Microinjeção estereotáxica de vetores virais Expressando Cre Recombinase para estudar o papel de genes alvo em cocaína condicionado Lugar de Preferência

Resumo

Este artigo descreve como microinject vetores virais em cérebro de camundongos e teste em um paradigma de preferência local condicionado, que inclui uma fase de aquisição, extinção e reintegração.

Resumo

Microinjecting virais (rAAV) vetores recombinantes adenoassociados expressando Cre recombinase em regiões do cérebro do rato distintas seletivamente genes knockout de interesse permite maior controle temporal e regionalmente específica de deleção do gene, em comparação com os métodos existentes. Enquanto a deleção condicional também pode ser conseguida por acoplamento ratinhos que expressa recombinase Cre sob o controle de promotores de genes específicos com ratinhos que transportam um gene floxed, microinjecção estereotáxico permite a determinação das áreas discretas do cérebro em pontos de interesse tempo experimentador-determinados. No contexto de preferência lugar cocaína condicionado, e outros paradigmas comportamentais da cocaína tais como a auto-administração ou sensibilização psicomotora, que pode envolver a retirada de restabelecimento fases, extinção e / ou, esta técnica é particularmente útil para explorar a contribuição única de genes-alvo para estes distintos fases de modelos comportamentais de plasticidade induzida pela cocaína. Especificamente,esta técnica permite a ablação seletiva de genes-alvo durante as fases distintas de um comportamento para testar a sua contribuição para o comportamento ao longo do tempo. Em última instância, esse entendimento permite terapêuticas mais específicas, que são mais capazes de lidar com os fatores de risco mais potentes que se apresentam durante cada fase do comportamento viciante.

Introdução

A cocaína é um psicoestimulante altamente reforço. Após a exposição repetida, várias adaptações celulares e moleculares ocorrem em circuitos cerebrais de recompensa relevante que são acreditados para resultar em compulsivo de drogas comportamento de busca, fazendo com altas taxas de recaída que representam um sério problema clínico ^1. A cocaína exerce esses efeitos comportamentais de longa duração por regulação da expressão gênica. Para estudar as adaptações que surgem do uso crônico da cocaína, os modelos pré-clínicos de roedores têm sido amplamente utilizados. Um tal modelo é a preferência paradigma local condicionado (CPP). Este modelo envolve o desenvolvimento de uma associação entre um ambiente aprendido anteriormente neutro e as propriedades gratificantes de cocaína. Depois de vários pares de cocaína com uma câmara particular, os animais estão autorizados a explorar livremente os ambientes cocaína pareado e não-pareado cocaína e se eles preferem o compartimento de droga pareado, eles dizem ter adquirido uma plac induzida pela cocaínae de preferência. Além disso, na sequência de um período de treino de extinção, este paradigma podem ser usadas para estudar a reintegração específica do contexto do comportamento de procura de cocaína.

Em comparação com outros modelos comportamentais de comportamento aditivo semelhante, tais como a sensibilização psicomotora, que é usada para estudar a longo prazo induzida por cocaína comportamental e plasticidade molecular ^2,3 e auto-administração (SA), que é pensado para mimetizar mais precisamente viciante -como o comportamento encontrado em seres humanos, o paradigma CPP é um procedimento simples para estudar cocaína aprendizagem contextual ^4. Protocolos CPP pode ser convenientemente estendido para incluir as fases reintegração extinção e, à semelhança do SA, que permitem a investigação dos mecanismos subjacentes a ânsia da droga e recaída ^5-7 e que são acreditados para recapitular aspectos do que ocorre em humanos droga comportamento de busca e drogas - e cue-induced recaída ^8-10.

