1차 성우 성안 성액 제노이식은 침투 성장을 재구성하고 탈수소 효소 I 돌연변이를 이소염시분해합니다.

요약

악성 글리오마스는 뚜렷한 임상 및 분자 특징을 가진 고도로 침입된 신경교 신생물의 이질적인 그룹을 구성합니다. 1 차 성 치열 교정 이종이식은 전임상 동물 모델에서 악성 신경종 아류형의 조직 병리학 및 분자 특징을 재구성합니다.

초록

악성 글리오마스는 뚜렷한 임상 및 분자 특징을 가진 고도로 침입된 신경교 신생물의 이질적인 그룹을 구성합니다. 1 차 성 치열 교정 이종이식은 전임상 동물 모델에서 악성 신경종 아류형의 조직 병리학 및 분자 특징을 재구성합니다. WHO가 이식 분석에서 III 및 IV 악성 글리오마를 채점하는 것을 모델링하기 위해 인간 종양 세포는 면역 손상된 마우스의 직교 부위, 뇌로 이식됩니다. 배양된 종양 세포를 활용하는 이차 이차 이식과는 대조적으로, 인간 신경교종 세포는 절제된 견본에서 해리되고 1 차적인 이종이식을 생성하기 위하여 조직 배양에 있는 이전 통로 없이 이식됩니다. 이 보고서의 절차는 종양 샘플 준비, 면각 손상된 마우스로의 두개 내 이식, 종양 이식 및 종양 수확을 위한 모니터링을 통해 수령인 동물 또는 분석으로 이어지는 통과를 위한 세부 사항을 자세히 설명합니다. 종양 세포 준비는 2 시간 필요하 고 외과 적 절차는 20 분 / 동물이 필요합니다.

서문

악성 글리오마스는 뇌와 때때로 척수에서 발생하는 중추 신경계의 1 차 적인 신경교 종양입니다. Gliomas는 성상 세포, 올리고드로키테 또는 연골 세포에 대한 조직학적 유사성에 따라 세계 보건 기구 (WHO)에 의해 분류된 다음 악성종양의 병리학적 특징을 위해 수치적으로 등급화 (Ito IV). 가장 일반적인 히스토릭 아류형은 성상세포, 올리고드로글리오마 및 혼합 올리고아스트로시톰마스입니다. WHO 등급 II에서 IV에 대한 악성 글리오마는 현재 치료법에 대한 침습적인 성장과 재발을 특징으로합니다. 미국에서 매년, 대략 15,750명의 개별은 악성 신경종으로 진단되고 추정된 12,740명의 환자는 이 질병에 굴복합니다. 이 통계는 악성 글리오마의 특히 치명적인 특성과 향상된 치료 효능에 대한 중요한 필요성을 강조합니다.

암 모델은 종양 생물학 및 치료를 조사하기 위해 필수적입니다. 인간 암 세포주 체외 조작 및 생체 내 xenografting 연구 (이차 xenografts)^1에대 한 중요 한 첫 번째 단계를 나타냅니다. 그러나, 표준 암 세포 배양은 이차 xenografts에서 복원되지 않을 수 있는 현상 및 genotypic 변환^2-4를 겪는다^5. 더욱이, 이소염 탈수소효소(IDH)돌연변이^6,뚜렷한 줄기세포 인구⁷ 및 주요 신호경로에 대한 의존성^등 유전적 변화는 암세포 배양에서 손실될 수 있다. 유전체 프로파일은 암 구배 배양에서 더 나은 범위로 유지될 수 있지만, 여전히 1차 종양의 유전자형을 완전히 미러에 반영하지 못하지만^2,3. 직접 직교 이식은 체외 배양의 영향을 부정하고, 적절한 미세 환경을 제공하며, 종양 개시 세포의 무결성을^보존9,10. 따라서, 1차 이노그래프트는 향후 임상시험^5,11,12의합리적 설계를 돕기 위해 표적 제제를 엄격하게 테스트하기 위한 강력하고 관련성 있는 전임상 모델을 나타낸다.

