높은 처리량 마이크로 분석 실험을 사용하여 워터스, 토양 및 퇴적물에있는 미생물 세포 외 효소 활성의 결정

요약

마이크로 플레이트 기반 절차는 세포 외 효소 활성의 형광 또는 비색 분석을 위해 설명된다. 이러한 절차는 관리 기간 내에 환경 시료 다수 이러한 활동의​​ 신속한 분석을 허용한다.

초록

자연 환​​경의 영양 순환과 탄소 처리의 대부분은 미생물에 의해 발표 세포 효소의 활동을 통해 발생합니다. 따라서, 이러한 세포 외 효소의 활성 측정은 유기물 분해 또는 질소와 인 광물 등의 생태계 수준의 프로세스의 속도에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 환경 시료에서 세포 외 효소 활성의 분석은 일반적으로 인공 측색 또는 형광 기질에 샘플을 노출하고, 기판의 가수 분해 속도를 추적 포함한다. 여기에서 우리는 짧은 기간 내에 다수의 샘플의 분석을 할 수있는 절차를 마이크로 기반의 방법을 설명한다. 샘플은 마이크로 블록 마이크로 플레이트 또는 디프 웰 96 - 웰 내에 인공 기질과 반응 할 수 있으며, 효소 활성이어서 전형적인 마이크로 플레이트를 사용 Reade에 얻어진 최종 생성물의 흡수 또는 형광에 의해 결정된다R 또는 형광 분석기. 이러한 높은 처리 절차는 공간적으로 분리 된 사이트 또는 생태계 간의 비교를 용이하게, 또한 실질적으로 샘플 당 필요한 시약 전체적인 부피를 감소시킴으로써 그러한 분석법의 비용을 줄일뿐만 아니라.

서문

박테리아 및 곰팡이 등의 미생물 세포 효소의 생산을 통해 복잡한 유기 화합물의 영양분과 탄소를 얻을 수 있습니다. 이러한 효소는 전형적 셀로 취할 수 작은 소단위로 중합체를 가수 분해한다. 따라서, 생태 학적 수준에서, 이러한 미생물의 세포 외 효소는 영양 광물 및 자연 환경에서 발생하는 유기물 분해의 대부분에 대한 책임이 있습니다. 이러한 cellobiohydrolase (CBH) 및 β-글루코시다 제 등의 효소는 미생물의 흡수와 동화에 대한 utilizable 탄소 기판을 제공 ^1,2 포도당 셀룰로오스의 가수 분해를 촉진하기 위해 한마음으로 셀룰로오스 분해 작업을 위해 중요하다. 효소 포스는 유기 인계에서 수용성 무기 인산염 그룹, 기본적으로 인산염 광물 화하고 대부분의 생물 ^3에서 사용할 수있게 만들을 출시. 이러한 N-acetylglucosaminidase (나가세)와 같은 다른 효소는 importan 아르키틴 분해에 t, 탄소 및 미생물 인수 ^4에 해당하는 질소의 양을 만들 수 있습니다.

자연 환경에서 미생물의 세포 외 효소 활성의 분석을위한 절차 중 하나는 인공 P-니트로 페닐 (p의 NP) 연결된 기판 원래 토양 ^오 포스 파타 아제 ^활성을 검출하기 위해 개발 된 방법의 사용이다. 이 방법은 인공 기판이 해당 효소에 의해 가수 분해 될 때 방출되는 컬러 최종 제품, P-니트로 페놀의 검출에 의존한다. P-니트로 페놀은 이후 약 400 ~ 410 nm에서 흡광도를 측정하여 색도계로 정량화 할 수있다. 이 방법은 시간과 같은 나가세 ^6와 같은 다른 효소를 검출하도록 적용되고 있으며, 토양 및 퇴적물 ^7-9 미생물 세포 외 효소 활성을 찾고 다양한 연구에 사용되었다.

