Primäre orthotopische Glioma Xenografts rekapitulieren infiltratives Wachstum und Isocitrate Dehydrogenase I Mutation

Zusammenfassung

Maligne Gliome bilden eine heterogene Gruppe hochinfiltratischer gliaaler Neoplasmen mit ausgeprägten klinischen und molekularen Merkmalen. Primäre orthotopische Xenografts rekapitulieren die histopathologischen und molekularen Merkmale bösartiger Gliom-Subtypen in präklinischen Tiermodellen.

Zusammenfassung

Maligne Gliome bilden eine heterogene Gruppe hochinfiltratischer gliaaler Neoplasmen mit ausgeprägten klinischen und molekularen Merkmalen. Primäre orthotopische Xenografts rekapitulieren die histopathologischen und molekularen Merkmale bösartiger Gliom-Subtypen in präklinischen Tiermodellen. Um die WHO-Grade III und IV maligne Gliome in Transplantationstests zu modellieren, werden menschliche Tumorzellen in eine orthotopische Stelle, das Gehirn, von immungeschwächten Mäusen xenografiert. Im Gegensatz zu sekundären Xenografts, die kultivierte Tumorzellen nutzen, werden menschliche Gliomzellen von resezierten Proben getrennt und ohne vorherige Passage in der Gewebekultur transplantiert, um primäre Xenografts zu erzeugen. Das Verfahren in diesem Bericht beschreibt die Tumorprobenvorbereitung, die intrakranielle Transplantation in immungeschwächte Mäuse, die Überwachung der Tumorenpfroptmentierung und die Tumorernte für den späteren Übergang in Empfängertiere oder die Analyse. Tumorzellpräparat erfordert 2 Stunden und chirurgische Eingriffe erfordern 20 min/Tier.

Einleitung

Bösartige Gliome sind primäre Gliatumoren des zentralen Nervensystems, die im Gehirn und gelegentlich im Rückenmark auftreten. Gliome werden von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) nach histologischer Ähnlichkeit mit Astrozyten, Oligodendrozyten oder ependymalen Zellen klassifiziert und dann numerisch (I bis IV) für pathologische Merkmale der Malignität eingestuft. Die häufigsten histologischen Subtypen sind Astrozytome, Oligodendrogliome und gemischte Oligoastrozytome. Bösartige Gliome, die die KLASSEN II bis IV der WHO umfassen, zeichnen sich durch invasives Wachstum und Widerspenstigkeit gegenüber aktuellen Therapien aus. Jedes Jahr wird in den Vereinigten Staaten etwa 15.750 Personen mit einem bösartigen Gliom diagnostiziert und schätzungsweise 12.740 Patienten erliegen dieser Krankheit. Diese Statistiken unterstreichen die besonders tödliche Natur bösartiger Gliome und den wichtigen Bedarf an verbesserter therapeutischer Wirksamkeit.

Krebsmodelle sind für die Untersuchung der Tumorbiologie und -therapien unerlässlich. Menschliche Krebszelllinien stellen einen wichtigen ersten Schritt für In-vitro-Manipulationen und in vivo Xenografting-Studien (sekundäre Xenografts)¹dar. Jedoch, Standard-Krebszellkulturen unterziehen phänotypische und genotypische Transformation^2-4, die nicht in sekundären Xenografts wiederhergestellt werden kann⁵. Darüber hinaus können genetische Veränderungen wie Isocitrate-Dehydrogenase (IDH)Mutationen⁶, unterschiedliche Stammzellpopulationen⁷ und Abhängigkeit von wichtigen Signalwegen⁸ in Krebszellkulturen verloren gehen. Genomprofile können in der Krebssphärenkultur in besserem Maße gepflegt werden, spiegeln aber den Genotyp der Primärtumoren immer noch nicht vollständig wider^2,3. Direkte orthotopische Transplantation negiert die Einflüsse der In-vitro-Kultur, bietet eine angemessene Mikroumgebung und bewahrt die Integrität von tumorinitiierenden Zellen^9,10. Daher stellen primäre Xenografts ein leistungsfähiges und relevantes präklinisches Modell für die gründliche Prüfung gezielter Wirkstoffe dar, um bei der rationalen Gestaltung zukünftiger klinischer Studien zu helfen^5,11,12.