Um mecanismo que está na base dainduzida por cocaína plasticidade comportamental, que é característica de cada uma das fases distintas do CPP, incluindo a aquisição, extinção, e reposição, é a activação de assinaturas únicas de expressão do gene em diferentes regiões do cérebro. Para testar quais genes directamente dentro das regiões do cérebro relevantes para mediar a recompensa cocaína induziu alterações comportamentais, é útil ser capaz de manipular selectivamente de forma regional específica. Uma maneira de conseguir isso é microinject vetores virais recombinantes adenoassociados (rAAV) que expressam Cre recombinase usando cirurgia estereotáxica, em áreas distintas do cérebro de ratos que têm genes alvo ladeado por sites LoxP (ratos floxed). Este método permite um controlo temporal e regionais muito preciso sobre quando e onde os genes são ablação, em ambos os neurónios que dividem e que não se dividem, sem induzir respostas imunes ^11-13. Este nível de controle representa uma vantagem importante sobre a tecnologia tradicional Cre-LoxP de reprodução camundongos floxed with ratinhos que expressam a recombinase Cre sob o controle de um promotor de gene endógeno, em que a temporização e distribuição de deleção do gene pode ser mais fortemente regulado. Além disso, o vetor viral mediada por nocaute gene evita potenciais efeitos de compensação de desenvolvimento que podem ocorrer usando estratégias knockout tradicionais.

Em adição à cocaína CPP, que é aqui descrito, a microinjecção de rAAV-Cre no cérebro de ratinhos floxed para avaliar o papel de genes específicos pode ser aplicado para ubiquamente paradigmas comportamentais que envolvem fases distintas, incluindo a auto-administração e sensibilização psicomotora. Por exemplo, o nosso laboratório tem utilizado a tecnologia de rAAV-Cre para estudar o papel do Ca _{V 1.2} canais de Ca ^{2 +} do tipo-L de cocaína psicomotora sensibilização ^14. Especificamente, rAAV-Cre foi microinjectado no núcleo accumbens (NAC) de ratinhos com o gene que codifica a Ca _v 1.2 floxed, para demonstrar que o Ca _v 1.2 atuando nesta região medeia a fase de sensibilização psicomotora ^14,15 expressão. No entanto, a estratégia de rAAV-Cre não pode ser utilizado se os ratos com um gene de interesse floxed não existem, como foi a nossa experiência quando se avalia o papel de Ca _V 1.3 canais de Ca ^{2 +} do tipo-L de sensibilização psicomotora. Assim, uma limitação da utilização de rAAV-Cre apresenta-se se os ratos condicionados não existem para um determinado gene de interesse. No entanto, rAAVs que expressam siRNA podem ser usadas para genes alvo knockdown, como fizemos para examinar o papel do CA _V 1.3 canais ^14,15.

Microinjecting rAAV-Cre em regiões cerebrais distintas de camundongos floxed e, em seguida, testá-las no paradigma do CPP permite a investigação sobre os genes específicos que medeiam as várias fases do comportamento viciante-como e onde eles estão atuando. O uso deste paradigma tem ajudado na nossa compreensão de como a administração repetida de cocaína em essência seqüestra o brains circuito de recompensa causando alterações inadequadas em vias de transdução de sinal molecular e expressão de genes que levam ao estado viciado ^1,16,17.

Protocolo

Todos os procedimentos são realizados em conformidade com o Weill Cornell Medical College Animal Care Institucional e Comitê de Regras de Uso.

1. Preparação e configuração para entrega estereotáxica de vetores virais

1. Se um instrumento, cotonete estéril, ou a mão usando luva estéril é contaminado ao entrar em contato com uma superfície não-estéril, descarte ou re-esterilizar o instrumento utilizando um esterilizador talão quente, descartar o cotonete ou mudar para novas luvas estéreis.
2. Coloque a gaiola do rato com roupa de cama em um bloco de calor para aquecer para a recuperação pós-operatória.
3. Configure barbeador elétrico para barbear cabeça e etanol e iodo para esterilizar o couro cabeludo.
4. Limpe as barras de ouvido e mantenha a boca do stereotax com etanol 70%.
5. Usando a 5 mL seringa Hamilton, elaborar 5 mL de vetor viral (1 x 10 ⁶ partículas virais / l) e criado em suporte de seringa em stereotax.
6. Almofada de aquecimento por microondas ou virar bloco elétrico em umº lugar em stereotax. Cubra com uma almofada absorvente limpa para reduzir o risco de queimaduras. Monitor de temperatura corporal do rato (entre 97-99,5 ° F) com freqüência durante todo o procedimento.
7. Injectar rato (pesando entre 22-35 g) com uma mistura de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (20 mg / kg). Uma vez que um rato é anestesiado, ponta da cauda pitada de verificar os reflexos do rato e observe qualquer movimento ou resposta para garantir que o mouse está devidamente anestesiados.
8. Raspar a cabeça entre as orelhas e os olhos.
9. Limpe a cabeça raspada com a alternância de etanol e iodo aplicadores de algodão estéreis.
10. Transferir mouse para pad aquecida em stereotax.