프로토콜

1. 종양 세포 현탁액 의 준비

참고: 1차 직립성 신경교종 xenografts를 설치하고 유지하기 위해서는 환자 물질 및 동물의 사용에 대한 적절한 제도적 승인이 필요합니다. 밴더빌트 대학 의료 센터에서, 진단 목적을 위해 필요한 것을 초과하는 절제된 종양 물질은 연구 조직 저장소에 대한 환자의 동의하에 수집됩니다. 표본은 무작위 5자리 REDcap 데이터베이스 번호로 레이블이 지정되고 모든 환자 별 식별자가 제거됩니다. REDcap 데이터베이스는 성별, 연령(년), 인종, 생존 상태, 병리학, 암 치료, 절제 연도 및 진행 시간을 포함하는 조직 저장소의 각 표본에 대한 변형된 임상 데이터를 포함합니다. 멸균을 유지하고 기본 이노이식 방법의 성공을 최적화하기 위해 시약, 증기 자동 수술 기구 및 수술 부위를 사전에 조립하거나 준비해야합니다.

참고: 신경교종 표본은 종종 많은 양의 골수인과 파편을 함유하고 있습니다. 시편 크기에 따라 미엘린과 이물질을 적절히 제거하기 위해 4개 이상의 불연속 그라데이션 튜브를 사용해야 할 수도 있습니다.

참고: 프로세스는 남아 있는 아무, 또는 거의, 명확하게 보이는 불순종한 조직이 있을 때 완료됩니다. 트리튜션 과정에서 거품이 도입되지 않도록 하십시오.

참고: 해리 후 세포 생존가능성은 일반적으로 >90%이다. 낮은 비우음은 수술실에서 최적의 조직 취급 또는 수송 시간을 포함하여 많은 변수를 반영할 수 있습니다, 냉동 보존 방법, 또는 papain 해리 기술. 낮은 세포 비부채는 여전히 적절할 수 있지만, 충분한 수의 생존이 적절한 부피로 이식될 수 있는 한. 각 마우스에 대해, 50,000-200,000의 실행 가능한 세포는 2 μl의 부피로 이식됩니다. 주사기 바늘의 경부 팁으로 인해, 각 주사에 대한 적절한 물질을 주사기에 그릴 수 있도록 세포 현탁액의 추가 5 μl을 최종 부피에 포함시켜야합니다. 예를 들어, 5 마우스에 대해 2 μl/마우스를 주입하려면 최종 부피가 15 μl(15 μl = (5 x 2 μl) + 5 μl이어야 한다.

