Isolierung von Precursor B-Zell-Subsets aus Nabelschnurblut

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung Teilmengen von Vorläufer-B-Zellen aus Nabelschnurblut. Ein ausreichender Menge und Qualität von Nukleinsäuren können aus den Zellen extrahiert werden und in nachfolgenden Assays DNA oder RNA.

Zusammenfassung

Nabelschnurblut ist sehr für hämatopoetischen Vorläuferzellen in verschiedenen Linie Engagement Stufen bereichert. Wir haben ein Protokoll zur Isolierung Vorläufer-B-Zellen in vier verschiedenen Stadien der Differenzierung entwickelt. Da Gene exprimiert werden und epigenetische Modifikationen auftreten in einer Gewebe-spezifischen Art und Weise ist es wichtig, zwischen Geweben und Zelltypen unterscheiden, um der Lage sein, Veränderungen im Genom und Epigenom, die zur Entwicklung der Krankheit führen, zu identifizieren. Dieses Verfahren kann auf jede Art von Zelle im vorliegenden Nabelschnurblut in jedem Stadium der Differenzierung angepasst werden.

Dieses Verfahren umfasst 4 wichtigsten Schritte. Zuerst werden mononukleäre Zellen durch Dichtezentrifugation getrennt. Zweitens werden B-Zellen angereichert mit Biotin konjugierten Antikörper, erkennen und Entfernung von Nicht-B-Zellen aus den mononukleären Zellen. Drittens werden die B-Zellen werden mit fluoreszent Zelloberflächenprotein spezifische Antikörper markiert einzelnen Stufenvon B-Zell-Entwicklung. Schließlich werden die fluoreszenzmarkierten Zellen sortiert und einzelne Populationen werden zurückgewonnen. Die gewonnenen Zellen werden in ausreichender Menge und Qualität in nachgelagerten Nukleinsäureassays genutzt werden.

Einleitung

Um Aberrationen, die in Krankheit zu identifizieren, ist es äußerst wichtig, dass wir gesunde Gewebe oder Zellen, die Gewebe oder Zelltyp von der Krankheit betroffen entsprechen verwenden. Ein Grund dafür ist, dass epigenetische Variation unter Gewebetypen verantwortlich ist für die Regulation der Genexpression und ist entscheidend für die Zelldifferenzierung während der normalen menschlichen Entwicklung ^1,2. Ein zweiter Grund ist, dass aberrante gewebespezifischen Genregulation kann fatale Folgen auf normale Entwicklung haben und ist dafür bekannt, zu einer Vielzahl von Krankheitszuständen wie Krebs beitragen. Daher erfordert ein besseres Verständnis einer Krankheit, die hämatopoietische Zellen umfasst Kenntnisse gesunden hämatopoetischen Zellen.

Die Entwicklung von hämatopoetischen Zellen im Knochenmark verläuft durch systematische Abfolge von Ereignissen durch Veränderungen in der Expression von Zelloberflächen dadurch Marker ^3. Studien mit erwachsenen Teilnehmergezeigt, dass Knochenmark enthält gewöhnlich eine geringe Anzahl von Vorläufer-B-Zellen ^4,5; Erwägung pädiatrischen Studien mit Teilnehmern haben gezeigt, dass der Anteil der Vorläufer-B-Zellen in relativ hoher Individuen weniger als 5 Jahren ⁶ ist. Nabelschnurblut wurde als Quelle von hämatopoetischen Stammzellen zur Behandlung von Blut-verwandten Erkrankungen und malignen Erkrankungen verwendet werden, ist leicht erhältlich über Nabelschnurblutbanken und ist für unreifen B-Zellen und T ^7, die die Zielzellen mehrerer Störungen, einschließlich Leukämie und sind angereichert Lymphome.