originall의 있었다 다른 방법Y는 ^{10,11 4} - 메틸 움 (MUB) 연결된 기판을 이용한다 수중 환경에서 세포 글루코시다 제 활성을 평가하기 위해 개발 하였다. (4 - 메틸 움) 릴리스 최종 생성물은 높은 형광이며 460분의 360 nm의 주변의 여진 / 배출 설정으로 형광 분석기를 사용하여 검출 될 수있다. MUB 연결된 인공 기판의 다양한 P는 NP-기판 비색 절차를 사용하여 정량 할 수있는 이상으로 많은 효소 (예 : β-글루코시다 아제, cellobiohydrolase, 나가세, 인산 가수 분해 효소)의 활동의 형광 측정을 허용, 사용할 수 있습니다. 이러한 단백질 분해 로이신 아미노 펩 티다 제와 같은 기타 미생물 세포 외 효소, 7 - 아미노 -4 - 메틸 쿠마린 (COU) 연결된 기판을 사용 fluorometrically 정량 할 수있다. MUB과 커플 연결 기판은 모두 다양한 육상 및 수생 샘플 ^{(12, 13)의} 효소 활성을 결정하는 데 사용되었다.

이전의 연구는 descr가있는 반면IBED 형광 또는 비색 마이크로 플레이트는 세포 외 효소 활성 ^(14)을 결정하기 위하여 접근 등의 분석을 수행하는 방법에 대한 명확한 프리젠 테이션에 대한 필요성이있다. 여기서 우리는 비색 P의 NP-결합 기판 방식을 사용하여 토양과 퇴적물 및 형광 MUB 연결된 기판 기술을 사용하여 자연수의 세포 외 효소 활성의 분석을위한 높은 처리량의 마이크로 기술을 수행하기위한 절차를 보여준다. 이 효소는 각각 탄소, 질소 및 인 순환에 연결 될 수있는 우리는 β-글루코시다 아제, 나가세, 및 포스 파타 아제의 활동의 측정에 초점을 맞 춥니 다. 그러나, 여기에 기재된 절차는 서로 다른 인공 기질을 사용하는 다른 세포 외 효소의 측정에 적용 할 수있다.

프로토콜

토양 및 퇴적물의 세포 외 효소 활성의 비색 분석

1. 효소 활성의 비색 분석 용 기판 및 버퍼 솔루션의 제조

1. 50 ㎖의 0.1 M 아세트산 (2.87 ㎖를 500 ㎖의 물에 빙초산)를 혼합하여 50 mM의보기 아세테이트 완충액 (pH 5.0-5.5)를 준비하고, 150 ㎖의 0.1 M 아세트산 나트륨 및 200 ㎖의 증류수 H ₂ O. 필요한 경우 0.1 M 아세트산으로 5.0-5.5로 산도를 조정합니다.
2. 증류 H ₂ O. 1 M 수산화 나트륨 (NaOH를)의 용액을 준비
3. 50 mM의 아세테이트 버퍼에 P는 NP-연결된 기판 솔루션을 준비합니다. 인산 가수 분해 효소는 50 mM의 아세테이트 버퍼에 5 밀리미터 P는 NP-인산염을 준비을 검정, β-글루코시다 아제가 5 밀리미터 P는 NP-β-글루 코피 라노를 준비 분석 실험하기 위해, 나가세가 2 ㎜ PNP-β-N-acetylglucosaminide을 준비 분석 실험 할 수 있습니다. 멸균 15 ML 50 ML의 원심 분리기 튜브의 모든 기판 솔루션을 준비합니다. 솔루션 2 ~ 3 주 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.