1. 실험실로 운반하기 위해 얼음 위에 갓 절제되고 변형된 환자 물질을 멸균 용기에 놓습니다. 시편을 이식하거나 냉동 보존을 위해 직접 처리하여 액체 질소에 저장하고 나중에 사용할 수 있습니다(아래 참조).
2. 제조자가 제공하는 키트 구성 요소 및 지침과 함께 멸균 후드에 파팡 해리 솔루션(파팡 용액, 세척/프로테아제 억제제 용액 및 불연속 그라데이션 용액)을 준비합니다. 라벨 멸균 15ml 폴리스티렌 원내 형 관과 다음과 같이 솔루션을 배포 :
   • 튜브 1: 파팡 용액 5ml
   • 튜브 2: 워시/프로테아제 억제제 용액 3ml
   • 튜브 3-6: 불연속 그라데이션 용액 5ml
3. 신경교종 표본을 튜브 1에 5 ml의 파팡 용액을 놓고 10-20 분 동안 5 ml 파이펫으로 삼중화하십시오.
4. 재료를 위아래로 10번 피펫한 다음 실온에서 2-3분 동안 재료를 배양한 다음 다음 트리튜레이션 주기를 시작합니다.
5. 팁이 마지막 2 주기 동안 튜브의 바닥을 만지는 것을 있도록 트리튜션의 각 주기와 함께 원식 튜브의 바닥에 가까운 5ml 파이펫의 끝을 배치합니다.
6. 실온에서 5 분 동안 300 x g의 원심 분리기. 세차/프로테아제 억제제 용액 3ml에서 펠릿을 위아래로 10배 위아래로 제거합니다.
7. 조심스럽게 "중력"디스펜스 속도로 설정 파이펫과 5ml 불연속 그라데이션 솔루션 (튜브 3-6)의 각 에 서스펜션의 동일한 볼륨을 층.
8. 스윙 버킷 로터가 장착된 원심분리기에 튜브를 배치하고 가속 속도가 가장 낮은 설정으로 감소하고 브레이크가 꺼져 있습니다. 상온에서 12 분 동안 76 x g의 원심 분리기. 브레이크가 꺼져 있는 경우 원심분리는 일반적으로 20분 후에 완료됩니다.
9. 상체를 제거하고, 각 펠릿을 멸균 균형 잡힌 소금 용액 5ml에 재봉틀어 넣고 얼음 위에 놓습니다.
10. 세포 현탁액의 부분(10-100 μl)을 제거하고 혈류계를 사용하여 트립판 블루 배제에 의해 실행 가능한 세포의 밀도를 결정한다.
11. 300 x g의 원심분리기는 5분 동안. 상체를 제거하고 μl 당 25,000-125,000 개의 실행 가능한 세포의 밀도로 세포 펠릿을 다시 분리하십시오.
12. 200 μl 마이크로센심분리기 튜브(PCR 튜브)로 충분한 양의 셀 서스펜션을 전송하고 얼음 위에 놓습니다.

2. 수술 부위 및 기기 준비

참고: 멸균 수술 장갑은 시술 중에 착용됩니다. 각 기관의 요구 사항에 따라 외과 용 가운, 모자 및 얼굴 가드가 필요할 수 있습니다.

1. 동물 제제, 수술장 및 동물 회복을 위해 분리된 인접 지역을 갖춘 설치류 수술을 위해 감염된 벤치탑을 준비하십시오.
2. 증기 오토클레이브에서 수술 기구를 살균합니다. 그 후, 뜨거운 비드 멸균제를 사용하여 한 동물에서 다음 동물로 전환할 때 악기를 플래시 멸균합니다.

3. 유도, 마취 및 진통

참고: 마우스가 마취될 때부터 15분 이상 을 초과하는 수술은 접촉 열원이 필요합니다. 저체온증을 방지하기 위해, 마우스는 수술 전 및 수술 후 기간 동안 열원 (순환 온수 담요)을 제공합니다.

1. 각 마우스가 체중 1그램당 칵테일 10 μl을 주입하여 케타민 100 mg/kg및 자일라진 10 mg/kg을 수신할 수 있도록 유도 마취를 위해 케타민/자일라진 칵테일을 준비합니다.
2. 표 1. 마취 칵테일.

   	재고 농도	준비하는 볼륨
   		마우스 1개	5마리의 마우스	10마리의 마우스
   케타민	100 mg/ml	25 μl	125 μl	250 μl
   자야진	100 mg/ml	2.5 μl	12.5 μl	25 μl
   이소토닉 식염수		223 μl	1,113 μl	2,225 μl
   합계		250 ul	1,250 μl	2,500 μl

