Определение микробной внеклеточной ферментативной активности в вод, почв и донных отложений с использованием высокой пропускной MICROPLATE Анализы

Резюме

Процедуры для микропланшетов на основе описаны для колориметрического или флуорометрического анализа внеклеточной активности фермента. Эти процедуры позволяют для быстрого анализа такой деятельности в большом количестве проб окружающей среды в пределах приемлемого периода времени.

Аннотация

Большая часть питательных веществ и переработки газа в природных средах происходит благодаря активности внеклеточных ферментов, опубликованным микроорганизмов. Таким образом, измерение активности этих внеклеточных ферментов может дать понимание скоростей процессов на уровне экосистем, таких как органического разложения вещества или азота и минерализации фосфора. Анализы внеклеточной ферментативной активности в пробах окружающей среды обычно включают подвергая образцы искусственных колориметрических или флуорометрическими субстратов и отслеживания скорости гидролиза субстрата. Здесь мы опишем микропланшета на основе методов для этих процедур, которые позволяют анализ большого количества образцов в течение короткого периода времени. Образцы подвергают взаимодействию с искусственных субстратах в 96-луночные микропланшеты или глубокий луночный микропланшет блоков, и активность фермента впоследствии определяется поглощения или флуоресценции полученного конечного продукта с использованием обычного микропланшетов Ридг или флуорометр. Такие процедуры высокой пропускной не только облегчит проведение сравнений между пространственно отдельных участках или экосистем, но и существенно снизить затраты на таких анализов за счет снижения общих объемов реагентов, необходимых на образец.

Введение

Микроорганизмы, такие как бактерии и грибы получить питательные вещества и углерод из сложных органических соединений за счет производства внеклеточных ферментов. Эти ферменты обычно гидролиза полимеров на более мелкие субъединицы, которые могут быть приняты в клетку. Таким образом, в экологической уровне эти микробные внеклеточных ферментов отвечают за большую часть питательных веществ минерализации и разложения органических веществ вещества, которое происходит в естественных условиях. Ферменты, такие как целлобиогидролазы (СВН) и β-глюкозидазы важны для деградации целлюлозы и работать в унисон, чтобы катализировать гидролиз целлюлозы в глюкозу ^1,2, который обеспечивает утилизируемых углерода субстрат для микробного поглощения и ассимиляции. Фермент фосфатазы релизы растворимых неорганических фосфатных групп из органофосфаты, по существу минерализации фосфата и сделать его доступным для использования большинства организмов ^3. Другие ферменты, такие как N-ацетилглюкозаминидазы (Nagase), являются importanт к деградации хитина и может сделать как углерод и азот, доступной для микробов приобретения ^4.

Одна из процедур анализа микробной внеклеточной ферментативной активности в естественных условиях является использование искусственного п-нитрофенила (р NP), связанные субстратов, подход, который изначально разрабатывался для обнаружения почвы активность фосфатазы ^5. Этот подход основан на обнаружении цветной конечного продукта, п-нитрофенола, который выделяется, когда искусственный субстрат гидролизуют с помощью соответствующего фермента. П-нитрофенол может быть впоследствии количественно колориметрическим путем измерения его абсорбцию в пределах 400-410 нм. Этот метод стал применяться для обнаружения других ферментов, таких как Нагасе ^6, и был использован в различных исследований, глядя на микробной внеклеточной ферментативной активности в грунтов и отложений ^7-9.

Альтернативный подход, который был Originallу разработаны для оценки внеклеточный глюкозидазы в водной среде ^10,11 использует 4-метилумбеллиферона (MUB), ссылки на подложках. Конечный продукт выпущен (4-метилумбеллиферона) весьма люминесцентные и могут быть обнаружены с помощью флуорометр с установкой возбуждения / эмиссии вокруг 360/460 нм. Разнообразные MUB-связанных искусственных субстратах доступны, позволяя флуорометрического измерение активности по крайней мере, многих ферментов (например, β-глюкозидазы, целлобиогидролазы, Нагасе, фосфатазы), а могут быть проанализированы с помощью р NP-подложка колориметрического процедуру. Другие микробные внеклеточные ферменты, такие как протеолитических лейцинаминопептидазы, может быть проанализирована с помощью флуорометрически 7-амино-4-метилкумарин (COU), связанных субстратов. Оба MUB-и COU-связанные субстраты были использованы для определения активности фермента в различных наземных и водных образцов ^12,13.