2. P는 NP 농도를 흡광도를 변환하는 표준의 결정

1. 50 mM의 아세테이트 버퍼에 P-니트로 페놀 표준 용액을 준비합니다. 농도는 MM의 0.025-1 다양합니다.
2. 분명 96 - 웰 마이크로 플레이트로 전송 각 농도 100 μL의 세 개의 반복을. 각 웰에 H ₂ O를 증류수 10 ㎕의 1 M NaOH를 190 μl를 추가합니다.
3. 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 410 nm에서 흡광도를 기록.
4. 0.3로 표준 곡선에 곱하기 농도는 300 ㎕의 반응 부피 당 μmoles P는 NP를 얻을 수 있습니다. P는 NP의 μmole 대 흡광도의 곡선을 그린다. 곡선의 기울기는 각 효소 반응에서 P는 NP 건 μmole하는 흡광도 관해서 것이다 변환율 (C)로서 기능한다.

3. 효소 분석을 실시

1. 토양, concentr에서 멸균 15 ㎖의 원심 분리 관으로 측정 될 각 샘플의 슬러리를 조제대략 1 ㎍ / ㎖ ^-1 50 mM의 아세테이트 버퍼를 사용 ATION. 퇴적물의 경우, 슬러리 쉽게 pipettable 할 수있을 정도로 충분한 아세테이트 버퍼를 추가합니다. 필요한 슬러리의 정확한 양이 정량 효소의 수에 따라 달라질 수 있지만, 5 ㎖의 최소 권장합니다. 소용돌이 토양 또는 퇴적물의 모든 덩어리가 분산 최종 볼륨을주의 할 때까지 각 슬러리.
2. 다시 소용돌이 각 슬러리 즉시 96 웰 deepwell 블록 (그림 1)에 6 각 웰에 150 μl를 피펫. 이 현탁액에 토양 입자를 유지하기 위하여 충분히 자주 와류 중요하다. 기판의 제어 역할을하는 빈 블록 당 적어도 두 개의 우물을 남겨주세요. 참고 : 토양 슬러리는 팁을 방해하는 경향 전에 피펫을 가위로 피펫 팁의 끝을 클립. 정량 할 각 효소에 대해 하나의 96 - 웰 블록을 준비합니다.
3. 피펫 저수지로 아세테이트 버퍼의 약 5 ㎖를 붓고 L에 버퍼 150 μl를 추가하는 8 채널 피펫을 사용하여AST 각 샘플의 두 우물 (이 샘플 버퍼 컨트롤 예정) 및 두 기판 제어 우물 (그림 1)
4. 피펫 저장조에 적합한 P NP-기질 용액 약 10 ㎖를 넣고 (도 1) 각 시료의 처음 네 개의 우물과 2 개의 기판 대조군 웰에 기질 용액 150 μL를 추가 8 - 채널 피펫을 사용한다. 반응이 빨리 기질 용액을 첨가로 시작으로 시간을 참고.
5. 0.5-4 시간 동안 RT (22 ℃)에서 번호판을 품어. 정확한 배양 시간은 활동 샘플 수준과 정량하는 효소에 따라 달라집니다. 나가세와 다른 효소> 2 시간의 배양 시간을 필요로하는 반면 대부분의 토양과 퇴적물, 인산 및 β-글루코시다는 0.5 ~ 1.5 시간의 배양 시간이 필요합니다.
6. 분석 흡광도를 읽을 마이크로 플레이트 분명 96 - 웰을 준비 배양하는 동안. (즉, 각 전자에 대한 각 deepwell 블록에 대해 하나의 마이크로 준비nzyme) 정량. 피펫 10 μL 1 M 수산화 나트륨과 마이크로 플레이트의 각 웰에 증류수 190 μL. 참고 : 수산화 나트륨은 효소 반응을 느리게하고, 반응시 방출되는 P는 NP의 색상을 향상시켜 pH를 발생시킵니다.
7. 배양 후, 토양 입자 펠렛 5 분 동안 2,000-5,000 XG에서 96 - 웰 블록을 원심 분리기.
8. 펠릿 않도록주의하면서, 각 우물에서 100 μl를 철회하는 멀티 채널 피펫을 사용하여 제조 된 명확한 96 - 웰 마이크로 플레이트에 잘 대응에 전송할 수 있습니다.
9. 마이크로 플레이트 리더를 켜고 필요한 소프트웨어를 설정합니다. 410 nm에서 흡광도를 기록. 특정 웰의 흡광도는 플레이트 리더의 선형 검출 한계 이상 물과 재 측정 랑은 잘 1:1로 희석합니다. 흡광도가 여전히 너무 높은 경우, 분석은 짧은 배양 시간에 따라 반복한다.