3. 각 마우스가 체중 1그램당 용액의 10 μl을 주입하여 5 mg/kg의 용량을 수신하도록 한 멸균, 표겐없는 물에 1:20의 스톡 용액(10 mg/ml)을 희석하여 진통용 케토프로펜 용액을 준비한다.
4. 계량 및 사전 수술 체중을 기록합니다. 개별 마우스 가중치는 다양하지만 일반적으로 18-22 g범위입니다.
5. 인슐린 주사기로 관면 공간에 마우스 몸무게 1그램당 케타민/자일라진 칵테일 10μl을 주입합니다. 예를 들어 20g 마우스에 200 μl을 주입합니다.
6. 마우스가 뒷다리의 발가락 핀치에 의해 완전히 마취되었는지 여부를 결정합니다. 일반적으로 마우스가 더 이상 핀치에서 철수하지 않는 데 3-5 분이 걸립니다.
7. 인슐린 주사기로 측면의 느슨한 피부에 마우스 체중 무게의 그램 당 케토프로펜 용액의 10 μl을 피하로 주입합니다. 예를 들어 20g 마우스에 200 μl을 주입합니다.
8. 클리퍼로 두개골 위에 머리를 면도하고, 면 팁 어플리케이터를 사용하여 포비달 요오드로 노출된 두피를 문질러서 알코올 패드를 닦아냅니다. 이 단계, 포비도요오드 스크럽과 알코올 닦아, 두 번 더 반복합니다.
9. 마우스의 눈에 안과 연고를 바치다.
10. 멸균 메스 블레이드로 귀 뒤에서 눈 바로 앞까지 1cm 의 중간 절개를 만듭니다.
11. 마우스를 해부 범위 아래에 놓고 두개골을 노출하여 봉합사 선을 식별합니다. 드릴이 있는 원형 동작을 사용하여 버 홀 2.5mm 측면을 브레그마에, 1mm 후방을 관상 봉합사에 집중시합니다.

4. 두개내 이식

참고: 2.5 μl을 초과하는 주사 부피가 마우스에 치명적일 수 있다.

1. 마우스를 절개 막대 위에 연결하고 코 클램프를 적용하여 마우스를 중립 자세로 단단히 고정하여 고정 프레임에 배치합니다.
2. 마이크로센트심분리기 튜브에 있는 세포의 5-10 μl을 스테레오전술 조작기의 프로브 홀더에 고정된 10 μl 해밀턴 주사기로 여러 번 위아래로 그려 서스펜션을 혼합하고 거품을 제거합니다. 주사기가 2 μl (한 동물을 주입하기에 적절한 부피)로로드되도록 플런저를 우울하게하십시오.
3. 피부 절개의 측면 가장자리를 당겨 버 구멍을 노출시키고, 마이크로 조작기를 사용하여 버 구멍에 바늘을 도입하여 경솔한 부분이 두개골 표면 바로 아래에 있도록하십시오.
   1. 바늘을 3mm 전진한 다음 바늘을 0.5 mm로 철수시켜 주입 공간을 만듭니다.
   2. 플런저를 30초 이상 천천히 전진한 다음 바늘이 뇌에 2분 더 남도록 합니다. 0.5 mm를 오르고 뇌에서 바늘을 제거하기 전에 추가 30 초를 기다렸다가 바늘을 점차적으로 철회하십시오.
4. 스테레오전술 프레임에서 마우스를 제거하고 자동 클립으로 상처를 닫습니다.
5. 체온을 유지하기 위해 워밍업 패드에 마우스를 배치하고 점막과 노출 된 조직 (발 바닥)의 호흡 패턴과 색상을 지속적으로 모니터링합니다.
6. 마취(흉골 및 외래)에서 완전히 회복되면 마우스를 멸균 미세소화케이지에 넣고 동물 하우징 시설로 되돌게 됩니다.

5. 이식 후 동물 관리 및 관찰

참고: 종양 이식 및 침투 성장의 가장 신뢰할 수 있는 표시는 점진적, 구부러진 자세와 거친 머리 털의 발달을 동반 하는 지속적인 체중 감소. 드문 경우에, 신경 결핍은 운동 실조를 포함 하는 지적, paresis, 그리고 발작. 직교 1 차 적인 이종이이식은 높게 침략적이고 오랜 기간 동안 발전합니다. 마우스는 이식 후에 3-6 달 종양 성장의 현상을 전형적으로 명시합니다.