2. Microinjeção estereotáxica de vetores virais

1. Usar luvas estéreis durante toda a cirurgia. Se as luvas estão contaminadas em qualquer ponto ao tocar superfícies não-estéreis, mude as luvas.
2. Zero bar dente e escala de barras de ouvido.
3. Definir os dentes na barra do dente.
4. Aperte focinho. Se mexer ou bigode movimentomento é de notar, a qualquer momento, administrar uma dose de reforço IP (~ 0,05 cc) de uma mistura de cetamina (100 mg / kg) e xilazina (20 mg / kg).
5. Parafuso em bares de ouvido.
6. Lubrifique os olhos com PuraLube.
7. Corte couro cabeludo aberto apenas atrás das orelhas com um bisturi.
8. Coloque grampos bulldog nos cantos do couro cabeludo para descascar a pele longe do crânio. Bregma e lambda deve ser facilmente visível.
9. Certifique-se de sutura de bregma ao lambda está alinhada reta. Se a sutura é o posicionamento reajuste torto da cabeça.
10. Verifique se todas as configurações no stereotax são zerados.
11. Coloque a ponta da agulha no lugar em bregma.
12. Meça todas as coordenadas para tanto bregma e lambda. Isso inclui coordenadas dorsal / ventral, lateral / medial e anterior / posterior.
13. Ajustar a cabeça até que as coordenadas ventrais para bregma e lambda estão dentro de 0,02 milímetros um do outro.
14. Uma vez alinhada, a partir bregma ir medialmente para as coordenadas medial / lateral (M / L). Certificar-seos lados esquerdo e direito estão alinhados dentro de 0,02 milímetros um do outro.
15. Re-center ponta da agulha no bregma e de lá se mover na direção anterior / posterior (A / P) para atingir a cota anterior / posterior desejado.
16. Se necessário, agulha ângulo em uma direção e verifique se o stereotax está bloqueado. Vá para a esquerda M / L de coordenadas (+ / - 1,52)
17. Medir a posição ventral do topo do crânio para usar como uma referência, após o furo é perfurado.
18. Faça um furo com uma broca estéril na coordenada desejada. Verificar que a agulha pode entrar ininterrupta através do crânio.
19. Abaixe a agulha para a coordenada ventral desejado.
20. Uma vez que a cota é alcançada, dip 0,015 milímetros abaixo de ~ 10 segundos para criar uma pequena bolsa para o vector viral.
21. Injectar o volume desejado de vector virai, a uma taxa de ~ 0,1 mL / min. Espere 3 min para o vetor viral para difundir completamente. Levante a agulha ponta de 0,015 milímetros e esperar um adicional de 2 min.
22. Mergulhar o agulha (se fazendo injecções angulares) no sentido oposto. De novo, o registo da posição ventral como uma referência para o topo do crânio.
23. Repita os mesmos passos como no primeiro lado para injetar vetor viral no lado oposto (se fazendo injeções bilaterais).
24. Aplique cera de osso para ambos os buracos para selá-los usando o final de madeira de uma ponta do aplicador de algodão estéril.
25. Sutura no couro cabeludo.
26. Aplicar o bloqueio do nervo para a área ferida.
27. Retire do mouse de stereotax e coloque em gaiola aquecida em bloco de calor para se recuperar por 45 min.
28. Monitorar os sinais de dor, incluindo: diminuição da atividade global ou agitação, diminuição do consumo de alimentos e água ou aumento da vocalização. A buprenorfina (0,05-0,2 mg / kg), pode ser administrada duas vezes por dia durante uma semana, se necessário para a dor. As alternativas aceitáveis ​​incluem: meperidina (20-60 mg / kg), pentazocina (10 mg / kg), nalbufina (4-8 mg / kg).

