Stereotaktische Mikroinjektion von viralen Vektoren ausdrücken Cre-Rekombinase, um die Rolle der Zielgene in Cocaine konditionierte Platzpräferenz Studieren

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt, wie man virale Vektoren in Mäusegehirn microinject und dann in einem konditionierten Platzpräferenz Paradigma, das eine Akquisition, Aussterben und Wiedereinstellung Phase umfasst testen.

Zusammenfassung

Mikroinjizieren rekombinante virale adenoassoziierten (rAAV) Vektoren, die Cre-Rekombinase in verschiedene Maus Hirnregionen gezielt Knockout Gene von Interesse ermöglicht verbesserte zeitlich und regional-spezifische Kontrolle der Gen-Deletion, im Vergleich zu bestehenden Methoden. Während bedingte Löschung kann auch durch Kreuzen Mäusen erreicht werden, dass express Cre-Rekombinase unter der Kontrolle von spezifischen Gen-Promotoren mit Mäusen, die ein floxed Gen stereotaktischen Mikroinjektion zum Targeting von diskreten Hirnarealen bei Experimentator festgelegten Zeitpunkten von Interesse ermöglicht. Im Zusammenhang mit der Kokain klimatisierten Platzpräferenz und andere Kokain Verhaltensparadigmen wie Selbstverwaltung oder psychomotorische Sensibilisierung das kann Rücktritt, Aussterben und / oder Wiedereinstellung Phasen beinhalten, ist diese Technik besonders nützlich in der Erforschung der einzigartigen Beitrag der Zielgene zu diesen unterschiedlichen Phasen der Verhaltensmodelle von Kokain-induzierte Plastizität. InsbesondereDiese Technik ermöglicht die selektive Ablation von Zielgenen in diskreten Phasen des Verhaltens zu ihrem Beitrag zu dem Verhalten in der Zeit zu testen. Letztlich ermöglicht dieses Verständnis für eine gezieltere Therapie, die am besten in der Lage, die stärksten Risikofaktoren, die sich präsentieren in jeder Phase der Suchtverhalten anzusprechen sind.

Einleitung

Kokain ist eine stark verstärkende Psychostimulanzien. Nach wiederholter Exposition auftreten mehreren molekularen und zellulären Anpassungen in Lohn-relevante Schaltkreise im Gehirn, die glaubten, in zwanghaften führen, sind Drogen-sucht Verhalten, woraufhin hohen Rückfall, die eine schwerwiegende klinische Problem ¹ darstellen. Kokain übt diese langanhaltende Auswirkungen auf das Verhalten von der Regulation der Genexpression. Um die Anpassungen, die an chronischer Kokainkonsum entstehen studieren, haben präklinischen Tiermodellen wurde intensiv genutzt. Ein solches Modell ist das konditionierte Platzpräferenz (CPP) Paradigma. Dieses Modell beinhaltet die Entwicklung eines gelernt Assoziation zwischen einer zuvor neutralen Umgebung und der lohnenden Eigenschaften von Kokain. Nach mehreren Paarungen von Kokain mit einer bestimmten Kammer werden Tiere frei erkunden die Kokain-gepaarten und nicht-Kokain-gepaarten Umgebungen und wenn sie die Droge-gepaarten Fach lieber, man sagt, sie erwarb eine Kokain-induzierte Plac habene Vorlieben. Darüber hinaus ist nach einer vom Aussterben Einarbeitungszeit kann dieses Paradigma verwendet, um kontext-spezifischen Wiedereinsetzung von Kokain-seeking Verhalten zu studieren.