Vorläufer-B-Zellen im Knochenmark wurden ausgiebig ^8,9 phänotypisiert und kann durch die Anwesenheit von spezifischen Zelloberflächen-Marker, die verwendet werden, diese Zellen in verschiedene Teilmengen sortiert werden können definiert werden. Normale B-Zell-Differenzierung verläuft über eine Reihe von Stufen im Knochenmark beginnend mit den frühesten Pro-B-Zellen und ihren Höhepunkt in unreifen oder naive B-Zellen. Nachvan Zelm und Kollegen ¹⁰ sind Pro-B-Zellen durch die Anwesenheit von CD34 und im Übergangsbereich zu Stufe 2 (Pre-BI) CD19 erfasst ist. Stage 3 (Pre-BII) Zellen nicht mehr CD34 und beginnen zu zytoplasmatische IgM auszudrücken. Schließlich ist ein bestimmendes Merkmal der Stufe 4 (unreifen B-Zellen) die Expression von Oberflächen-IgM. Die Sortiervorrichtung Strategie in diesem Protokoll beschrieben wurde zuerst von Caldwell und Kollegen ⁶ beschrieben und umfasst die Verwendung von nur 3 Zelloberflächenmarker das reduziert die Komplexität und die Kosten des Durchführens Zellsortierung Experimenten. In ihrer Arbeit wurde eine Beziehung zwischen CD45 und die Stufen des B-Zell-Differenzierung etabliert. Sie beobachteten, dass B-Zellen im Knochenmark variablen Niveaus der Expression von CD45 zeigen. Insbesondere Zellen, die hohe Spiegel von CD45 exprimiert zu Zellen, die Oberflächen-IgM exprimiert (unreifen B-Zellen) entsprach, entsprachen denen, die ein mittleres Niveau der CD45 exprimiert, um Zellen zu cytopl exprimiertasmic IgM (pre-BII Zellen), und diejenigen, die geringe Mengen an CD45 exprimiert entsprach Zellen, die nicht exprimieren hat cytoplasmatischen IgM (Prä-BI-Zellen). Dieses Protokoll verwendet die Strategie von Caldwell und Kollegen entwickelt, um ^sechs Teilmengen von Vorläufer-B-Zellen aus Nabelschnurblut (Abbildung 1), die in nachgeschalteten Assays erfordern hochwertige Nukleinsäuren wie der methylierten CpG-Insel Rückgewinnung Assay verwendet werden kann (MIRA isolieren ) ¹¹ und quantitative Echtzeit-PCR-Assays. Das Verfahren eine anfängliche Trennung unter Verwendung von Magnetkügelchen, alle nicht-B-Zellen aus Nabelschnurblut abzureichern und erfordert Färbung mit nur drei Antikörper (CD34, CD19 und CD45). Die Zellen, die gewonnen werden repräsentieren 4 Stufen von B-Zell-Differenzierung: 1) CD34 ^+; CD19 ⁺ (späten Pro-B und frühen Pre-BI), 2) CD34 ^-; CD19 ^+; CD45 ^niedrig (späte pre-BI); 3) CD34 ^-; CD19 ^+; CD45 ^med (pre-BII), und 4) CD34 ^-; CD19 ^+; CD45 ^hoch (unreifen B-Zellen).

Protokoll

Ein. Isolierung von mononukleären Zellen aus Nabelschnurblut

1. Planen EDTA-Puffer PBS-5 ml Rinderserumalbumin (BSA)-Stammlösung zu 95 ml Spülpuffer (1:20 Verdünnung). Degas der Puffer und halten Sie die Puffer auf Eis. WICHTIG: Failure zu entgasen kann der Puffer in weniger als optimale Ergebnisse führen bei der Isolierung von CD19 + B-Zellen, weil Blasen können die Isolation Spalte zu blockieren.
2. Planen 50 ml konischen Röhrchen für Dichtegradientenzentrifugation. Bestimmen Sie die Anzahl von Rohren für die Verarbeitung der Nabelschnurblut benötigt (1 Rohr 8 ml Blut verarbeiten) und 15 ml Ficoll-Paque PLUS in jedes Röhrchen.
3. 8 ml von Nabelschnurblut mit 24 ml DPBS (1X) und sorgfältig Schicht das verwässerte Nabelschnurblut Mischung auf der Oberseite des Ficoll-Paque PLUS in jedem der 50 ml konischen Röhrchen. Mischen Sie nicht das Blut und Ficoll-Paque PLUS. WICHTIG: Zur Vermeidung von Vermischung der Nabelschnurblut und Ficoll-Paque PLUS, halten den Schlauch in einem 45 Grad-Winkel undSchicht die Blut-Gemisch langsam.
4. Zentrifuge bei 400 × g für 40 min bei 20 ° C. Mononukleäre Zellen (MNC) werden zu verbleiben die Plasma-Ficoll-Paque PLUS Schnittstelle Erwägung Granulozyten und Erythrozyten sedimentieren aufgrund höherer Dichte an der osmotische Druck von Ficoll-Paque PLUS. Label sieben 5 ml Rundboden-Röhrchen, die in Teil 3 mit dem Proben-ID, Datum und wie folgt verwendet werden:

