezeigten Beispiel. Beachten Sie, dass damit eine ausreichende Replikation, Standards und Kontrollen, kann dieses Verfahren die Aktivität eines einzelnen Enzyms bis zu neun Wasserproben auf einer 96-Well-Mikroplatte schwarz testen.
2. Pour etwa 5 ml der ersten Probe in einer Pipettenreservoir und einen 8-Kanal-Pipette auf ul in alle Vertiefungen in Spalte 1 der Mikrotiterplatte (n) pipette200. Entsorgen Sie gebrauchte Pipettenspitzen und wiederholen Sie so für jede Probe benötigt, um Spalten 1-9 zu füllen.

3. Einrichten Probe, Standard, Quench und Substrat Kontrollen

1. Stellen Sie die Kontrollen, für Proben, Standardkontos, Substrat und Abschrecken auf der gleichen schwarzen Mikroplatte wie die Proben (Abb. 2).
2. Probenkontrollen enthalten Beispiel Wasser und Bikarbonat-Puffer und werden nicht in den Tätigkeits Berechnungen verwendet, aber wird zeigen, Lesen Konsistenz im gesamten Verlauf des Experiments. Die Quench-Kontrollen bestehen aus Wasser und einer Probe Standardmenge des Fluoreszenzmarkierung und werden verwendet, um die Beugung der Fluoreszenz-in-Wasser-Probe zu messen. Substrat-und Standard-Steuerelemente werden entweder aus Substrat-gebundenen oder die Standard-Fluoreszenzmarkierung sind, und Bicarbonat-Puffer hergestellt.
3. Gießen Sie ca. 5 ml 5 mM Bicarbonat-Puffer in eine saubere Pipettenreservoir. Je 50 ul Puffer in Mikrotitervertiefungen 1 bis 9 in Zeilen D und E, um zwei replizieren Vertiefungen der Probenkontrollen pro Probe. Pipettenspitzen wechseln übertragen dann 200 ul von Bikarbonat-Puffer in Vertiefungen 10 bis 12 in den Reihen A und H.
4. Reduzieren Umgebungslicht durch Dimmen oder Ausschalten lights als Fluoreszenzstandard ist lichtempfindlich.
5. Gießen Sie ca. 5 ml 10 uM 4-Methylumbelliferon in eine saubere Pipettenreservoir. Je 50 ul in Mikrotitervertiefungen 1 bis 12 in Reihe H, und in die Vertiefungen 1 bis 9 in Zeilen G und F bis drei Wiederholungen der Quench-Kontrollen pro Probe und insgesamt Standardkontrollen bilden. Entweder legen Sie die Mikrotiterplatte in der Dunkelheit oder Abdeckung mit einem undurchsichtigen Deckel, Licht Abbau von MUB reduzieren.
6. Schalten Sie das Fluorometer und Set-up notwendige Software bereit, vor der Zugabe des Substrats zu lesen sein. Hinweis: Einige Fluorometer Glühbirnen kann eine Aufwärmzeit von 3 Minuten oder mehr benötigen.
7. Gießen ca. 5 ml der entsprechenden MUB vernetzt Substrat (z. B. 4-MUB-phosphat) in eine saubere Pipettenreservoir. Verwenden Sie ein 12-Kanal-Pipette auf 50 ul in Mikrotitervertiefungen 1 bis 9 in Zeilen B und C pipettieren 1 bis 12 in Reihe A, und in die Vertiefungen zu drei Wiederholungstests für jede Probe und drei Substrat Kontrollen bilden. SOFORTy fahren Sie mit 4.1, Aufnahme Fluoreszenz Schritt.

4. Aufnahme Fluoreszenz

1. Lesen Sie die Anfangsfluoreszenz unmittelbar nach Substrat Neben der Mikro. Nach der Lektüre Fluoreszenz, inkubieren Sie die Platte bei RT (22 ° C) entweder in der Dunkelheit oder mit einem undurchsichtigen Deckel, Licht Abbau von MUB reduzieren bedeckt.
2. Die Inkubationszeit, um den maximal möglichen Enzymaktivität in einer Probe zu messen muss, hängt von der Enzymkonzentration in der Probe abhängt. Da dies bekannt ist, bevor der Test abgeschlossen ist, wird die Mikroplatte müssen an mehreren Zeitschritten gelesen werden. Typischerweise liest in Intervallen von 10-15 Minuten über den Verlauf von 1 Stunde ist für viele Enzyme akzeptabel, obwohl Proben mit sehr hoher Aktivität bestimmter Enzyme können vor 10 min Peak.
3. Lesen Fluoreszenz in der Mikroplatte an Ihrer gekennzeichneten Abständen für mindestens 1 h weiter. Achten Sie darauf, halten die Mikroplatte abgedeckt oder in der Dunkelheit zwischen Lesens.