Protokoll

1. Vorbereitung der Tumorzellsuspension

Hinweis: Für die Herstellung und Aufrechterhaltung von primären orthotopischen Gliom-Xenografts sind geeignete institutionelle Genehmigungen für die Verwendung von Patientenmaterial und Tieren erforderlich. Am Vanderbilt University Medical Center wird resektiertes Tumormaterial, das über dem für diagnostische Zwecke erforderlichen Material hinausgeht, mit Zustimmung des Patienten für ein Forschungsgewebe-Repository gesammelt. Die Proben werden mit einer randomisierten 5-stelligen REDcap-Datenbanknummer beschriftet, und alle patientenspezifischen Bezeichner werden entfernt. Die REDcap-Datenbank enthält deidentifizierte klinische Daten für jede Probe im Gewebe-Repository, die Geschlecht, Alter (in Jahren), Rasse, Überlebensstatus, Pathologie, Krebsbehandlungen, Jahr der Resektion und Zeit bis zum Fortschreiten umfasst. Um die Sterilität zu erhalten und den Erfolg der primären Xenograft-Methode zu optimieren, sollten alle Reagenzien, dampfautoklavierten chirurgischen Instrumente und die chirurgische Stelle im Voraus montiert oder vorbereitet werden.

Hinweis: Gliom-Proben enthalten oft große Mengen myelin und Schmutz. Je nach Probengröße kann es notwendig sein, mehr als 4 diskontinuierliche Gradientenrohre für eine angemessene Entfernung von Myelin und Schmutz zu verwenden.

Hinweis: Der Prozess wird abgeschlossen, wenn kein oder wenig, deutlich sichtbares undissoziiertes Gewebe übrig ist. Vermeiden Sie das Einbringen von Blasen während des Triturierungsprozesses.

Hinweis: Die Zelllebensfähigkeit nach Dissoziation beträgt in der Regel >90 %. Geringere Viabilitäten können viele Variablen widerspiegeln, einschließlich suboptimaler Gewebehandhabung oder Transportzeit aus dem Operationssaal, Kryokonservierungsmethode oder Papain-Dissoziationstechnik. Niedrigere zelluläre Viabilitäten können jedoch noch ausreichen, solange eine ausreichende Anzahl lebensfähiger Mittel in dem entsprechenden Volumen transplantiert werden kann. Für jede Maus werden 50.000-200.000 lebensfähige Zellen implantiert. Aufgrund der abgeschrägten Spitze der Spritzennadel sollte im Endvolumen eine zusätzliche Zellsuspension von 5 l enthalten sein, um sicherzustellen, dass für jede Injektion ausreichend Material in die Spritze eingezogen werden kann. Um z. B. für 5 Mäuse 2 l/Maus zu injizieren, sollte das Endvolumen 15 l (15 l = (5 x 2 l) + 5 l) betragen.

1. Frisch resektiertes, identifiziertes Patientenmaterial in einen sterilen, verschlossenen Behälter auf Eis legen, um es zum Labor zu transportieren. Verarbeiten Sie die Probe direkt zur Transplantation oder kryokonservieren Sie die Probe in flüssigem Stickstoff (siehe unten) zur Lagerung in flüssigem Stickstoff und später zur Verwendung.
2. Bereiten Sie die Papain-Dissoziationslösungen (Papainlösung, Wasch-/Protease-Inhibitor-Lösung und diskontinuierliche Gradientenlösung) in einer sterilen Haube mit den vom Hersteller gelieferten Kit-Komponenten und Anweisungen vor. Beschriften Sie sterile 15 ml Polystyrol-Konikonröhrchen und verteilen Sie die Lösungen wie folgt:
   • Tube 1: 5 ml Papainlösung
   • Tube 2: 3 ml Wasch-/Protease-Inhibitorlösung
   • Tuben 3-6: je 5 ml diskontinuierliche Gradientenlösung
3. Die Gliomprobe mit 5 ml Papainlösung in Tube 1 geben und mit einer 5 ml Pipette über einen Zeitraum von 10-20 min triturat.
4. Das Material 10 Mal nach oben und unten pfeifen und dann das Material für 2-3 min bei Raumtemperatur inkubieren, bevor der nächste Zyklus der Trituration in Gang gesetzt wird.
5. Positionieren Sie die Spitze der 5 ml Pipette näher an der Unterseite des konischen Rohres mit jedem Triturationszyklus, so dass die Spitze den Boden des Rohres für die letzten 2 Zyklen berührt.
6. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand und Pipette das Pellet nach oben und unten 10x in 3 ml der Wasch-/Protease-Inhibitor-Lösung.
7. Schichtung eines gleichen Volumens der Suspension über jede der 5 ml diskontinuierlichen Gradientenlösungen (Rohre 3-6), wobei eine Pipettentur auf die "Gravity"-Dosiergeschwindigkeit eingestellt ist.
8. Legen Sie die Rohre in eine Zentrifuge, die mit einem Schwenkschaufelrotor ausgestattet ist, wobei die Beschleunigungsgeschwindigkeit auf die niedrigste Einstellung reduziert und die Bremse ausgeschaltet ist. Zentrifuge bei 76 x g für 12 min bei Raumtemperatur. Wenn die Bremse ausgeschaltet ist, wird die Zentrifugation in der Regel nach 20 min abgeschlossen.
9. Den Überstand entfernen, wieder aufhängen und in 5 ml steriler, ausgewogener Salzlösung kombinieren und die Zellen auf Eis legen.
10. Entfernen Sie einen Teil (10-100 l) der Zellsuspension und bestimmen Sie die Dichte lebensfähiger Zellen durch Trypan-Blauausschluss mit einem Hämozytometer.
11. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet mit einer Dichte von 25.000-125.000 lebensfähigen Zellen pro l wieder aus.
12. Übertragen Sie ein ausreichendes Volumen der Zellsuspension auf ein 200-l-Mikrozentrifugenrohr (PCR-Rohr) und legen Sie es auf Eis.