1. 절개 부위의 음식과 물 섭취, 행동, 그루밍 및 감염 징후를 위해 매일 직교 성 이종이 접목을 가진 마우스를 관찰하십시오.
2. 케토프로펜관리(5 mg/kg 피하, 하루 1-2배)를 투여하면 수술 후 통증이나 고민이 관찰됩니다.
3. 수술 후 8-10일 후에 자동 클립을 제거합니다.
4. 매주 쥐의 무게.
5. 종양 이식의 징후와 증상을 모니터링합니다.

6. 종양 수확

참고: 이 방법에 의해, 제1 관상 슬라이스 (#1)는 후각 전구의 후방 측면과 전두엽의 전방 측면을 포함합니다. 이식된 종양은 후속 3개의 관상 동맥 조각(슬라이스 #2, #3 및 #4)의 오른쪽 반구에서 가장 풍부하며 주사 시력은 #3 코로나 슬라이스에 일상적으로 함유되어 있습니다. 실험적 필요에 따라, 물질은 종양 통로, 냉동 조직 섹션, 포르말린 고정 파라핀 임베디드 조직 섹션, 해리 된 조직의 흐름 세포 측정, 세포 배양 또는 DNA, RNA 또는 단백질 분석을 위해 사용할 수 있습니다. 종양의 부분은 80-95%의 세포 생존가능성으로 미래의 필요를 위해 냉동 보존될 수 있다.

1. 이산화탄소에 장기간 노출되어 자궁 경부 탈구가 생쥐를 안락사시합니다.
2. 더 큰 외과 가위를 가진 뇌의 기지에서 안락사 된 마우스 (foramen magnum 수준)를 참수하고 두개골을 완전히 노출하기 위해 절개에서 피부를 앞으로 당깁니다.
3. 뇌를 제거합니다.
   1. 두개골의 왼쪽을 따라 목선 뼈를 잘라 왼쪽 외부 청각 고기의 수준에 foramen 매그넘의 측면 측면에 미세 수술 가위 한 쌍의 한 끝을 삽입합니다. 오른쪽에 동일한 컷을 수행합니다.
   2. 관상 동맥 평면을 따라 후두 뼈를 한 외부 청각 고기에서 다른 쪽으로 자르고 뼈를 제거하여 소뇌를 드러냅니다.
   3. 눈 사이에 비강 뼈 판을 잘라.
   4. 비강 뼈 판에서 bregma에 처진 봉합사를 따라 후방절단하여 처진 봉합사를 잘라. 람다에서 브레그마까지 전방으로 절단하여 궁합봉을 따라 중간선 절개를 완료합니다.
   5. 각 면의 처질 개구를 따라 미세한 쌍의 집게 끝을 조심스럽게 삽입하여 두개골의 두폐색을 뇌에 찢어낸 다음 두 개의 두개골반을 옆으로 껍질을 벗기고 뇌와 후각 전구를 뒤갈아 노출시합니다.
   6. 후각 전구의 복부 측면과 두개골 사이의 집게를 밀어 부착을 해제합니다.
   7. 두개골을 다시 기울여 뇌가 후퇴하여 광학 및 기타 두개골 신경이 노출되도록 합니다. 두개골 신경을 세서멸 PBS를 함유 한 접시에 뇌를 방출하십시오.
4. 계량 주걱으로 뇌를 매트릭스 슬라이서로 옮기고 면도날로 2mm 관상 동맥 슬라이스를 생성합니다.
5. 추가 육안 검사 및 추가 조직 처리를 위해 멸균 PBS를 포함하는 접시에 관상 슬라이스를 정렬합니다.

