크레 재조합이 코카인 컨디셔닝 장소 환경에있는 표적 유전자의 역할을 연구하는 표현 바이러스 성 벡터의 정위 미세 주입

요약

이 문서에서는 마우스의 뇌에 바이러스 벡터를 microinject하고 수집, 멸종 위기 및 회복 단계를 포함하는 에어컨 장소 환경 패러다임에서 테스트하는 방법에 대해 설명합니다.

초록

관심 선택적으로 녹아웃 유전자 뚜렷한 마우스 뇌 영역에 크레 재조합을 표현하는 재조합 adenoassociated 바이러스 (rAAV) 벡터를 Microinjecting은 기존의 방법에 비해, 유전자 삭제의 강화 시간적 및 지역적 특정 제어 할 수 있습니다. 조건부 삭제는 floxed 유전자를 운반 쥐 특정 유전자 프로모터의 통제하에 표현 Cre 호텔 재조합이 정위 microinjection의 관심의 실험 정해진 시간 지점에서 분리 된 뇌 영역의 대상을 허용하는 짝짓기 마우스에 의해 달성 될 수 있지만. 코카인 에어컨 장소 환경, 그리고 자기 관리 또는 철회, 멸종 및 / 또는 회복 단계를 포함 할 수 정신 과민성 등의 코카인 행동 패러다임의 맥락에서,이 기술이 별개로 표적 유전자의 독특한 공헌을 탐험에 특히 유용합니다 코카인에 의한 소성의 행동 모델의 단계. 특히,이 기술은 시간에 걸쳐 행동에 대한 그들의 공헌을 테스트하는 행동의 개별 단계에서 표적 유전자를 선택적으로 제거 할 수 있습니다. 궁극적으로,이 이해는 습관성 행동의 각 단계에서 자신을 제시 가장 강력한 위험 요소를 해결하는 것이 가장 수 있습니다 더 많은 표적 치료 할 수 있습니다.

서문

코카인은 매우 강화 각성제이다. 반복 노출에 따라 여러 가지 분자 및 세포 적응이 강박의 결과로 생각된다 보상 관련 뇌 회로에서 발생하는 약물 추구 심각한 임상 문제 ¹ 포즈 재발의 높은 속도를 자극하는 행동을. 코카인은 유전자 발현을 조절하여이 오래 지속 행동 효과를 발휘한다. 만성 코카인 사용에서 발생 적응을 연구, 전임상 설치류 모델은 광범위하게 사용되어왔다. 하나의 모델은 에어컨 장소 환경 설정 (CPP) 패러다임이다. 이 모델은 이전에 중립적 환경과 코카인의 보람 속성 간의 배운 협회의 발전을 포함한다. 특정 챔버 코카인의 여러 쌍 후, 동물은 자유롭게 코카인 페어링 비 코카인 한 쌍이 환경을 탐색 할 수 있습니다 그리고 그들은 약 한 쌍이 함을 선호하는 경우, 그들은 코카인 유도 plac에 인수했다고하는전자 환경. 또한, 멸종 훈련 기간에 따라,이 패러다임은 코카인을 추구하는 행동의 특정 컨텍스트 회복을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

이러한 중독성 모방보다 정확하게 생각되는 장기 코카인에 의한 행동 및 분자 소성 ^2,3과 자기 관리 (SA) 연구하는 데 사용되는 정신 과민성, 같은 중독성이 같은 행동의 다른 행동 모델에 비해 와 같은 인간에있는 행동, CPP 패러다임은 코카인 상황에 맞는 학습 ^4를 연구하는 간단한 절차입니다. CPP 프로토콜은 편리 유사 약물 갈망과 재발 ^5-7과 어떤 인간에서 발생하는 측면 요점을 되풀이 것으로 추정된다 약물 추구 행동과 약물을 기본 메커니즘을 조사 할 수 SA에 멸종과 복직 단계를 포함하도록 확장 할 수 있습니다 - 그리고 큐 유발 재발 ^8-10.