Im Vergleich zu anderen Verhaltensmodelle der süchtig-ähnliches Verhalten, wie psychomotorische Sensibilisierung, die verwendet werden, um langfristige Kokain-induzierte Verhaltens-und molekulare Plastizität ^2,3 und Selbstverwaltung (SA) zu studieren ist, das gedacht wird, genauer nachahmen süchtig -ähnliches Verhalten beim Menschen gefunden wird, ist die CPP Paradigma ein einfaches Verfahren, um Kokain kontextuellen Lernen ⁴ studieren. CPP-Protokolle lassen sich bequem erweitert werden, um Auslöschung und Wiedereinstellung Phasen umfassen, ähnlich wie SA, die für die Untersuchung der Mechanismen, die Gier nach Drogen und Rückfall ^5-7 und von denen angenommen wird, um Aspekte von dem, was geschieht in der menschlichen rekapitulieren Drogen-sucht Verhalten und Drogen erlauben - und Cue-induzierten Rückfall ^8-10.

Ein Mechanismus zugrunde liegt, dass dieKokain-induzierte Verhaltensänderungen Plastizität, die charakteristisch für jede der verschiedenen Phasen von CPP, einschließlich Erwerb, Löschung und Wiedereinstellung ist, ist die Aktivierung eindeutige Signaturen der Genexpression in verschiedenen Hirnregionen. Um direkt zu testen, welche Gene in Lohn-relevanten Hirnregionen vermitteln Verhaltensänderungen Kokain-induzierte, ist es sinnvoll, in der Lage sein, sie zu manipulieren selektiv in einem regional-spezifische Art und Weise. Eine Möglichkeit, dies zu erreichen ist, um rekombinante virale adenoassoziierten (rAAV)-Vektoren, die express Cre-Rekombinase mit stereotaktischen Chirurgie, in verschiedene Hirnareale von Mäusen, die Zielgene von LoxP Websites (floxed Mäuse) flankiert microinject. Dieses Verfahren ermöglicht eine sehr genaue zeitliche und regionale Kontrolle darüber, wann und wo Gene abgetragen werden, in beiden Teilen und nicht teilende Neuronen, ohne eine Immunantwort ^11-13. Dieser Grad der Kontrolle stellt einen wichtigen Vorteil gegenüber herkömmlichen Cre-loxP Technologie der Zucht floxed Mäuse wit Mäusen, die Cre-Rekombinase unter der Kontrolle eines endogenen Gen-Promotor, dadurch gekennzeichnet, daß der Zeitpunkt und die Verteilung der Gen-Deletion kann mehr genau reguliert werden. Außerdem umgeht viralen Vektor-vermittelte Gen-Knockout Potenzial für Entwicklungsstörungen kompensatorische Effekte, die auftreten, mit traditionellen Ko-Strategien können.

Neben Kokain CPP, die hier beschrieben wird, Mikroinjektion von rAAV-Cre in das Gehirn von Mäusen floxed, um die Rolle von spezifischen Genen kann zu Verhaltensstörungen ubiquitär Paradigmen, die einzelnen Phasen, einschließlich Selbstverwaltung und psychomotorische Sensibilisierung beinhalten angewendet werden zu beurteilen. Zum Beispiel hat unser Labor die rAAV-Cre-Technologie verwendet, um die Rolle von Ca _v 1.2 L-Typ-Ca ^{2 +-Kanäle} in Kokain psychomotorische Sensibilisierung ¹⁴ studieren. Insbesondere wurde rAAV-Cre in den Nucleus accumbens (NAC) von Mäusen, die mit dem Gen Ca _v 1.2 floxed, Mikroinjektion zu zeigen, dass Ca _v 1.2 Handeln in dieser Region vermittelt die Expression Phase der psychomotorischen Sensibilisierung ^14,15. Doch die rAAV-Cre-Strategie kann nicht verwendet werden, wenn Mäuse mit einem floxed Gen von Interesse nicht vorhanden sind, wie es unsere Erfahrung bei der Beurteilung der Rolle der Ca _v 1.3 L-Typ-Ca ^{2 +-Kanäle} in psychomotorische Sensibilisierung. Daher stellt eine Einschränkung bei der Verwendung rAAV-Cre selbst wenn bedingte Mäusen nicht für ein bestimmtes Gen von Interesse vorhanden sind. Allerdings rAAVs dass express siRNA Knockdown auf Zielgene verwendet werden können, wie wir es getan, um die Rolle von Ca _v 1.3 Kanäle ^14,15 untersuchen haben.