Tube	Etikett	Zweck
1	Unbefleckt	Ungefärbte Zellen zur Normalisierung während der Durchflusszytometrie
2	7AAD	Um Lebensfähigkeit während der Durchflusszytometrie bestimmt
3	+ + +	Enthält die Zellen, die sortiert werden
4	34 +	Um CD34 + / CD19 sammeln +(Ende Pro-B - frühe Pre-BI-Zellen)
5	45 niedriger	/ CD19 + / CD45 niedrig (pre-BI)-Zellen - zu CD34 sammeln
6	45 med	/ CD19 + / CD45 med (pre-BII) Zellen - Um CD34 sammeln
7	45 hoch	/ CD19 + / CD45 hoch (unreifen B-Zellen) - Um CD34 sammeln

Coat Rohre 4, 5, 6 und 7 mit 2% FBS und legen Sie alle Röhrchen auf Eis.

5. Saugen Sie die obere Plasmaschicht vorsichtig und vermeiden Sie Kontakt mit der mononukleären Zellschicht. Mit einem 10 ml Glas-Pipette vorsichtig die mononukleären Zellschicht auf ein neues 50 ml konischen Röhrchen. Vereinen die mononukleären Zellen aus drei Rohren in einem einzigen 50-ml-Röhrchen.
6. Das Rohr wird mit PBS, vorsichtig mischen und bei 300 × g zentrifugiert 10 min bei20 ° C. Saugen Sie vorsichtig den Überstand ohne den Zellpellet. Wiederholen 1x. Nach dem ersten Waschen, resuspendieren Pellets und Transfer zu einem einzigen 50 ml konischen Röhrchen.
7. Gently Zellpellet in 200 ul PBS. Entfernen 1 ul der Zellsuspension, fügen Sie es zu 1 ml PBS in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und beiseite stellen für die Zählung (Anzahl Zellen nach dem Aufsetzen des 50 ml Zellsuspension in der Zentrifuge). Das Rohr wird mit PBS und Zentrifugieren bei 200 xg für 15 min, um Blutplättchen zu entfernen. Entfernen Sie den Überstand vollständig ohne die Zellpellet.

2. Geändert B-Zell-Isolierung von mononukleären Zellen mittels MACS-Separation

1. Das Pellet aus Schritt 1,7 mit 160 ul kaltem (4 ° C) EDTA-PBS-Puffer.
2. Fügen Sie 40 ul B-CLL Biotin-Antikörper-Cocktail. Pipettieren gut mischen und inkubieren für 10 min bei 4 ° C.
3. Waschen der Zellen - 1 ml kaltem (4 ° C) EDTA-PBS-Puffer pro 10 Millionen Zellen (Zell-number in Schritt 1.7) ermittelt und zentrifugieren bei 300 × g für 10 min. Überstand komplett und dann das Zellpellet in 320 ul kaltem (4 ° C) EDTA-PBS-Puffer.
4. Fügen Sie 80 ul Anti-Biotin-Mikrokugeln, gut mischen und inkubieren für 15 min bei 4 ° C.
5. Waschen der Zellen - 1 ml kaltem (4 ° C) EDTA-PBS-Puffer pro 10 Millionen Zellen und bei 300 g zentrifugiert für 10 min. Resuspendieren bis zu 100 Millionen Zellen in 500 &mgr; l kaltem (4 ° C) EDTA-PBS-Puffer. Maßstab Puffervolumen nach Zellzahl.
6. Bereiten MACS Säulen und MACS Separatoren während der Zentrifugation (Schritt 2,5). Ein LS Spalte im Magnetfeld der MACS Separator, 3 ml kaltem (4 ° C) PBS-EDTA-Puffer auf die Säule gegeben und der Puffer durch die Säule tropfen. Verwenden Sie ein Gefäß, um den Durchfluss durch fangen. Verwerfen Sie den Durchfluss durch.
7. Legen Sie eine 50 ml konischen Röhrchen unter der Spalte und Pipette die Zellsuspension auf die Säule. Lassen Sie die unmarkierte Zellen throug tropfth der Säule und in der 50 ml konischen Röhrchen. WICHTIG: Dies sind die Zellen, die für die Antikörper-Kennzeichnung und Zellsortierung verwendet werden. Nicht wegwerfen durchfließen. Um mit der Zellen aus Schritt 2.5 erholen, eine zusätzliche 1 ml kaltem (4 ° C) PBS-Puffer-EDTA zu den Wänden des konischen Rohrs. Vorsichtig mischen und pipettieren das restliche Zellsuspension auf die Säule. Wiederholen 1x. Verfahren bis 2,8 Schritt unter Verwendung der unmarkierten Zellen in der konischen Rohr nach Passieren der Kolonne gesammelt.
8. Füllen Sie das konische Röhrchen mit unmarkierten Zellen mit PBS und bei 300 g zentrifugiert für 10 min. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand ohne den Zellpellet. Fügen Sie 200 ul EDTA-PBS-Puffer und sanft die Zellen resuspendieren.