하나의 메커니즘 그게 기초가수집, 멸종, 그리고 복직 등 CPP의 서로 다른 단계의 각각의 특징이다 코카인 유도 행동 가소성은 다른 뇌 영역 내에서 유전자 발현의 고유 한 서명의 활성화이다. 직접 행동 변화를 코카인 유도 중재 보상 관련 뇌 영역 내에서 어떤 유전자 테스트하기 위해, 지역적으로 고유의 방식으로 선택적으로 조작 할 수있을 때 유용합니다. 이 달성하는 한 가지 방법은 표현 Cre 호텔 재조합이 LoxP 사이트 (floxed 마우스)에 의해 측면 표적 유전자를 생쥐의 서로 다른 뇌 영역에, 정위 수술을 사용하는 재조합 adenoassociated 바이러스 (rAAV) 벡터를 microinject하는 것입니다. 이 방법은 언제, 어디서 유전자가 면역 반응은 ^11-13 유발하지 않고, 모두 분할 및 비 나누어 뉴런에서 소작하는 동안 매우 정확한 시간적 및 지역 제어 할 수 있습니다. 이 수준의 제어는 floxed 쥐에게 w를 사육 전통적인 크레-LoxP 기술에 중요한 이점을 나타냅니다점에서, 내생 유전자 프로모터의 통제하에 Cre 호텔 재조합을 표현하는 i 번째 마우스는 타이밍과 유전자 삭제 분포는보다 긴밀하게 조정할 수 있습니다. 또한, 바이러스 벡터를 매개로 유전자 녹아웃은 기존의 녹아웃 전략을 사용하여 발생할 수있는 발달 보상 효과를 우회.

자기 관리와 정신 과민성 등의 별도의 단계를 포함하는 행동 패러다임에 재하 적용 할 수있는 특정 유전자의 역할을 평가하기 위해 floxed 생쥐의 두뇌로, 여기 rAAV - Cre 호텔의 microinjection에 설명되어 코카인 CPP,뿐만 아니라. 예를 들어, 우리 연구실은 코카인 정신 과민성 ¹⁴ 카 _V 1.2 L-타입 칼슘 ^{2 +} 채널의 역할을 연구하는 rAAV - Cre 호텔 기술을 활용하고있다. 특히, rAAV - Cre 호텔은 보여주기 위해 유전자 인코딩 칼슘 _V 1.2 floxed과 생쥐의 핵의 accumbens (NAC)에 미세 주입 한 해당 CA _V 1.2이 지역 중재에 정신 과민성 ^14,15의 발현 단계 행동. 정신 과민성 캘리포니아 _V 1.3 L-타입 칼슘 ^{2 +} 채널의 역할을 평가할 때 그 floxed 유전자를 가진 마우스가 존재하지 않는 경우, rAAV - Cre 호텔 전략을 사용할 수 없습니다, 우리의 경험이었다. 조건부 마우스가 관심의 특정 유전자가 존재하지 않는 경우 따라서, rAAV - Cre 호텔을 사용의 제한 자체를 제공합니다. 그러나 우리는 칼슘 _V 1.3 채널 ^14,15의 역할을 검토했던 것처럼 표현의 siRNA가 최저 목표 유전자로 사용할 수 있습니다 rAAVs.

floxed 생쥐의 분리 된 뇌 영역에 rAAV - Cre 호텔을 Microinjecting하고 CPP 패러다임을 테스트하는 다양한 중독과 같은 행동의 단계와 그들이 어디 행동하는을 중재 특정 유전자에 조사 할 수 있습니다. 이 패러다임의 사용은 본질적으로 반복 코카인 투여 BR을 탈취하는 방법에 대한 우리의 이해에 주었AINS 보상 회로는 중독 상태 ^1,16,17로 이어질 것을 분자 신호 전달 경로와 유전자 발현의 부적응 변화를 일으키는.

프로토콜

모든 절차는 웨일 코넬 의과 대학 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 규칙에 따라 진행됩니다.

1. 준비 및 바이러스 성 벡터의 정위 납품 설치

1. 장비, 멸균 면봉, 또는 멸균 장갑을 착용 손 비 멸균 표면과 접촉에 의해 오염되는 경우 뜨거운 비드 살균기를 사용하여 기기를 폐기하거나 다시 소독 면봉을 삭제하거나 새로운 멸균 장갑을 변경합니다.
2. 수술 후 회복을 따뜻하게 열 블록 침구 마우스 케이지를 놓습니다.
3. 두피를 소독 머리와 에탄올과 요오드를 면도 전기 면도기를 설정합니다.
4. 70 % 에탄올로 귀 바, stereotax의 입 홀드를 닦아냅니다.
5. 5 μL 해밀턴 주사기를 사용하여 바이러스 벡터 (1 X 10 ⁶ 바이러스 입자 / μL)의 5 μl를 수립하고 stereotax에 주사기 홀더에 설정합니다.
6. 마이크로파 가열 패드 나에 전기 패드를 켜stereotax에 차 장소. 화상의 위험을 줄이기 위해 깨끗한 흡수성 패드로 커버. 마우스 모니터 체온 (97-99.5 ° F 사이) 자주 절차를 걸쳐.
7. 케타민 (100 mg / kg)과 xylazine (20 MG / kg)의 혼합물로 마우스를 (22-35g 사이의 무게) 주입. 마우스가 마취되면, 핀치 꼬리 끝은 마우스의 반사를 확인하고 마우스가 적절하게 마취 있는지 확인하기 위해 어떤 움직임이나 반응에 유의한다.
8. 눈과 귀 사이의 머리를 면도.
9. 에탄올과 요오드 살균면 도포를 번갈아 면도 헤드를 청소합니다.
10. stereotax에 가열 패드에 마우스를 전송합니다.