Mikroinjizieren rAAV-Cre in diskrete Hirnregionen floxed Mäusen und dann testen sie in der CPP Paradigma ermöglicht Untersuchung der spezifischen Gene, die die verschiedenen Phasen der süchtig-ähnliches Verhalten und wo sie tätig sind, zu vermitteln. Verwenden Sie dieses Paradigmas ist in unserem Verständnis geholfen, wie wiederholte Kokain Verwaltung im Wesentlichen die br entführtains Lohn-Schaltung verursacht maladaptive Veränderungen in der molekularen Signalwege und Genexpression, dass zu den süchtigen Zustand ^1,16,17 führen.

Protokoll

Alle Vorgänge werden in Übereinstimmung mit dem Weill Cornell Medical College Institutional Animal Care und Use Committee Regeln durchgeführt.

1. Vorbereitung und Einstellung für Stereotaktische Lieferung von viralen Vektoren

1. Wenn ein Instrument, sterilen Tupfer oder Hand tragen sterile Handschuhe durch den Kontakt mit einem nicht-sterilen Oberfläche verschmutzt ist, verwerfen oder erneut sterilisieren das Instrument mit einem Wulst heißen Sterilisator, entsorgen Sie den Tupfer oder ändern, um neue sterile Handschuhe.
2. Legen Sie eine Maus Käfig mit Decken auf einem Heizblock für post-operative Erholung erwärmen.
3. Einrichten elektrischen Rasierer für Scherkopf und Ethanol und Jod, um die Kopfhaut zu sterilisieren.
4. Wischen Sie Ohr Bars und Mund halten der stereotax mit 70% Ethanol.
5. Mit einem 5 ul Hamilton Spritze, auszuarbeiten 5 ul viralen Vektor (1 x 10 ⁶ Viruspartikel / ul) und Einrichten in Spritzenhalter auf stereotax.
6. Mikrowelle Heizkissen oder drehen Heizkissen auf einend am stereotax. Mit einem sauberen saugfähigen Unterlage, um das Risiko von Verbrennungen zu verringern. Überwachung der Maus Körpertemperatur (zwischen 97-99,5 ° F) häufig den ganzen Vorgang.
7. Injizieren Maus (mit einem Gewicht von 22-35 g) mit einer Mischung aus Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (20 mg / kg). Sobald eine Maus ist betäubt, um Prise Schwanzspitze überprüfen die Maus Reflexe und beachten Sie jegliche Bewegung oder Reaktion, um sicherzustellen, dass die Maus ausreichend betäubt ist.
8. Shave Kopf zwischen den Ohren und Augen.
9. Reinigen Sie rasierten Kopf mit wechselnden Ethanol und Jod sterile Wattestäbchen.
10. Übertragen Maus Heizkissen auf stereotax.