3. Antibody Labeling und Vorbereitung für die Cell Sorting

1. Absaugen 1 ul der Zellsuspension und Ort in das Rohr mit der Aufschrift "ungefärbt" (Schritt 1,4). Fügen Sie 500 ul EDTA-PBS-Puffer und speichern Sie die Röhrchen auf Eis.
2. Hinzufügen 20ul jeder Antikörper (CD19, CD34 und CD45) pro Millionen Zellen in den verbleibenden Zellsuspension. Gut mischen und legen Sie die Röhrchen im Dunkeln für 30 min bei RT. CD-Antikörper sind lichtempfindlich, Schritte 2-4 mit die Lichter ausgeschaltet.
3. Nach 30 min Inkubation mit Antikörpern, absaugen 40 ul der Zellsuspension und legen Sie sie in das Rohr mit der Aufschrift "7AAD". 1 ml PBS in die Röhre und Zentrifuge bei 500 × g für 2 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren in 100 ul Bindungspuffer. Hinzufügen 7 ul 7AAD (7-Aminoactinomycin D) und inkubieren im Dunkeln für 10 min bei RT. Während der 10-minütigen Inkubation komplette Schritt 3,4.
4. Hinzufügen PBS auf dem oberen Ende des Rohres mit den verbleibenden Zellen mit CD-Antikörper markiert ist. Zentrifugieren bei 500 xg für 3 min. Entfernen Sie den Überstand, 500 ul EDTA-PBS-Puffer und das Zellpellet. Übertragen das gesamte Volumen der Zellsuspension in das Rohr mit einem "+ + +". Um alle der Zellsuspension einer erholendd zusätzlich 1 ml EDTA-PBS Puffer zu der 50 ml konischen Röhrchen und Transfer in das Rohr mit einem "+ + +".
5. Nach der Inkubation (Schritt 3,3), fügen Sie 300 ul Bindungspuffer in 7AAD Röhre. Die "ungefärbt", "7AAD" und "+ + +"-Proben und die "34 ^+", "45 ^low", "45 ^med" und "45 ^hoch" Röhren sind bereit für die Durchflusszytometrie.

4. Cell Sorting Mit dem MoFlo XDP Durchflusszytometer

1. Set-up MoFlo für die Sortierung: Richten Laser; stabilisieren Tröpfchenstroms; bestimmen Drop Verzögerung.
2. Bereiten einzigen Farbkompensation Kontrollen mit Invitrogen AbC Maus bead Kit (oder ähnlich) nach den Anweisungen des Herstellers. Führen einzigen Farbe steuert, Einstellen der Spannungen von Fluoreszenz-Kanäle für eine optimale Trennung von positiven und negativen Populationen. Set Kompensationskoeffizienten und gelten ausgeglichen Parameter collection Protokoll. Wiederherstellung der Kompensationskoeffizienten bei jeder neuen Menge von Antikörper erhalten wird.
3. Neues Protokoll einschließlich Grundstücke wie in Abbildung 2 dargestellt.
4. Führen ungefärbten Probe eingestellt Spannung und Gewinn für Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht und identifizieren negativen Fluoreszenz-Populationen. Da DNA-Gewinnung ist das Ziel von der Art, sollte die Schwelle niedrig eingestellt (≤ 1%), so dass DNA-haltigen Ablagerungen verunreinigt nicht die wiederhergestellten Proben. * Stellen Sie sicher, dass die Aerosol Evacuation System ist zu allen Zeiten die menschliche Zellen sind auf dem MoFlo laufen leben läuft.
5. Führen Sie einen kleinen Aliquot der + + + Probe (~ 50.000 Veranstaltungen), um die Gating-Strategie (Abbildung 2). Da B-Vorläuferzellen nicht streuen identisch mit B-Zellen reifen, Backgate die ungated CD19 + / CD34 +-Population auf den SSC vs FSC Grundstück, um sicherzustellen, die Lymphozyten-Gate potenzielle Pro-B-Zellen. Aus dieser Probe auch den negativen Fluoreszenz Bevölkerung 7AAD.
6. Führen Sie das 7AAD Probe zu Probe Lebensfähigkeit zu bestimmen. Einzige Art von Zellen aus einer Probe mit hoher Lebensfähigkeit bei derBeginn (≥ 95%) als tote Zellen werden wahllos Flecken und kann sort Populationen verunreinigen.
7. Richten Sie sort Entscheidungen vier Populationen zu sammeln: CD19 ⁺ / CD34 ^+; CD19 ⁺ / CD34 ^- / CD45 ^niedrig; CD19 ⁺ / CD34 ^- / CD45 ^med und CD19 ⁺ / CD34 ^- / CD45 ^hoch. Fügen Sie die Lymphozyten und Wams Diskriminierung Tore in den sort Entscheidungen aller Bevölkerungsgruppen.
8. Um Verstopfungen in der Sortieranlage Spitze zu vermeiden, Filter + + + Probe durch eine 40 um Zellsieb unmittelbar vor Sortier-und re-Filter, wenn eine Aggregation auftritt Probe während sort.
9. Sortieren der Zellen in Sammelröhrchen (Schritt 1.4) mit 2% FBS in PBS in einem gekühlten oder Eis gepackten Rohrhalters beschichtet.
10. Unmittelbar nach Art abgeschlossen ist, extrahieren DNA.