2. 바이러스 성 벡터의 정위 미세 주입

1. 수술을 통해 멸균 장갑을 착용 할 것. 장갑은 비 멸균 표면을 만져 어느 시점에서 오염 된 경우 장갑을 변경합니다.
2. 제로 치아 바, 귀 막대 저울.
3. 치아 줄에 이빨을 설정합니다.
4. 총구에 고정합니다. 방도를 강구 또는 수염 이동하는 경우MENT 언제든지 지적이다, 케타민 (100 mg / kg)과 xylazine (20 MG / kg)의 혼합물 IP 부스터 선량 (~ 0.05 cc) 관리 할 수​​ 있습니다.
5. 귀 막대에 고정합니다.
6. PuraLube로 눈을 윤활.
7. 바로 메스 귀 뒤에 열린 두피를 잘라.
8. 피부 껍질 떨어져 두개골에서의 두피의 모서리에 장소 불독 클립. 브레 그마 및 람다 쉽게 볼 수 있어야합니다.
9. 브레 그마에서 람다에 제대로 봉합을가 똑바로 정렬됩니다. 봉합은 머리의 비뚤어진 재조정 위치됩니다.
10. stereotax의 모든 설정이 제로되어 있는지 확인합니다.
11. 브레 그마의 장소에 바늘 끝을 넣어.
12. 브레 그마 및 람다 모두의 모든 좌표를 측정합니다. 이 복부 / 지느러미, 측면 / 내측과 전방 / 후방 좌표를 포함합니다.
13. 브레 그마 및 람다의 복부 좌표가 각각 0.02 mm 이내가 될 때까지 머리를 조정합니다.
14. 일단 (M / L) 측면 / 중간 좌표로 내측 브레 그마에서 나가 정렬. 확인왼쪽과 오른쪽은 각각 0.02 mm 내에서 정렬됩니다.
15. 브레 그마에서 거기에서 다시 중심 바늘 끝은 원하는 후방 / 전방 좌표 (A / P) 후방 / 전방 방향으로 이동합니다.
16. 필요한 경우, 각 한 방향으로 바늘과 stereotax가 잠겨 있는지 확인합니다. (- 1.52 + /) 왼쪽 M / L 좌표로 가서
17. 시추공을 뚫은 후 참조로 사용하는 두개골의 상단 복부 위치를 측정합니다.
18. 원하는 좌표에서 멸균 드릴 비트를 사용하여 시추공을 뚫습니다. 바늘이 두개골을 중단 입력 할 수 있는지 확인하십시오.
19. 원하는 복부 좌표에 바늘을 낮 춥니 다.
20. 일단 좌표 딥 0.015 mm은 바이러스 벡터에 대한 작은 포켓을 만드는 ~ 10 초 동안 아래에 도달한다.
21. ~ 0.1 μL / min의 속도로 바이러스 벡터의 원하는 볼륨을 주입한다. 완전 확산 바이러스 벡터에 대한 3 분을 기다립니다. 바늘 끝 0.015 mm를 올리고 추가로 2 분을 기다립니다.
22. 반대 방향으로 바늘을 (각도 주사하는 경우) 찍어. 다시 두개골의 상단에 대한 참조로 복부 위치를 기록합니다.
23. (양자 주사하는 경우) 반대편에 바이러스 벡터를 주입하는 첫 번째면에서 같은 단계를 반복합니다.
24. 멸균면 도포 구 끝의 나무 끝​​을 사용하여 밀봉하는 두 구멍 뼈 왁스를 적용합니다.
25. 두피를 봉합.
26. 상처 영역에 신경 차단을 적용합니다.
27. 45 분 복구하는 열 블록 따뜻하게 새장에 stereotax에서 마우스와 장소를 제거합니다.
28. 등 통증의 징후를 모니터 : 전체 활동이나 불안을 감소 음식과 물 소비를 증가 또는 발성 감소했다. 부 프레 노르 핀은 (0.05-0.2 ㎎ / ㎏) 필요한 경우 통증 일주일 동안 매일 두 번 관리 할 수​​ 있습니다. 사용 가능한 대안은 다음을 포함한다 : meperidine (20-60 ㎎ / ㎏), pentazocine (10 ㎎ / ㎏), nalbuphine (4-8 ㎎ / ㎏).