2. Vorbereitung der chirurgischen Stelle und Instrumente

Hinweis: Während des Eingriffs werden sterile chirurgische Handschuhe getragen. Je nach Bedarf der einzelnen Institutionen können OP-Kleider, Mützen und Gesichtsschutz erforderlich sein.

1. Bereiten Sie eine desinfizierte Tischplatte für die Nagetierchirurgie mit getrennten angrenzenden Bereichen für die Tieraufbereitung, Das Betriebsfeld und die Tierregeneration vor.
2. Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente in einem Dampfautoklaven. Anschließend verwenden Sie einen heißen Perlensterilisator, um Instrumente zu blitzsterilisieren, wenn Sie von einem Tier zum anderen wechseln.

3. Induktion, Anästhesie und Analgesie

Hinweis: Operationen, die mehr als 15 min ab dem Zeitpunkt der Anästhesie der Mäuse sind, erfordern eine Kontaktwärmequelle. Um Unterkühlung zu vermeiden, werden die Mäuse während der prä- und postoperativen Perioden mit einer Wärmequelle (zirkulierende Warmwasserdecke) versorgt.

1. Ketamin/Xylazin-Cocktail zur Induktionsanästhesie so zubereiten, dass jede Maus Ketamin 100 mg/kg und Xylazin 10 mg/kg erhält, indem sie 10 l des Cocktails pro Gramm Körpergewicht injiziert.
2. Tabelle 1. Anästhesie-Cocktail.

   	Lagerkonzentration	Volumen zur Vorbereitung
   		eine Maus	fünf Mäuse	zehn Mäuse
   Ketamin	100 mg/ml	25 l	125 l	250 l
   Xylazin	100 mg/ml	2,5 l	12,5 l	25 l
   Isotonische Saline		223 l	1.113 l	2.225 l
   gesamt		250 ul	1.250 l	2.500 l