Ergebnisse

Zwischen Probe Variation spielt eine Rolle für den Erfolg der Zelle sort (Tabelle 1). Die Proben mit gutem Erfolg Raten haben niedrige verunreinigenden Ablagerungen (3A) und die Proben mit schlechter Erfolgsraten haben hohe verunreinigenden Ablagerungen (Abbildung 3B). Zwischen Probe Variation kann etwas gesteuert werden, wenn das Kabel Blutprobe in 24 hr des Versandes (O / N ersten Priorität) gesammelt wurde.

Die Fließeigenschaften sortierten Zellen aus jeder Vorläufer-B-Zell-Untergruppe sind in ausreichender Menge und Qualität zur Nukleinsäure-Isolation führen. Die isolierte DNA ist von hoher Qualität und kann in nachfolgenden Analysen verwendet werden. Wir nutzen diesen routinemäßig DNA in ¹¹ bis MIRA für methylierte DNA (Abbildung 4) anzureichern.

Cord Blood Facility Data	Schlechte Sortieren	Good Sortieren
Arbeiten Blood Volume mit Gerinnungshemmer (ml)	110	104
White Blood Cells [10 3 / ul]	8,68	11,19
Lymphozyten [10 3 / ul]	3,88	3,76
Lymphozyten (%)	44,70	33,6
Red Blood Cells [10 6 / ul]	3,65	3,05
In-house-Daten
Cell Number nach Ficoll-Paque	206 M	309 M
Cell Number nach MACS Separation	22 M	16,5 M
Total Events Count (MoFlo XDP)	30,57 M	19,97 M
Lebensfähigkeit (%)	98,00	98,00
Zellen in Lymphozyten Gate (%)	17,00	50,00
CD19 + / CD34 +
Gesamtzellzahl	10959	48316
% Der insgesamt Events	0,04	0,24
Leistungsfähigkeit	88%	88%
CD19 + / CD34 - / CD45 niedriger
Gesamtzellzahl	16619	26941
% Der insgesamt Events	0,05	0,13
Leistungsfähigkeit	89%	87%
CD19 + / CD34 - / CD45 med
Gesamtzellzahl	469745	507540
% Der insgesamt Events	1,54	2,54
Leistungsfähigkeit	89%	89%
CD19 + / CD34 - / CD45 hohen
Gesamtzellzahl	1896062	2047142
% Der insgesamt Events	6,2	10,25
Leistungsfähigkeit	91%	90%

Tabelle 1. Repräsentativen Zelle sort Statistiken. Zeilen 1-5 sind Zählungen durch das Nabelschnurblut Anlage vorgesehen. Die restlichen Zeilen sind die Daten in unserem Labor gesammelt. Die arme Art enthaltenen hohen Schutt und einen geringen Prozentsatz an Zellen in der Lymphozyten-Gate.

FiguRE 1. Ablaufschema des Verfahrens. Nabelschnurblut verarbeitet und mononukleären Zellen isoliert mit Ficoll-paque plus. Ein zusätzlicher Waschschritt enthalten ist, um kontaminierende Thrombozyten zu entfernen. B-Zellen aus mononukleären Zellen mit dem MACS menschlichen B-Zell-Isolation Kit (B-CLL) isoliert. Dieser Schritt verwendet Biotin-konjugierten monoklonalen Antikörper (CD2, CD4, CD11b, CD36, Anti-IgE und CD235a), um alle nicht-B-Zellen zu entfernen. Die gewonnenen B-Zellen mit CD19-APC, CD34-PE und CD45-FITC Antikörper dann sortiert Verwendung des MoFlo XDP Durchflußzytometer zum Vorläufer-B-Zell-Untergruppen erholen gekennzeichnet: CD19 ⁺ / CD34 ^+; CD19 ⁺ / CD34 ^- / CD45 ^günstig , CD19 ⁺ / CD34 ^- / CD45 ^med und CD19 ⁺ / CD34 ^- / CD45 ^hoch.