4. 샘플의 건조 질량의 결정

1. 각 SAMPL의 피펫 1 ㎖ preweighed 알루미늄 냄비에 전자 슬러리.
2. 48 시간 동안 75 ° C의 건조 오븐에서 건조하고 무게. 슬러리의 1 ㎖에 흙이나 퇴적물의 건조 질량을 얻기 위해이 값에서 팬의 무게를 뺍니다. 효소 분석에서 각 웰에 첨가 150 μL에 샘플의 건조 질량을 결정하기 위해 0.15의 계수를 곱한다.

5. 건조 토양의 질량 또는 침전물 당 효소 활성의 계산

1. 샘플 분석 흡광도에서 샘플 제어 흡광도를 뺀 각 샘플의 최종 흡광도를 계산합니다. 기판 컨트롤이 높은 흡광도가있는 경우 (약> 0.060) 다음 또한 사람들을 뺍니다.
2. μmoles 인사 ^{-1 들어} 건조 질량 ^-1 방정식에서의 효소 활성을 계산합니다 :

효소 활성 = 최종 흡광도 / (C의 X 배양 시간의 X 샘플 건조 질량)

자연수의 세포 외 효소 활성의 형광 분석

효소 활성의 형광 측정 분석을위한 TLE "> 1. 기판, 표준의 준비, 및 버퍼 솔루션

1. 멸균에 적합한 기판을 용해하여 MUB 연결된 기판 (예를 들어 4 - MUB-β-글루 코피 라노, 4 MUB - 인산, 4 MUB-N-아세틸-β-D-glucosaminide) 200 μM 솔루션을 준비합니다 (오토 클레이브) 증류수 멸균 15 ML 50 ML의 원심 분리기 튜브의 H ₂ O. 빛을 제외하고 사용하기 전에 냉장고에 저장하는 알루미늄 호일에 튜브를 감싸십시오. 이러한 방식에서 저장하는 경우 기판은 적어도 1 주 동안 안정해야한다.
2. 멸균 증류수 H ₂ O 100 μM 4 - 메틸 움의 원액을 만들어 MUB 표준을 준비 상점은 황색 또는 호 - 병 포장에 냉장. 사용하기 직전에, 효소 분석을위한 10 μM의 작업 솔루션을 만들기 위해 멸균 H ₂ O로 1 / 10로 100 μM 원액을 희석.
3. 탄산 수소 나트륨 <8.4 g을 용해시켜 100 mM의 중탄산 완충액 원액을 준비서브> 3 1 LH ₂ O 및 고압 증기 멸균에. 효소 분석을위한 5 mm의 작업 솔루션을 필요에 따라 멸균 H ₂ O로이 원액 1 / 20을 희석.

2. 96 - 웰 블랙 마이크로에 조직 물 샘플

1. 그림 2의 예를 다음 각 효소를 마이크로 플레이트를 구성합니다. 적절한 복제, 표준 및 제어를 허용,이 절차는 하나 96 - 웰 블랙 마이크로에 최대 9 개의 물 시료에 대해 하나의 효소의 활동을 분석 실험 할 수 있습니다.
2. 피펫 저수지에 첫 번째 샘플의 약 5 ㎖를 붓고 마이크로 (들)의 열 1의 우물 모두에 μL pipette200하는 8 채널 피펫을 사용합니다. 사용 피펫 팁을 취소하고 열 1-9을 채우기 위해 각 물 샘플에 대해 필요에 따라 반복합니다.