2. Stereotaktische Mikroinjektion von viralen Vektoren

1. Tragen Sie sterile Handschuhe während der Operation. Werden Handschuhe an irgendeinem Punkt durch Berühren unsterilen Oberflächen kontaminiert sind, die Handschuhe wechseln.
2. Null Zahn bar und Ohr bar Skalen.
3. Set Zähne Zahn in bar.
4. Schrauben in der Mündung. Wenn wackeln oder Whisker Umzugment jederzeit festgestellt wird, verwaltet ein IP Auffrischimpfung (~ 0,05 cm) von einer Mischung aus Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (20 mg / kg).
5. Schrauben in Ohr Bars.
6. Schmieren Sie die Augen mit Puralube.
7. Kopfhaut aufgeschnitten, nur hinter den Ohren mit einem Skalpell.
8. Platz Bulldogge Clips an den Ecken der Kopfhaut zu schälen die Haut vom Schädel. Bregma und Lambda sollte gut sichtbar sein.
9. Stellen Sie sicher, Nahtmaterial von Bregma Lambda ist gerade ausgerichtet. Wenn die Naht ist krumm nachjustieren Positionierung des Kopfes.
10. Überprüfen Sie, ob alle Einstellungen auf dem stereotax Null sind.
11. Setzen Nadelspitze in Ort bei Bregma.
12. Messen Sie alle Koordinaten für beide Bregma und Lambda. Dazu gehören dorsal / ventral, medial / lateral und anterior / posterior-Koordinaten.
13. Stellen Sie den Kopf, bis die ventralen Koordinaten für Bregma und Lambda innerhalb 0,02 mm von einander sind.
14. Einmal ausgerichtet, gehen von Bregma medial aus den medialen / lateralen (M / L) Koordinaten. Stellen Sie sicher,die linken und rechten Seiten in 0,02 mm zueinander ausgerichtet sind.
15. Re-Zentrum Nadelspitze auf Bregma und von dort aus bewegen sich in der anterioren / posterioren (A / P) in Richtung auf die gewünschte anterioren / posterioren Koordinate.
16. Gegebenenfalls Winkel Nadel in einer Richtung und sicherzustellen, dass die stereotax gesperrt ist. Gehe nach links M / L-Koordinate (+ / - 1,52)
17. Messen Sie die Position des ventralen Spitze des Schädels als Referenz zu verwenden, nachdem das Bohrloch gebohrt.
18. Bohren eines Bohrlochs mit einem sterilen Bohrer an den gewünschten Koordinatensystem. Prüfen Sie, ob die Nadel durch den Schädel geben ununterbrochen.
19. Senken Sie die Nadel an die gewünschte ventralen Koordinate.
20. Sobald die Koordinaten erreicht ist, dip 0,015 mm unten ~ 10 Sek. eine kleine Tasche für den viralen Vektor zu erstellen.
21. Injizieren Sie die gewünschte Lautstärke von viralen Vektor mit einer Rate von ~ 0,1 ml / min. Warten Sie 3 min für viraler Vektor vollständig diffundieren. Heben Sie die Nadelspitze 0,015 mm und warten Sie eine weitere 2 min.
22. Tauchen der Nadel (wenn dies abgewinkelten Injektionen) in die entgegengesetzte Richtung. Wieder, notieren Sie die Bauchlage als Referenz für die Oberseite des Schädels.
23. Wiederholen Sie die gleichen Schritte wie auf der ersten Seite zu viralen Vektors auf der gegenüberliegenden Seite zu injizieren (wenn dies bilateralen Injektionen).
24. Bewerben Knochenwachs zu beiden Löcher, um sie zu versiegeln mit dem hölzernen Ende einer sterilen Watteträger Spitze.
25. Naht die Kopfhaut.
26. Bewerben Blockade der verwundeten Bereich.
27. Entfernen Maus von stereotax und in erwärmt Käfig auf Heizblock für 45 min erholen.
28. Monitor für Anzeichen von Schmerzen einschließlich: verminderte Aktivität oder Ruhelosigkeit, verminderte Futter-und Wasseraufnahme oder erhöhte Lautäußerungen. Buprenorphin (0,05-0,2 mg / kg) kann zweimal täglich für eine Woche verabreicht werden, wenn notwendig, zur Schmerztherapie. Akzeptable Alternativen sind: Meperidin (20-60 mg / kg), Pentazocin (10 mg / kg), Nalbuphin (4-8 mg / kg).