Abbildung 2. Gating Strategie zur Identifizierung und Sortierung populations. Rote Pfeile zeigen das Tor, um nachfolgende Diagramm angewendet wird. R4, R5, R6 und R7 Toren geben sortierten Populationen. A) Vorwärts vs Seite Streudiagramm zeigt angereicherten Lymphozyten-Population. R1, Lymphozyten Tor. B) Höhe vs Breite von vorn Streudiagramm zur Identifizierung einzelner Zellen im Vergleich zu Dubletten. R2, einzelne Zelle Tor. C) CD19-APC-positiven Zellen fallen in CD34-PE negativen und positiven Populationen. R3, CD19 ⁺ / CD34 ^- Tor; R4, CD19 ⁺ / CD34 ^+-Gate zeigt gewünschte Sortierung Bevölkerung d) CD19 ⁺ / CD34 ^- Zellen fallen in drei etwas unterschiedliche CD45-FITC Populationen.. R5 und R6, CD19 ⁺ / CD34 ^- / CD45 und CD19 ^{niedrig +} / CD34 ^- / CD45 ^med. Populationen sind. R7, wegen hoher Zellzahlen im CD19 ⁺ / CD34 ^- / CD45 ^hohe Population umfasst diese Art nur Gateein Teil der Bevölkerung. Alle Zellen dieser Population müssen nicht für Downstream-Analysen gesammelt werden.

Abbildung 3. A) Niedrige Kontamination Trümmern nach Spalte Bereicherung. R1, Lymphozyten Tor. B) Hohe Kontamination Trümmern nach Spalte Bereicherung.

Abbildung 4. Anreicherung von methylierter DNA von Teilmengen von Vorläufer-B-Zellen. A) beschallt DNA aus Vorläufer-B-Zell-Untergruppen getrennt ist von hoher Qualität. Für DNA-Bibliothek-Konstruktion wird auf eine mittlere von 200-600 bp beschallt. Spur 1: Promega 100 bp Leiter (Katalog # G2101); Lane 2: Total DNA isoliert von CD19 + / CD34 +-Zellen, Spur 3: Gesamt-DNA aus CD19 isoliert ⁺ / CD34 ^- / CD45 ^niedrige Zellen; Spur 4: 100 ng DNA aus CD19 ⁺ / CD34 isoliert ^- / CD45 ^med. Zellen; Spur 5: 100 ng DNA aus CD19 ⁺ / CD34 isoliert ^- / CD45 ^hohen Zellen. DNA wurde unter Verwendung des beschallt Diagenode Bioruptor on High für insgesamt 9 min (30 s EIN; 30 sec AUS). DNA wurde gereinigt und visualisiert auf einem 1% Agarosegel mit SYBR green Nukleinsäure Gelfärbemittels. B) Nach MIRA Verwendung des ActivMotif MethylCollector Ultra-Kit, PCR mit SLC25A37 (1-6) und APC1 (7-12) wird durchgeführt, um zu bestätigen Anreicherung von methylierter DNA. 1 & 7: beschallt genomische DNA (keine MIRA), 2 & 8: MIRA-CD19 + / CD34 + DNA; 3 & 9: MIRA-CD19 ⁺ / CD34 ^- / CD45 ^geringen DNA; 4 & 10: MIRA-CD19 ⁺ / CD34 ^- / CD45 ^med. DNA; 5 & 11: MIRA -CD19 ⁺ / CD34 ^- / CD45 ^hohen DNA; 6 & 12: Water Kontrolle. Höhere Verstärkung SLC25A37 bestätigt die Anreicherung von methylierter DNAin den Untermengen von Vorläufer B-Zellen.