3. 샘플을 설정, 표준, 끄다, 기판 제어

1. 표준 샘플에 대한 계정 컨트롤을 설정의, 기판과 샘플과 동일한 블랙 마이크로 (그림 2)에서 담금질.
2. 샘플 컨트롤 샘플 물, 중탄산 버퍼를 포함하고, 액티비티 계산에 사용되지 않지만 실험 과정에 걸쳐 일관성을 읽고 설명 할 것이다. 급랭 컨트롤 샘플 물, 형광 태그의 기본 량으로 구성하고 샘플 물 형광의 회절을 측정하는 데 사용된다. 기판 및 표준 컨트롤 기판 연결 또는 표준 형광 태그, 각각 중탄산염 하나의 버퍼로 구성되어 있습니다.
3. 깨끗한 피펫 저수지에 5 mM의 중탄산염 버퍼의 약 5 ㎖를 붓는다. 피펫 마이크로 우물에 버퍼 50 μl의 1 행에서 9까지의 D와 E는 두 개의 샘플 당 샘플 컨트롤의 우물을 복제 형성한다. 변경 피펫 팁은 행의 (10 ~ 12) 우물에 수소 나트륨 완충액 200 μl를 전송 및 H.
4. 리를 흐리게하거나 해제하여 주변 조명을 감소형광 표준으로 ghts은 빛에 민감합니다.
5. 깨끗한 피펫 저수지에 10 μM 4 - 메틸 움의 약 5 ㎖를 붓는다. 피펫 마이크로 웰에 50 ㎕의 행 H 1부터 12까지, 그리고 우물에 행 G와 F에 1-9 샘플 당 급냉 컨트롤과 전체 표준 컨트롤의 세 개의 반복을 형성한다. 어둠 속에서 마이크로 플레이트를 배치하거나 MUB의 빛 저하를 줄이기 위해 불투명 뚜껑 커버 하나.
6. 형광 분석기의 전원을 켜고 설정 업 기판을 추가하기 전에 읽을 준비가되어 필요한 소프트웨어를. 참고 : 일부 형광 전구가 3 분 이상 예열 시간을 필요로 할 수있다.
7. 깨끗한 피펫 저수지에 해당 MUB 연결된 기판 (예를 들어, 4 - MUB - 포스페이트)의 약 5 ㎖를 붓는다. 각 샘플에 대한 세 가지 복제 분석 및 세 개의 기판 컨트롤을 형성하기 위해 1 행 B와 C에서 9까지의 1 행에 12를 통해 마이크로 우물에 50 μl를 피펫, 우물로하는 12 채널 피펫을 사용합니다. 이 immediatelY는 4.1, 기록 형광 단계로 진행합니다.

4. 기록 형광

1. 바로 마이크로에 기판을 첨가 한 후, 초기 형광을 읽어보십시오. 형광을 읽은 후에 하나 RT (22 ° C)에서 마이크로 플레이트를 품어 어둡거나 MUB의 빛 저하를 줄일 수있는 불투명 한 뚜껑으로 덮여있다.에게
2. 물 샘플에서 최대 전위 효소 활성을 측정하는 데 필요한 배양 시간은 샘플 내의 효소 농도에 의존 할 것이다. 분석이 완료되기 전에이 불명하기 때문에, 마이크로 플레이트는 다수의 시간 단계에서 판독되어야 할 것이다. 특정 효소에 대한 매우 높은 활성을 가진 샘플을 10 분 전에 피크 수 있지만 일반적으로 1 시간에 걸쳐 10 ~ 15 분 간격으로 읽는 많은 효소 허용됩니다.
3. 적어도 1 시간에 지정된 간격으로 마이크로 형광 계속 읽기. 마이크로 덮여 유지해야하거나 독서의 어둠 속에서 수의.