3. 에어컨 장소 설정 : AcquisitioN, 멸종, 그리고 차후

1. 단두대 문 60 초 이니 기간 동안 3 챔버 위치 기본 설정 장치 (메드 어소 주식 회사, 세인트 알 반스, VT, USA)의 중앙 챔버에 넣고 쥐가 닫힙니다.
2. 이니, 오픈 단두대 문을 한 후에는 MedPC IV 소프트웨어 (메드 어소 주식 회사)를 사용하여 기록되는 각 챔버에 소요되는 시간 1,200 초 동안 모든 3 챔버 쥐 무료로 탐사를 할 수 있습니다.
3. 사전 테스트 기간 동안 자신의 실적에 따라 조절 챔버에 마우스를 할당합니다. 기본 사전 테스트 기간 동안 최소 선호했다 구획 이후 삼일 동안 편견 디자인 페어 약물 관리를 사용하여.
4. 초 주입 직후 1,200 아침 세션과 할당 된 챔버를 한정, 향후 3 컨디셔닝 일 동안, 코카인 (IP 10 ㎎ / ㎏)과 쥐를 주입. 세션 후 자신의 홈 케이지에 마우스를 반환합니다. 4 시간 후 (식염수 쥐를 주입 0.01 ML / G체중)와 1,200 초 오후 세션에 대한 반대 챔버를 한정.
5. 인수 테스트하기 위해, 단두대 문 중앙 챔버의 장소 마우스는 60 초 이니 기간 동안 폐쇄. 오픈 단두대 문 MedPC IV 소프트웨어 (메드 어소 시에이 츠, 주식 회사)에 의해 기록 된 모든 실에서 보낸 시간 1200 초 동안 무료로 탐사를 허용합니다. 코카인 한 쌍이 챔버에서 보낸 시간의 양의 생리 식염수 쌍 챔버에서 보낸 시간의 양을 뺀 기본 설정을 계산합니다.
6. 장소 환경 설정을 소화하기 위해, 취득을위한 시험 후 24 시간을 시작하기 적어도 2 시간으로 구분하여 동일한 장치에서 매일 무료 탐사의 두 20 분 세션에 쥐를 노출합니다. 모든 챔버에서 보낸 시간을 다시 기록해야하고 초기 CPP의 크기는 각 멸종 세션과 비교해야한다.
7. 쥐가 파에 대한 여부를 환경 설정을 평가하여 약물 유발 환경을 소멸 여부를 확인연속 멸종 일에 걸쳐 ticular 챔버 인수 기본 점수에 비해 크게 낮다.
8. 코카인의 프라이밍 용량 (5 ~ 10 ㎎ / kg, IP)과 쥐를 재개하고 무료 탐사를 허용하는 장치에 다시 노출하고 각 구획에 소요되는 시간을 기록합니다.
9. Euthasol 안락사 솔루션 (150 ㎎ / ㎏) 관리 할 수​​ 있습니다. Transcardially 4 % paraformaldehyde (PFA)로 마우스를 붓는다하고 정확한 microinjection의 배치를 확인하기 위해 조직 학적 검사를 수행합니다.

결과

CPP

미세 주입 생쥐에 CPP를 수행 한 후, 하나는 제어 주입의 코호트 (rAAV-GFP) 마우스는 일반적으로 약물 쌍 챔버 (그림 1A, 1B)에 대한 선호도를 획득했는지 확인해야합니다. 마우스는 코카인 환경 (염분 쌍 챔버에 소요되는 코카인 한 쌍이 실을 뺀 시간에 소요되는 시간)이 기준 기본 점수 (그림 1B, 대 B)에 비해 유의하게 높은 경우 특정 챔버에 대한 선호도...

토론

멸종과 복직 단계를 포함 CPP와 함께 바이러스 성 벡터의 정위 microinjection을 통해 지역적 및 시간적 특정 유전자 제거 중독성이 같은 행동의 세 가지 단계에 유전자의 특정 기여 조사 할 수 있습니다. 기존 크레-LoxP 시스템을 활용하여 달성 조건부 녹아웃 시공 - 일시적으로 제한 유전자 제거를 위해 제공하고 있지만, stereotaxically floxed 생쥐의 개별 뇌 영역에 Cre 호텔 - 재조합을 microinjecting은 언제 어...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Conditioned place preference activity chambers	Med Associates, Inc., St. Albans, VT, USA	MED-CPP-MS
Stereotaxic alignment system for mouse	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	model 900
Hamilton syringes	Hamilton Company, Reno, Nevada, USA	7634-01
rAAV2-Cre-GFP	Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA	7016
rAAV2-GFP	Vector BioLabs, Philadelphia, PA, USA	7004