Diskussion

Der Faktor mit dem größten Einfluss auf den Erfolg des Protokolls ist die Anwesenheit von kontaminierenden Verunreinigungen. Wenn Blut von einem anfordernden Nabelschnurblutbank ist es wichtig, dass das Blut versendet sobald nach der Entnahme wie möglich. Darüber hinaus enthalten Proben, die als Lymphozytose klassifiziert sind höhere Anzahl von Lymphozyten, aber diese Proben nicht über ausreichende Zahl von Vorläufer-B-Zellen und sollten nicht verwendet werden. Um die Wahrscheinlichkeit des Erhaltens ausreichende Anzahl von Zellen für jeden der Vorläufer Teilmengen empfiehlt beginnend mit mindestens 85 ml Nabelschnurblut erhöhen.

Es ist wichtig zu beachten, dass im Gegensatz zu erwachsenen peripheren Blut Trennungen, wenn Fraktionieren Nabelschnurblut mononukleäre die Schicht oft mit roten Blutzellen ¹² kontaminiert. Dieses Protokoll enthält eine zusätzliche Waschschritt zu verunreinigen Thrombozyten zu entfernen. Protokolle beschreiben mononukleären Trennungen aus Nabelschnurblut schlagen einschließlich einer Lyseschritt to Entfernen unerwünschter roten Blutkörperchen. Wir empfehlen nicht diesen Schritt, weil es verunreinigt Schutt produziert und hat einen negativen Einfluss auf den Erfolg der Zelle sort.

Um die Anzahl der Zellen, die durch Flusszytometrie unterschieden werden müssen reduzieren, ist es notwendig, eine B-Zell-Anreicherung vor Zellsortierung durchzuführen. Das Protokoll, das von Miltenyi Biotec, die den B-Zell-Isolation Kit (B-CLL) begleitet, vorgesehen ist für peripheren Blut optimiert und empfiehlt die Verwendung von 10 ul B-CLL Biotin-Antikörper-Cocktail pro 10 Millionen Zellen. Dieser Schritt verwendet Antikörper gegen CD2 (T-Zellen; NK-Zellen), CD4 (T-Zellen), CD11b (Granulozyten; Monozyten; Makrophagen), CD16 (NK-Zellen; Makrophagen; Mastzellen), CD36 (Thrombozyten), CD235a (erythroide Zellen) Nicht-B-Zellen aus dem Nabelschnurblut erschöpfen. Es ist wichtig, um den Bausatz beschrieben und nicht die B-Zell-Isolierungs-Kit II zu verwenden, weil der frühere Kit enthält einen Antikörper gegen CD43, die am vorliegenden Pro-B-Zellen ist. Während unserer opmierung des Protokolls, fanden wir, dass insgesamt 40 ul B-CLL Biotin-Antikörper-Cocktail ausreicht, um eine positive Zelle Sortierungsergebnis erzeugen. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass mit so wenig wie 5 ul mehrere der B-CLL Biotin-Antikörper-Cocktail negativen Auswirkungen auf die Zellen sortiert. Daher empfehlen wir mit 40 ul B-CLL Biotin-Antikörper-Cocktail für insgesamt mononukleären Zellen Zahlen zwischen 175 bis 250.000.000. Wenn ausgehend von niedrigeren oder höheren Anzahl von Zellen kann es erforderlich sein, um die Reagenzien entsprechend skalieren.

Es gibt zahlreiche Veröffentlichungen beschreiben die kollidierenden Marker, die verwendet werden, um zu unterscheiden Subpopulationen von B-Zellen kann. Die meisten der Diskrepanz kann durch die Tatsache, dass die Differenzierung ein kontinuierlicher Prozess ist und dass das Vorhandensein oder Fehlen von Zelloberflächenmarkern tritt in allmählicher Weise anstatt in einer alles oder nichts Weise erläutert. In diesem Protokoll CD34 ^- / CD19 ⁺ und die Intensitätsstufe der CD45 ⁺ (niedrig, mittel, hoch) wurde verwendet, um die Expression Pre-BI, BII pre-und unreife B-Zellen, die mit einer Erhöhung der Höhe der CD45-Expression, die dem Fortschreiten der Differenzierung ⁶ unterscheiden. Pro-B-Zellen wurden von einigen beschrieben worden CD19 sein ⁺ / CD34 ^{+ 13,} während andere haben gezeigt, dass Pro-B-Zellen CD19 sind ^- / CD34 ⁺ und Pre-BI-Zellen sind CD19 ⁺ / CD34 ^{+ 9,10.} Basierend auf dieser Diskrepanzen haben wir die CD19 ⁺ / CD34 ^+-Zellen so spät Pro-B-Zellen / frühen Pre-BI-Zellen bezeichnet. Es ist wichtig anzumerken, dass diese Strategie entwickelt wurde, um Untergruppen von Vorläufer-B-Zellen, die zu den Zellen von der Krankheit betroffen akuter lymphatischer Leukämie entsprechen isolieren. Es gibt jedoch mehrere Sortieranlagen Strategien, die eingesetzt je nach Zellentyp Subtyp von Interesse sein kann.