5. 물 부피당 효소 활성의 산출

1. 초기 샘플의 형광 (웰 D 및 E)를 의미하는, 평균 최종 샘플 형광 (웰 AC), 평균 표준 형광 (웰 H10-11), 평균 제어 형광 급냉 (웰 : 각각의 시간 간격으로 각각의 샘플을 계산할 FG).
2. 각각의 시간 간격, 나노 몰의 시간의 효소 활성을 계산 ^-1 ML ^-1 방정식에서 :

효소 활성 = (샘플의 형광을 의미 - 초기 샘플의 형광을 의미) / (() 시간 시간 (X) 0.2 ㎖ (표준 형광) X를 의미 / 제어 형광을 해소 평균 (표준 형광 / 0.5 몰) X 평균)

3. 각 시간 단계에서 계산 된 활동 값을 검사합니다. 가장 높은 활성 시간 단계에서 최종 잠재적 인 활동을 결정합니다. 활동 값이 계속 증가 할 경우, 나중에 단계가 필요할 수 있습니다 활동을 통해서 값이 떨어질 경우호우 실행의 과정은 다음 짧은 시간의 단계를 다시 실행합니다. 최종 활동은 기판 소비 시간 ^{-1 -1} ML의 나노 몰에 있지만 시간 ^-1 L ^-1 μmoles로 표현하도록 확장 할 수 있습니다.

결과

토양과 수생 퇴적물 일반적 부착 미생물 군집 (생물막) 입자의 표면에 성장의 결과로 세포 외 효소 활성의 상당한 수준을 가지고.이 액티비티는 제 3 표면 침전물로부터 얻어지는 입자의 크기에 따라 변경하는 방법도 3 도표 북부 미시시피, 미국에서 주문 스트림. 이전의 연구는이 스트림에서 퇴적물 입자의 세균성 지역 사회가 사회 구조의 분자 분석을 기반으로 세 가지 그룹으로 분?...

토론

토양과 퇴적물에있는 미생물의 세포 외 다양한 효소의 활동을 결정하는 것은 영양 광물 및 유기물 처리 ^17의 속도로 유용한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 그러나 토양은 수분 수준이 다를 수 있으므로 토양 건조 중량으로 활동을 표준화하는 것이 중요합니다. 이것은 단순히 효소 활성을 측정 넘어 (전형적 이틀) 추가로 건조 공정을 필요로한다. 따라서, 즉각적인 결과를 제공하는 근처에...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS AND MATERIALS
Glacial acetic acid			Various suppliers
Sodium acetate			Various suppliers
Sodium hydroxide			Various suppliers
p-Nitrophenol	Fisher	BP612-1	Alternates available
p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate	Sigma	N3234	pNP-substrate
pNP-β-glucopyranoside	Sigma	N7006	pNP-substrate
pNP-β-N-acetylglucosaminide	Sigma	N9376	pNP-substrate
Clear 96-well microplates	Fisher	12-563-301	Alternates available
96-well deep well blocks	Costar	3958	Alternates available
Aluminum weigh pans			Various suppliers
Sterile 15 ml centrifuge tubes			Various suppliers
Sterile 50 ml centrifuge tubes			Various suppliers
4-Methylumbelliferone	Sigma	M1381
4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate	Sigma	M8883	MUB-substrate
4-MUB-glucopyranoside	Sigma	M3633	MUB-substrate
4-MUB-N-acetylglucosaminide	Sigma	M2133	MUB-substrate
Sodium bicarbonate			Various suppliers
Black 96-well microplate	Costar	3792
Pipette reservoir			Various suppliers
			EQUIPMENT
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge rotor	Eppendorf	A-4-81	For microplates/deep-well blocks
Microplate reader	BioTek	Synergy HT	Alternates available
Microplate fluorometer	BioTek	FLx 800	Alternates available
8-channel pipettor			Various suppliers