3. Bereiten Sie Ketoprofen-Lösung für Analgesie vor, indem Sie die Stammlösung (10 mg/ml) 1:20 in sterilem, pyogenfreiem Wasser verdünnen, so dass jede Maus eine Dosis von 5 mg/kg erhält, indem sie 10 l der Lösung pro Gramm Körpergewicht injiziert.
4. Wiegen und aufzeichnen Sie das prächirurgische Gewicht. Die einzelnen Mausgewichte variieren, reichen aber in der Regel von 18-22 g.
5. Mit einer Insulinspritze in den intraperitonealen Raum injizieren Sie 10 l des Ketamin/Xylazin-Cocktails pro Gramm Mauskörpergewicht. Injizieren Sie z. B. 200 l für eine 20 g Maus.
6. Bestimmen Sie, ob die Maus vollständig durch Zehenkneifen des Hinterbeins beeinflicht ist. Es dauert in der Regel 3-5 min für die Maus nicht mehr von der Prise zurückziehen.
7. Mit einer Insulinspritze in die lockere Haut der Flanke injizieren Sie 10 l der Ketoprofenlösung pro Gramm Mauskörpergewicht subkutan. Injizieren Sie z. B. 200 l für eine 20 g Maus.
8. Rasieren Sie Haare mit Clippers über den Schädel, schrubben Sie die freiliegende Kopfhaut mit Povidon-Jod mit einem Baumwoll-Spitzenapplikator und wischen Sie dann ein Alkoholpad ab. Wiederholen Sie diese Schritte, Povidon-Jod-Peeling und Alkohol wischen, zwei weitere Male.
9. Tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf die Augen der Maus auf.
10. Machen Sie einen 1 cm Mittellinienschnitt, der sich von hinter den Ohren bis direkt vor den Augen mit einer sterilen Skalpellklinge erstreckt.
11. Platzieren Sie die Maus unter einem sezierenden Bereich und setzen Sie den Schädel aus, um die Nahtlinien zu identifizieren. Mit kreisförmigen Bewegungen mit einem Bohrer, zentrieren Sie ein Gratloch 2,5 mm seitlich zum Bregma und 1 mm hinter der koronalen Naht.

4. Intrakranielle Transplantation

Hinweis: Injektionsvolumina von mehr als 2,5 l können für Mäuse tödlich sein.

1. Positionieren Sie die Maus auf einem stereotaktischen Rahmen, indem Sie die oberen Schneidezähne über die Schneidezähne hängen und die Nasenklemme so auftragen, dass der Schädel fest in einer neutralen Position gehalten wird.
2. Ziehen Sie 5-10 l der Zellen in einem Mikrozentrifugenrohr mehrmals nach oben und unten in eine 10-l-Hamilton-Spritze, die im Sondenhalter des stereotaktischen Manipulators eingeklemmt ist, um die Suspension zu mischen und Blasen zu beseitigen. Drücken Sie den Kolben, so dass die Spritze mit 2 l (das ausreichende Volumen, um ein Tier zu injizieren) geladen wird.
3. Ziehen Sie den seitlichen Rand des Hautschnitts, um das Gratloch freizulegen, und führen Sie mit dem Mikromanipulator die Nadel in das Gratloch ein, so dass sich der abgeschrägte Teil direkt unter der Schädeloberfläche befindet.
   1. Bewegen Sie die Nadel 3 mm und ziehen Sie dann die Nadel 0,5 mm, um einen Platz für die Injektion zu schaffen.
   2. Bewegen Sie den Kolben langsam über 30 Sek. und lassen Sie dann die Nadel im Gehirn für weitere 2 min bleiben. Ziehen Sie die Nadel nach und nach ab, indem Sie 0,5 mm aufsteigen und auf weitere 30 Sek. warten, bevor Sie die Nadel aus dem Gehirn entfernen.
4. Entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen und schließen Sie die Wunde mit einem Autoclip.
5. Legen Sie die Maus auf ein wärmendes Pad, um die Körpertemperatur zu halten und kontinuierlich das Atmungsmuster und die Farbe von Schleimhäuten und freiliegenden Geweben (Fußsohlen) zu überwachen.
6. Legen Sie die Maus in einen sterilen Mikroisolatorkäfig, sobald sie sich vollständig von der Anästhesie (sternal und ambulant) erholt, und bringen Sie sie in die Tierhaltungseinrichtung zurück.

5. Tierpflege und -beobachtung nach der Implantation

Hinweis: Die zuverlässigste Indikation für Tumorengraftment und infiltratives Wachstum ist allmählich, anhaltende Gewichtsverlust begleitet von der Entwicklung der geknickten Haltung und rauen Haarmantel. In seltenen Fällen, neurologische Defizite festgestellt werden, die Ataxie, Parese, und Krampfanfälle gehören. Orthotopische primäre Xenografts sind hochinvasiv und entwickeln sich über einen langen Zeitraum. Mäuse manifestieren in der Regel Symptome des Tumorwachstums 3-6 Monate nach der Transplantation.