Antikörper-Fluorochrom Kombinationen sollte basierend auf den Fähigkeiten des Zellsorters ausgewählt werden. Als Gattungenl Regel der hellste Fluorochrom in Ihrem Panel sollte verwendet werden, um die am wenigsten bevölkerten Antigen und vice versa zu kennzeichnen. In Erkennen Doppel-gefärbten Populationen, insbesondere seltene Ereignisse wie diese, ist Dublett Diskriminierung (2B) ein ganz wichtiger Teil der Gating-Strategie. Dadurch wird sichergestellt, dass die Doppel-positiven Ereignisse sind wirklich einzelne Zellen mit beiden Antikörpern und nicht nur zwei Einzel-gefärbten Zellen eingehalten miteinander gefärbt.

Hohe Geschwindigkeit, 4-Wege-cell sorting zwangsläufig schafft eine kontrollierte Aerosol Umwelt. Daher sollte lebenden menschlichen Zellsortierung mit großer Sorgfalt durchgeführt werden. Veröffentlicht Sicherheit und Dekontamination Richtlinien sind verfügbar und sollten überprüft und vor der Sortierung ¹⁴ umgesetzt werden. Genehmigung von Institutional Biosafety Ausschüsse oder deren Äquivalente können vor der Sortierung erforderlich. Für eine ordnungsgemäße Dekontamination nach dem Sortieren sollte Bleichmittel zum Abfallbehälter zu einer Endkonzentration von 10% zugesetzt werden. Similarly, sollten alle Proben Schlauch sowie alle Flächen in der unmittelbaren Umgebung gründlich mit einem frisch zubereiteten 10% Bleichlösung dekontaminiert werden.

Zusammengefasst stellt das Protokoll eine Strategie zum Erhalt seltener Populationen von Vorläufer B-Zellen und kann modifiziert werden, um jegliche seltenen Population in Nabelschnurblut einschließlich hämatopoetischen Stammzellen und unreifen T-Zellen zu isolieren. Kürzlich wurden unreife B-Zellen im peripheren Blut von Patienten mit fortgeschrittener HIV ¹⁵ identifiziert. Daher erstreckt sich die Nützlichkeit dieser Methode jenseits der Studie von Blutkrebs. Schließlich haben wir noch nicht RNA Isolationen auf die Fließeigenschaften sortierten Zellen durchgeführt, aber diese Methode sollte anpassungsfähig sein, mit dem Vorbehalt, dass während Zellsortierung die Zellen direkt sollte in Trizol oder einer gleichwertigen RNA kompatible Lösung wie RLT sortiert werden aus dem RNeasy Kit verfügbar über Qiagen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS (1X)	Gibco by Life Technologies	14190-144
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare Bio-Sciences AB	17-1440-03
LS Column	MACS Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS Multi Stand	MACS Miltenyi Biotec	130-042-303
MidiMACS Separator	MACS Miltenyi Biotec	130-042-302
B-Cell Isolation Kit (B CLL)	MACS Miltenyi Biotec	130-093-660
Fetal Bovine Serum	ATLANTA Biologicals	S11195
Microcentrifuge tube (1.5 ml)	MIDSCI	SS1500
BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)	BD Biosciences	559763
DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19	BD Biosciences	555415
DB Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD34	BD Biosciences	560941
CD45 FITC	BD Biosciences	347463
autoMACS Rinsing Solution	MACS Miltenyi Biotec	130-091-222
MACS BSA Stock Solution	MACS Miltenyi Biotec	130-091-376
BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube	BD Biosciences	352058
BD Falcon 50 ml Tube	BD Biosciences	352098
PuraFlow Sheath Fluid, 8X	Beckman Coulter	CY30230
FlowCheck Alignment beads	Beckman Coulter	6605359
Ultra Rainbow Alignment beads	Spherotech	URFP-30-2
ViroSafe Aerosol Evacuation Filter	Beckman Coulter	ML01330
ABC Mouse bead kit	Invitrogen	A-10344
40 μm cell strainer	Fisher Scientific	22363547
Fisher Scientific Hemocytometer	Fisher Scientific	267110
Microscope
accuSpin Model 3R Benchtop Centrifuge	Fisher Scientific	13-100-516
MoFlo XDP flow Cytometer	Beckman Coulter	ML99030
Aerosol Evacuation Unit	Beckman Coulter