В то время как предыдущие исследования имеют DescrIBED флуорометрический или колориметрический микропланшет подходы для определения внеклеточный активность фермента ^14; существует необходимость четкого представления о том, как проводить такие анализы. Здесь показано, процедуры проведения высокие методы пропускная способность микропланшета для анализа внеклеточной ферментативной активности в грунтов и отложений с использованием колориметрического р NP-сшитый субстратов подход и в природных водах с использованием флуоресцентного MUB-связанный субстратов техники. Мы делаем ставку на измерении деятельности β-глюкозидазы, Nagase и фосфатазы как эти ферменты могут быть привязаны к углерода, азота, фосфора и велосипедного соответственно. Однако процедуры, описанные здесь, могут быть применены к измерению других внеклеточных ферментов, использующих различные искусственные субстраты.

протокол

Колориметрический Анализ внеклеточной ферментативной активности в почвах и донных отложениях

1. Подготовка субстрата и буферные растворы для колориметрических анализов активности фермента

1. Подготовка 50 мМ ацетатным буфером (рН 5,0-5,5) путем смешивания 50 мл 0,1 М уксусной кислоты (2,87 мл ледяной уксусной кислоты в 500 мл воды), 150 мл 0,1 М ацетата натрия и 200 мл дистиллированной H ₂ O. Регулировка рН до 5,0-5,5 с помощью 0,1 М уксусной кислоты, если это необходимо.
2. Готовят раствор 1 M гидроксида натрия (NaOH) в дистиллированной H ₂ O.
3. Подготовьте р NP-связаны подложки решения в 50 мМ ацетатного буфера. Для анализа фосфатазы подготовить 5 мм П NP-фосфат в 50 мМ ацетатного буфера; для анализа β-глюкозидазы подготовить 5 мм П NP-β-глюкопиранозид; для анализа Nagase подготовить 2 мМ PNP-β-N-acetylglucosaminide. Подготовить все решения субстрата в стерильных 15 мл или 50 мл центрифужные пробирки. Растворы можно хранить при температуре 4 ° С в течение 2-3 недель.

2. Определение стандарта конвертировать абсорбцию в р НП концентрации

1. Подготовка стандартных растворов п-нитрофенола в 50 мМ ацетатного буфера. Концентрации должна составлять от 0.025-1 мМ.
2. Передача три повторов 100 мкл каждой концентрации до прозрачного микропланшет с 96 лунками. Добавьте 10 мкл 1 М NaOH и 190 мкл дистиллированной H ₂ O в каждую лунку.
3. Запись поглощение при 410 нм с использованием микропланшет-ридера.
4. Концентрации размножаются на стандартной кривой на 0,3, чтобы получить мкмоль р NP за 300 мкл реакционного объема. Постройте кривую поглощения против мкмоль р НП. Наклон кривой служит коэффициент преобразования (С), которые относятся к поглощению мкмоль р НП в каждой реакции фермента.