5. Berechnung der Enzymaktivität pro Volumen Wasser

1. Für jede Probe in jedem Zeitintervall berechnen: meine erste Probenfluoreszenz (Brunnen D und E), die mittlere endgültige Probe Fluoreszenz (Brunnen AC), die mittlere Standard Fluoreszenz (Brunnen H10-11), und die mittlere Steuer löschen Fluoreszenz (Brunnen FG).
2. Für jedes Zeitintervall berechnet Enzymaktivität in nmol h ^-1 ml ^-1 aus der Gleichung:

Die Enzymaktivität = (mittlere Probenfluoreszenz - meine erste Probenfluoreszenz) / ((mittlere Standard Fluoreszenz / 0,5 mol) x (Mittelwert stillen Steuer Fluoreszenz / mittlere Standard Fluoreszenz) x (0,2 ml) x (Zeit in Stunden))

3. Prüft die Aktivitätswerte für jeden Zeitschritt berechnet. Bestimmen Endpotential Aktivität aus der Zeitstufe mit der höchsten Aktivität. Wenn Aktivitätswerte weiter zunehmen, dann kann später Schritte erforderlich; wenn Aktivitätswerte throug fallenhout der Verlauf der Flucht, dann wieder laufen mit kürzeren Zeitschritten. Schluss Aktivität in nmol Substrat verbraucht h ^-1 ml ^-1 kann aber bis skaliert werden, um auszudrücken, wie umol h ^-1 L ^-1.

Ergebnisse

Böden und Gewässern Sedimente haben typischerweise merkliche Mengen an extrazellulären Enzymaktivität als Folge der beigefügten Mikrobengemeinschaften (Biofilme) wachsen auf der Oberfläche der Teilchen. Fig. 3 zeigt, wie diese Aktivität sich in Abhängigkeit von der Größe der Partikel von der Oberfläche Sediment eines dritten erhaltene Ordnung im nördlichen Mississippi, USA. Eine frühere Studie hat gezeigt, dass die bakteriellen Gemeinschaften auf Sedimentpartikel aus diesem Strom kann in dr...

Diskussion

Die Bestimmung der Aktivität einer Vielzahl von mikrobiellen extrazelluläre Enzyme in Böden und Sedimenten können nützliche Einblicke in Raten von Nährstoffmineralisierung und organische Stoffe Verarbeitung ^{17 vorzusehen.} Allerdings können Böden in ihren Feuchtigkeitsgehalt variieren, so ist es wichtig, den Boden Trockengewicht standardisieren Aktivität. Dies erfordert einen zusätzlichen Trocknungsschritt (typischerweise von zwei Tagen), über die einfache Messung der Enzymaktivität. Somit im Gegen...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS AND MATERIALS
Glacial acetic acid			Various suppliers
Sodium acetate			Various suppliers
Sodium hydroxide			Various suppliers
p-Nitrophenol	Fisher	BP612-1	Alternates available
p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate	Sigma	N3234	pNP-substrate
pNP-β-glucopyranoside	Sigma	N7006	pNP-substrate
pNP-β-N-acetylglucosaminide	Sigma	N9376	pNP-substrate
Clear 96-well microplates	Fisher	12-563-301	Alternates available
96-well deep well blocks	Costar	3958	Alternates available
Aluminum weigh pans			Various suppliers
Sterile 15 ml centrifuge tubes			Various suppliers
Sterile 50 ml centrifuge tubes			Various suppliers
4-Methylumbelliferone	Sigma	M1381
4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate	Sigma	M8883	MUB-substrate
4-MUB-glucopyranoside	Sigma	M3633	MUB-substrate
4-MUB-N-acetylglucosaminide	Sigma	M2133	MUB-substrate
Sodium bicarbonate			Various suppliers
Black 96-well microplate	Costar	3792
Pipette reservoir			Various suppliers
			EQUIPMENT
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge rotor	Eppendorf	A-4-81	For microplates/deep-well blocks
Microplate reader	BioTek	Synergy HT	Alternates available
Microplate fluorometer	BioTek	FLx 800	Alternates available
8-channel pipettor			Various suppliers