1. Beobachten Sie Mäuse mit orthotopischen Xenografts täglich für Nahrung und Wasseraufnahme, Verhalten, Pflege und Anzeichen einer Infektion an der Einschnittstelle.
2. Ketoprofen (5 mg/kg subkutan, 1-2x pro Tag) verabreichen, wenn Schmerzen oder Leiden postoperativ beobachtet werden.
3. Entfernen Sie Autoclips 8-10 Tage nach der Operation.
4. Wiegen Sie Mäuse wöchentlich.
5. Überwachen Sie Anzeichen und Symptome einer Tumorenpfropte.

6. Tumorernte

Hinweis: Bei dieser Methode enthält die erste koronale Scheibe (#1) den hinteren Aspekt der Olfaktorzwiebeln und den vorderen Aspekt der Frontallappen. Der transplantierte Tumor ist am häufigsten in der rechten Hemisphäre der folgenden 3 koronalen Scheiben (Scheibe #2, #3 und #4) und der Injektionsblick ist routinemäßig in koronalen Scheiben #3 enthalten. Je nach experimentellem Bedarf kann das Material für Tumorpassagen, gefrorene Gewebeabschnitte, formalin fixierte Paraffin-eingebettete Gewebeabschnitte, Durchflusszytometrie von dissoziiertem Gewebe, Zellkultur oder Lysate für dna-, RNA- oder Proteinanalysen verwendet werden. Teile des Tumors können für zukünftige Bedürfnisse mit Zelllebensfähigkeit von 80-95% kryokonserviert werden.

1. Euthanisieren Sie Mäuse durch längere Exposition gegenüber Kohlendioxid, gefolgt von zervikalen Dislokationen.
2. Enthaupten Sie eingeschläferte Mäuse an der Basis des Gehirns (foramen magnum-Ebene) mit einer größeren chirurgischen Schere, und ziehen Sie die Haut aus dem Schnitt nach vorne, um den Schädel vollständig freizulegen.
3. Entfernen Sie das Gehirn.
   1. Legen Sie eine Spitze der feinen chirurgischen Schere in den seitlichen Aspekt des Foramen magnum, um Ebene der linken externen Auditfleisch, um den okzipitalen Knochen entlang der linken Seite des Schädels zu schneiden. Führen Sie den gleichen Schnitt auf der rechten Seite durch.
   2. Schneiden Sie den okzipitalen Knochen entlang einer koronalen Ebene von einem externen auditiven Fleisch auf den anderen und entfernen Sie den Knochen, um das Kleinhirn freizulegen.
   3. Schneiden Sie die Nasenknochenplatten zwischen den Augen.
   4. Schneiden Sie die sagittale Naht, indem Sie hinter der sagittalen Naht von den Nasenknochenplatten bis zum Bregma schneiden. Vervollständigen Sie den Mittellinienschnitt entlang der sagittalen Naht, indem Sie vordergründ vom Lambda zum Bregma schneiden.
   5. Legen Sie vorsichtig die Spitze eines feinen Zangenpaares entlang der sagittalen Öffnung auf jeder Seite ein, um jede durale Haftung des Schädels an das Gehirn zu reißen und dann die beiden Schädelhälften seitlich zu schälen, um das Gehirn und die olfaktorischen Glühbirnen dorsal freizulegen.
   6. Schieben Sie die Zange zwischen dem ventralen Aspekt der olfaktorischen Glühbirnen und dem Schädel, um jegliche Adhäsionen zu befreien.
   7. Neigen Sie den Schädel zurück, damit das Gehirn zurückgezogen werden kann, so dass die Optik und andere Hirnnerven freigelegt werden. Trennen Sie die Hirnnerven, um das Gehirn in eine Schüssel mit sterilem PBS zu entlassen.
4. Übertragen Sie das Gehirn mit einem Wägespachtel auf einen Matrixschneider und erzeugen Sie 2 mm koronale Scheiben mit Rasierklingen.
5. Die koronalen Scheiben in einer Schale mit sterilem PBS für die weitere Sichtprüfung und weitere Gewebeverarbeitung anrichten.