3. Проведение Анализ фермента

1. Для почве, получая суспензию каждого анализируемого образца в стерильной 15 мл центрифужную пробирку на концданию примерно 1 г / мл ^-1 использованием 50 мМ ацетатным буфером. Для отложений, добавить достаточно ацетатный буфер, чтобы сделать суспензию легко pipettable. Точный объем суспензии, необходимой будет варьироваться в зависимости от количества ферментов анализировали, но не менее 5 мл рекомендуется. Vortex друг суспензия, пока все комки почвы или отложений не разошлись и обратите внимание на конечный объем.
2. Re-вихря друг суспензия и сразу пипетки 150 мкл в каждую из шести скважин на 96-и глубинного блока (рис. 1). Важно тщательно вихря и часто, чтобы поддерживать частицы грунта во взвешенном состоянии. Оставьте по крайней мере две скважины на блок пустые служить в качестве контроля подложки. Примечание: клип конец наконечников пипеток с ножницами до пипетки как почвенные растворы, как правило, забивают советы. Подготовьте один блок 96-а для каждой фермента, который надо анализировать.
3. Залить приблизительно 5 мл ацетатного буфера в резервуар пипетки и используют 8-канальную пипетку, чтобы добавить 150 мкл буфера для лАСТ две скважины каждого образца (они будут выборочные управления буфер) и две контрольные лунки субстрата (рис. 1)
4. Налейте примерно 10 мл соответствующего раствора р NP-подложки в резервуар пипетки и используют 8-канальную пипетку, чтобы добавить 150 мкл раствора субстрата в первых четырех лунках каждого образца и двух контрольных лунок подложка (рис. 1). Обратите внимание на время как реакция начинается, как только раствор добавляют субстрат.
5. Планшеты инкубируют при комнатной температуре (22 ° С) в течение 0,5-4 часов. Точное время инкубации изменяется в зависимости от уровня активности в образцах и фермента дл анализа. Для большинства почв и донных отложений, фосфатазы и β-глюкозидазы требуют инкубации времена 0,5-1,5 ч, в то время как Nagase и другие ферменты требуют инкубации времена> 2 часов.
6. В то время как анализы инкубации подготовить четкий 96-луночных микропланшетов на измерить оптическую плотность. Подготовьте планшет для каждого глубинного блока (то есть для каждого еанализировали nzyme). Пипетка 10 мкл 1 М NaOH и 190 мкл дистиллированной воды в каждую лунку микропланшета. Примечание: NaOH замедляет ферментативную реакцию и повышает рН, которое усиливает цвет р НП опубликованном в ходе реакции.
7. После инкубации центрифуге блоки 96-а в 2000-5000 мкг в течение 5 мин для осаждения частиц почвы.
8. Используйте многоканальную пипетку отозвать 100 мкл из каждой лунки, будьте осторожны, избегайте осадок, и передать его в соответствующую лунку на подготовленного четкого планшетом с 96-а.
9. Включите микропланшетного и настроить все необходимое программное обеспечение. Запись поглощение при 410 нм. Если поглощение конкретной скважины выше линейного предела обнаружения ридере, развести, что хорошо 1:01 с водой и повторного измерения. Если поглощение все еще слишком высока, анализ следует повторить с более коротким временем инкубации.

4. Определение сухой массы образцов

1. Внесите 1 мл каждого SAMPL е суспензию в предварительно взвешенную алюминиевую чашку.
2. Сушат в 75 ° C сушильном шкафу в течение 48 ч и весят. Вычесть вес поддона от этого значения, чтобы получить сухой массы почвы или осадка в 1 мл суспензии. Умножение на коэффициент 0,15 для определения сухой массы образца в 150 мкл в каждую лунку добавляли в ферментном анализе.

5. Расчет ферментативной активности на сухой массы почвы или отложений

1. Рассчитать конечную оптическую плотность каждого образца путем вычитания поглощения контрольной пробы из образца для анализа оптической плотности. Если элементы управления подложки имеют высокую оптическую плотность (примерно> 0,060), то вычесть тех, также.
2. Рассчитать активность фермента в мкмолей ч ^-1 г сухой массы ^-1 из уравнения:

Активность фермента = конечное поглощение / (С х время инкубации х образец сухой массы)

Люминесцентная Анализ внеклеточной ферментативной активности в природных водах

TLE "> 1. Подготовка основания, Standard, и буферные растворы флуорометрического Анализы активности фермента