3. Condicionado Lugar de Preferência: Acquisition, extinção e Reintegração

1. Camundongos lugar para a câmara central de um lugar aparelho preferência de três câmaras (Med Associates Inc., St. Albans, VT, EUA) para um período de habituação 60 seg com portas guilhotina fechada.
2. Depois de habituação, portas guilhotina abertas e permitir que os ratos livre exploração de todas as três câmaras para 1,200 seg, com o tempo gasto em cada câmara a ser gravado usando o software MedPC IV (Med Associates, Inc.).
3. Atribuir ratos para câmaras de condicionamento com base em seu desempenho durante o pré-teste. Usando um desenho, a administração da droga par inclinado durante os três dias seguintes, com o compartimento que era menos preferido durante o pré-teste de linha de base.
4. Durante os próximos 3 dias condicionado, injetar camundongos com a cocaína (10 mg / kg, ip) durante a sessão da manhã e confiná-los em sua câmara atribuído para 1200 sec imediatamente após a injeção. Voltar ratos para suas gaiolas para casa depois da sessão. Depois de quatro horas, injetar camundongos com solução salina (0,01 ml / gde peso corporal) e confinam à câmara oposta para a sessão de 1,200 seg tarde.
5. Para testar a aquisição, ratinhos lugar na câmara central com portas de guilhotina fechado por um período de habituação de 60 seg. Portas de guilhotina abertas e permitem a livre exploração para 1200 sec, com o tempo gasto em todas as câmaras gravadas por software MedPC IV (Med Associates, Inc.). Calcular preferência subtraindo a quantidade de tempo gasto na câmara de solução salina-emparelhado a partir da quantidade de tempo gasto na câmara de cocaína-emparelhado.
6. Para extinguir a preferência de lugar, expor os ratos a duas sessões de 20 min de exploração livre diários no mesmo aparelho, separados por pelo menos 2 horas, começando 24 horas após o teste para a aquisição. O tempo gasto em todas as câmaras devem voltar a ser gravado e a magnitude do CPP inicial deve ser comparado com aquele de cada sessão de extinção.
7. Determinar se os ratos têm extinta a preferência induzida por drogas, avaliando se a preferência por um parcâmara cular em dois dias consecutivos de extinção é significativamente menor em comparação com a pontuação preferência de aquisição.
8. Restabelecer ratinhos com uma dose preparatória de cocaína (5 ou 10 mg / kg, ip) e re-exposição ao aparelho permitindo a exploração livre e registar o tempo gasto em cada compartimento.
9. Administrar solução eutanásia Euthasol (150 mg / kg). Transcardially perfundir ratos com paraformaldeído 4% (PFA) e efectuar um exame histológico para validar a colocação microinjeção correta.

Resultados

CPP

Depois de realizar CPP em ratos microinjetados, deve-se verificar que o grupo de controle de injecção (rAAV-GFP) camundongos normalmente adquirido preferência para a câmara de drogas pareado (Figura 1A, 1B). Ratos são considerados como tendo adquirido preferência por uma câmara especial quando preferência cocaína (tempo gasto na câmara de cocaína-emparelhado menos tempo gasto na câmara de solução salina-emparelhado), é significativamente superior em comparaç...

Discussão

Regionalmente e ablação gene específico temporalmente via microinjeção estereotáxica de vetores virais combinados com CPP, que inclui as fases de reintegração extinção e permite uma investigação das contribuições específicas de genes de três fases distintas de comportamento viciante-like. Enquanto knockout condicional que é alcançado utilizando o sistema Cre-LoxP tradicional prevê espaço-temporalmente ablação gene restrito, stereotaxically microinjecting Cre-recombinase em áreas cerebrais distinta...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Conditioned place preference activity chambers	Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA	MED-CPP-MS
Stereotaxic alignment system for mouse	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	model 900
Hamilton syringes	Hamilton Company, Reno, Nevada, USA	7634-01
rAAV2-Cre-GFP	Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA	7016
rAAV2-GFP	Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA	7004