3. Klimatisierte Platz Vorlieben: Acquisition, Extinction und Wiedereinsetzung

1. Platz Mäuse in die zentrale Kammer eines Drei-Kammer Platzpräferenz Vorrichtung (Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA) für eine 60 sec Eingewöhnungszeit mit Guillotine Türen geschlossen.
2. Nach Gewöhnung, offene Türen und Guillotine erlauben Mäuse freien Erforschung aller 3 Kammern für 1.200 sec, mit der Zeit in jeder Kammer aufgezeichnet mit MedPC IV Software (Med Associates, Inc.) verbracht.
3. Weisen Mäuse Klimakammern auf ihre Leistung während der Pre-Test. Mit einem vorgespannten Design, Paar Medikamentengabe während der folgenden 3 Tagen mit dem Fach, das am wenigsten bevorzugte während der Baseline-Vortest war.
4. In den nächsten 3 Tagen Klimaanlage, injizieren Mäusen mit Kokain (10 mg / kg; ip) am Vormittag und beschränken sie auf ihren zugewiesenen Kammer für 1.200 sec unmittelbar nach der Injektion. Zurück Mäuse ihre Käfige nach der Sitzung. Nach 4 Stunden, injizieren Mäuse mit Kochsalzlösung (0,01 ml / gKörpergewicht) und beschränken sie auf die gegenüberliegende Kammer für die 1.200 Sek. Nachmittagssitzung.
5. Um für den Erwerb zu testen, geschlossen Ort Mäuse in der zentralen Kammer mit Guillotine Türen für einen 60 sec Eingewöhnungszeit. Offene Türen und Guillotine ermöglichen die freie Exploration 1.200 sec, mit der Zeit in allen Kammern durch MedPC IV Software (Med Associates, Inc.) aufgezeichnet verbracht. Berechnen Vorlieben, indem die Menge an Zeit in der Saline-gepaart Kammer von der Höhe der Zeit in der Kokain-gepaarten Kammer verbracht wird.
6. Um die Platzpräferenz löschen, setzen Mäuse auf zwei 20 min Sitzungen des freien Exploration täglich in der gleichen Apparatur, um mindestens 2 Stunden getrennt, beginnend 24 Stunden nach der Prüfung für den Erwerb. Zeit in allen Kammern verbracht sollten wieder aufgenommen werden, und die Größe des anfänglichen CPP sollte, dass jedes Aussterben Sitzung verglichen werden.
7. Bestimmen Sie, ob Mäuse haben die Arzneimittel-induzierte Bevorzugung durch die Beurteilung, ob Präferenz für ein par erloschendere Kammer über zwei aufeinanderfolgende Tage Aussterben ist deutlich niedriger im Vergleich zum Erwerb Vorlieben der Gäste.
8. Wiedereinsetzung der Mäuse mit einer Anfangsdosis von Kokain (5 oder 10 mg / kg; ip) und an das Gerät eine freie Exploration erneut aussetzen und notieren Sie die Zeit in jedem Abteil verbracht.
9. Verwalten Euthasol Euthanasie-Lösung (150 mg / kg). Transkardial perfundieren Mäuse mit 4% Paraformaldehyd (PFA) und führen Sie eine histologische Untersuchung, um die korrekte Platzierung Mikroinjektion validieren.

Ergebnisse

CPP

Nach Durchführung CPP auf mikroinjizierten Mäuse, sollte man sicherstellen, dass die Kohorte der Kontrolle injizierten (rAAV-GFP) Mäusen haben normalerweise Präferenz für die Droge-gepaart Kammer (1A, 1B) erworben. Mäuse werden als erworben Präferenz für eine bestimmte Kammer haben, wenn Kokain Vorlieben (Zeit in der Kokain-gepaarten Kammer minus Zeit in der Saline-Zweikammer aufgewendet) ist deutlich höher im Vergleich zum Ausgangswert Vorlieben der Gäste

Diskussion

Regional-und zeitlich-spezifische Gen-Ablation über stereotaktischen Mikroinjektion von viralen Vektoren mit CPP kombiniert das Aussterben und Wiedereinstellung Phasen beinhaltet ermöglicht die Untersuchung der spezifischen Beiträge von Genen zu drei verschiedene Phasen der Sucht-Verhalten. Während konditionellen Knockout, die erreicht werden, indem die traditionelle Cre-loxP-System sorgt für räumlich-zeitlich beschränkt Genablation, stereotaxically Mikroinjizieren Cre-Rekombinase in diskrete Hirnareale von floxe...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Conditioned place preference activity chambers	Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA	MED-CPP-MS
Stereotaxic alignment system for mouse	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	model 900
Hamilton syringes	Hamilton Company, Reno, Nevada, USA	7634-01
rAAV2-Cre-GFP	Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA	7016
rAAV2-GFP	Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA	7004