1. Подготовка 200 мкМ растворов MUB-связанных субстратов (например, 4-MUB-β-глюкопиранозид, 4-MUB-фосфат, 4-MUB-N-ацетил-β-D-глюкозаминида) растворением соответствующего субстрата в стерильной (в автоклаве) дистиллированной H ₂ O в 15 мл стерильные или 50 мл центрифужные пробирки. Оберните трубки в алюминиевой фольгой, чтобы исключить свет и хранить в холодильнике до использования. Подложки должны быть стабильными в течение по крайней мере 1 недели при хранении в этом случае.
2. Подготовить стандартный MUB путем исходного раствора 100 мкМ 4-метилумбеллиферона в стерильной дистиллированной H ₂ O. Храните в холодильнике в янтаре или обернутого фольгой бутылки. Непосредственно перед применением разбавл ют 100 мкМ исходного раствора на 1/10 в стерильной H ₂ O, чтобы сделать рабочий раствор 10 мкм для ферментных анализов.
3. Подготовка исходного раствора 100 мМ бикарбонатного буфера при растворении 8,4 г NaHCO <суб> 3 в 1 LH ₂ O и в автоклаве. Развести эту исходного раствора 1/20 в стерильной H ₂ O при необходимости сделать рабочего раствора 5 мм для ферментных анализов.

2. Организация Водные Образцы на 96-Well Черного микроплиты

1. Организация планшет для каждого фермента следующее примере, показанном на рисунке 2. Обратите внимание, что способствует надлежащей реализации репликации, стандартов и контроля, эта процедура может анализе деятельности одного фермента до девяти проб воды на одном 96-а черный микропланшет.
2. Налейте приблизительно 5 мл первого образца в пипетку резервуара и используют 8-канальную пипетки в pipette200 мкл во все лунки в колонке 1 микропланшета (ов). Утилизация использованных наконечников и повторите по мере необходимости для каждого образца воды, чтобы заполнить столбцы 1-9.

3. Настройка Sample, Стандартный, Quench, и субстрат управления

1. Настройка управления для учета образцов, стандартныхс, субстрат и закалки на том же черном микропланшет как образцов (рис. 2).
2. Примеры управления содержат пробы воды и бикарбоната буфер, и не используются в расчетах деятельности, но продемонстрирует чтения согласованности на протяжении всего эксперимента. Элементы управления закалки состоять из пробы воды и стандартного количества флуоресцентного тега и используются для измерения дифракции флуоресценции в образце воды. Субстрат и стандартные элементы управления состоят из подложки или сшитые или стандартный флуоресцентной метки, соответственно, и бикарбонатного буфера.
3. Налейте приблизительно 5 мл 5 мМ бикарбонатного буфера в чистую пипетки резервуара. 50 мкл буфера в стрипы с 1 по 9 в строках D и Е, чтобы сформировать два повторить скважин управления образца на образец. Советы Изменить пипеток затем передать 200 мкл бикарбонатная в лунки 10 по 12 в строках и Х.
4. Уменьшите окружающее освещение затемнением или выключения Лиghts как флуоресцентного стандарта является светочувствительным.
5. Налейте приблизительно 5 мл 10 мкМ 4-метилумбеллиферона в чистую пипетки резервуара. 50 мкл в стрипы с 1 по 12 в строке H, и в лунки с 1 по 9 на строки G и F, чтобы сформировать три повторов управления закалки на образец и общих стандартных элементов управления. Либо поместить планшет в темноте или накрыть непрозрачной крышкой, чтобы уменьшить свет деградации MUB.
6. Включите флуорометра и настройки все необходимое программное обеспечение, чтобы быть готов читать перед добавлением субстрата. Примечание: некоторые флуорометр луковицы могут потребовать времени для разогрева на 3 мин и более.
7. Налейте приблизительно 5 мл соответствующей MUB-связанного субстрата (например, 4-MUB-фосфат) в чистую пипетки резервуара. Используйте пипетки 12-канальный, чтобы 50 мкл в стрипы с 1 по 12 в строке A, и в лунки с 1 по 9 рядами В и С образуют три дублирующие тесты для каждого образца и три элемента управления подложки. Immediatelу перейдите к шагу 4.1, флуоресценцию записи.