7. Tumor-Kryokonservierung

1. Bereiten Sie eine Lagerlösung von Kryokonservierungsmedium vor.
   1. Fügen Sie 50 ml Proliferationsergänzung, 5 ml 100x Penicillin und Streptomycin-Lösung und 450 l 0,2% Heparin zu 450 ml Basalmedium hinzu.
   2. Lagerhaltung stämmieren Sie die Lagerlösung bei 4 °C, die vor Licht geschützt ist.
2. Bereiten Sie eine funktionierende Lösung des Kryokonservierungsmediums vor.
   1. Kombinieren Sie 47,5 ml Kryokonservierungsmedium und 2,5 ml steriles DMSO in einem 50 ml Polypropylen-Konustube und mischen Sie gut.
   2. Aliquot 1,0 ml Arbeitslösung für jeden Kryovial und lagern bei 4 °C vor Licht geschützt.
3. Legen Sie eine 2 mm koronale Scheibe des xenotransplantierten Gehirns in ein Kryovial, das Kryokonservierungsmedium enthält, auf Eis.
4. Die Durchstechflasche fest verschließen und bei -80 °C in einen Gefrierbehälter geben. Übertragen Sie den Kryovial am nächsten Tag in einen flüssigen Stickstofftank für eine längere Lagerung.

Ergebnisse

Dissoziierte Gliomzellen werden direkt in das Gehirn immungeschwächter Mäuse transplantiert, um primäre orthotopische Xenograft-Linien zu erhalten. Jeder Tumorprobe wird vor der Transplantation eine randomisierte Zahl zugewiesen, als Teil des Deidentifizierungsprozesses, um geschützte Gesundheitsinformationen zu entfernen. Dazu verwenden wir eine 5-stellige REDcap-Datenbanknummer. Abbildung 1 zeigt den Prozess und die Nomenklatur zur Herstellung einer Xenograft-Linie aus einem Glioblastom (GBM 17182)...

Diskussion

Kultivierte Zelllinien, Xenografts und gentechnisch veränderte Mäuse sind die gebräuchlichsten Methoden zur Modellierung von Gliomen, und es gibt deutliche Vorteile und Einschränkungen für jedes Modellsystem^3,13,14. Relevante Vorteile von primären orthotopischen Gliom-Xeografts sind infiltratives Wachstum, das diffuse Gliome typisiert, und die Retention genetischer Veränderungen und wichtige Signalmechanismen, die in kultivierten Gliomzellen äußerst schwierig zu erhalten sein können. Zum Beispiel kö...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline	Life Technologies	14040-133
Papain dissociation system	Worthington Biochemical Corp.	LK003150
Trypan blue solution 0.4%	Life Technologies	15250061
Ketamine HCl	Obtained from institutional pharmacy or local veterinary supply company
Xylazine HCl
Ketoprofen
Ophthalmic ointment
Povidone-iodine	Fisher Scientific	190061617
Cryopreservation medium and proliferation supplement	StemCell Technologies	05751
0.2% Heparin sodium salt in PBS	StemCell Technologies	07980
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D6250-5X10ML
NOD.Cg-Prkdcscid I/2rgtm1Wjl/SzJ mice	The Jackson Laboratory	005557	NSG mice
Anti-human vimentin antibody	Dako	M7020	Use 1:200 to 1:800
Anti-human IDH1 R132H antibody	Dianova	DIA-H09	Use 1:100 to 1:400
Centrifuge with swinging bucket rotor
Pipetter with dispensing speed control
Disposable hemocytometer	Fisher Scientific	22-600-100
Sterile surgical gloves	Fisher Scientific	11-388128
Disposable gown	Fisher Scientific	18-567
Surgical mask	Fisher Scientific	19-120-1256
Tuberculin syringe	BD	305620
Alcohol pads	Fisher Scientific	22-246-073
Portable electronic scale	Fisher Scientific	01-919-33
Zoom stereomicroscope
Surgical clipper	Stoelting	51465
Scalpel handle	Fine Science Tools	10003-12
Scalpel blades, #10
Stereotaxic instrument	Stoelting	51730
High-speed drill	Stoelting	51449
Drill bit, 0.6 mm	Stoelting	514552
Hamilton syringe	Hamilton	80336
Autoclip, 9 mm	BD	427630
Circulating water warming pad	Kent Scientific	TP-700 TP-1215EA
Hot bead dry sterilizer	Kent Scientific	INS300850
Surgical scissors	Fine Science Tools	14101-14
Fine scissors	Fine Science Tools	14094-11
Spring scissors	Fine Science Tools	15018-10
Dumont forceps	Fine Science Tools	11251-30
Semimicro spatulas	Fisher Scientific	14374
Mouse brain slicer matrix	Zivic Instruments	BSMAS002-1
Cryogenic storage vials	Fisher Scientific	12-567-501