4. Запись флуоресценции

1. Read начальное флуоресценции сразу же после субстрата дополнение к микропланшета. После прочтения флуоресценцию, инкубировать планшет при комнатной температуре (22 ° C) или в темное время суток или покрыт непрозрачным крышкой, чтобы уменьшить свет деградации MUB.
2. Время инкубации требуется измерить максимальное потенциальную активность фермента в образце воды будет зависеть от концентрации фермента в образце. Так как это ранее неизвестные анализ завершен, микропланшет должны быть считаны в нескольких временных шагов. Как правило, чтение с интервалом в 10-15 мин в течение 1 ч является приемлемым для многих ферментов, хотя образцы с очень высокой активностью в определенных ферментов может достигнуть максимума до 10 мин.
3. Продолжить чтение флуоресценцию в микропланшет в ваших заданные интервалы в течение не менее 1 часа. Не забудьте сохранить микропланшет с покрытием или в темноте между чтениис.

5. Расчет ферментативной активности на объем воды

1. Для каждого образца в каждом временном интервале расчета: значит первоначальный образец флуоресценции (скважины D и E), средняя конечная флуоресценции образца (скважины переменного тока), средняя стандартная флуоресценции (скважин H10-11), а средняя утолить флуоресценции управления (скважин FG).
2. Для каждого интервала времени, рассчитывают активность фермента в нмоль ч ^{-1 -1} мл по формуле:

Активность фермента = (средний флуоресценцию образца - значит первоначальный флуоресценцию образца) / ((имею в виду стандартные флуоресценции / 0,5 моль) х (средний утолить флуоресценции управления / означает стандартные флуоресценции) х (0,2 мл) х (время в час))

3. Изучите значения деятельности, рассчитанные для каждого временного шага. Определить окончательную потенциальную деятельность с временной шаг с высокой активностью. Если значения активности продолжать расти, то может потребоваться более поздние временные шаги, если значения активности падают ThrougХаут ход в бегах, а затем запустить снова с более короткими шагами по времени. Финал деятельность в нмоль субстрата потребляется ч ^-1 мл ^-1, но можно масштабировать до выразить как мкмоль ч ^-1 L ^-1.

Результаты

Почвы и водные отложения обычно имеют заметное количество внеклеточной ферментативной активности в результате приложенных микробных сообществ (биопленки), растущих на поверхности частиц. 3 показано, как эта деятельность будет меняться в зависимости от размера частиц, получе...

Обсуждение

Определение активности различных микробных внеклеточных ферментов в почвах и донных отложениях может предоставить полезную информацию в темпах питательной минерализации и переработки органического вещества ^17. Однако почвы может изменяться в их уровней влажности, поэтому важ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
			REAGENTS AND MATERIALS
Glacial acetic acid			Various suppliers
Sodium acetate			Various suppliers
Sodium hydroxide			Various suppliers
p-Nitrophenol	Fisher	BP612-1	Alternates available
p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate	Sigma	N3234	pNP-substrate
pNP-β-glucopyranoside	Sigma	N7006	pNP-substrate
pNP-β-N-acetylglucosaminide	Sigma	N9376	pNP-substrate
Clear 96-well microplates	Fisher	12-563-301	Alternates available
96-well deep well blocks	Costar	3958	Alternates available
Aluminum weigh pans			Various suppliers
Sterile 15 ml centrifuge tubes			Various suppliers
Sterile 50 ml centrifuge tubes			Various suppliers
4-Methylumbelliferone	Sigma	M1381
4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate	Sigma	M8883	MUB-substrate
4-MUB-glucopyranoside	Sigma	M3633	MUB-substrate
4-MUB-N-acetylglucosaminide	Sigma	M2133	MUB-substrate
Sodium bicarbonate			Various suppliers
Black 96-well microplate	Costar	3792
Pipette reservoir			Various suppliers
			EQUIPMENT
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge rotor	Eppendorf	A-4-81	For microplates/deep-well blocks
Microplate reader	BioTek	Synergy HT	Alternates available
Microplate fluorometer	BioTek	FLx 800	Alternates available
8-channel pipettor			Various suppliers