7. 종양 냉동 보존

1. 냉동 보존 매체의 재고 용액을 준비합니다.
   1. 증식 보충제 50ml, 페니실린 100x 페니실린 및 연쇄절제술용액 5ml, 기저형 450ml에 0.2% 헤파린 450 μl을 추가합니다.
   2. 재고 용액을 빛으로부터 보호하여 4°C로 보관하십시오.
2. 냉동 보존 매체의 작업 솔루션을 준비합니다.
   1. 47.5 ml의 냉동 보존 매체와 멸균 DMSO 2.5 ml를 50ml 폴리 프로필렌 원내 튜브에 결합하고 잘 섞어보십시오.
   2. 각 극저온에 대한 작업 용액 의 Aliquot 1.0 ml를 저장하고 빛으로부터 보호 4 ° C에 저장합니다.
3. 이노그래프로 된 뇌의 2mm 관상 동맥 슬라이스를 얼음 위에 냉동 보존 매체가 함유된 극저온에 넣습니다.
4. 유리병을 단단히 캡하고 -80 °C의 냉동 용기에 놓습니다. 냉동극을 액체 질소 탱크로 이송하여 더 오래 보관합니다.

결과

해리된 신경종 세포는 1 차적인 직교 이종 이식 선을 얻기 위하여 면역 손상한 마우스의 두뇌로 직접 이식됩니다. 각 종양 시편은 이식 전에 무작위 번호를 할당하고, 보호된 건강 정보를 제거하기 위한 탈부착 과정의 일부로 할당된다. 이를 위해 5자리 REDcap 데이터베이스 번호를 사용합니다. 도 1은 이소염 탈수소효소 1(IDH1) 돌연변이 아르기닌(132)을 히스티딘(R132H)으로 교모세포종(GBM ...

토론

배양 세포주, 이노이식 및 유전자 조작 마우스는 진모를 모델링하는 가장 일반적인 방법이며, 각 모델 시스템에 대한 뚜렷한 이점과 한계가^{있다 3,13,14.} 1 차성 직립 성 신경종 xenografts의 관련 이득은 확산 교모를 대표하는 잠입 성장 및 유전 변경및 배양된 신경교종 세포에서 유지하기 가 극히 어려울 수 있는 중요한 신호 메커니즘의 보존을 포함합니다. 예를 들어, isocitrate 탈수소 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline	Life Technologies	14040-133
Papain dissociation system	Worthington Biochemical Corp.	LK003150
Trypan blue solution 0.4%	Life Technologies	15250061
Ketamine HCl	Obtained from institutional pharmacy or local veterinary supply company
Xylazine HCl
Ketoprofen
Ophthalmic ointment
Povidone-iodine	Fisher Scientific	190061617
Cryopreservation medium and proliferation supplement	StemCell Technologies	05751
0.2% Heparin sodium salt in PBS	StemCell Technologies	07980
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D6250-5X10ML
NOD.Cg-Prkdcscid I/2rgtm1Wjl/SzJ mice	The Jackson Laboratory	005557	NSG mice
Anti-human vimentin antibody	Dako	M7020	Use 1:200 to 1:800
Anti-human IDH1 R132H antibody	Dianova	DIA-H09	Use 1:100 to 1:400
Centrifuge with swinging bucket rotor
Pipetter with dispensing speed control
Disposable hemocytometer	Fisher Scientific	22-600-100
Sterile surgical gloves	Fisher Scientific	11-388128
Disposable gown	Fisher Scientific	18-567
Surgical mask	Fisher Scientific	19-120-1256
Tuberculin syringe	BD	305620
Alcohol pads	Fisher Scientific	22-246-073
Portable electronic scale	Fisher Scientific	01-919-33
Zoom stereomicroscope
Surgical clipper	Stoelting	51465
Scalpel handle	Fine Science Tools	10003-12
Scalpel blades, #10
Stereotaxic instrument	Stoelting	51730
High-speed drill	Stoelting	51449
Drill bit, 0.6 mm	Stoelting	514552
Hamilton syringe	Hamilton	80336
Autoclip, 9 mm	BD	427630
Circulating water warming pad	Kent Scientific	TP-700 TP-1215EA
Hot bead dry sterilizer	Kent Scientific	INS300850
Surgical scissors	Fine Science Tools	14101-14
Fine scissors	Fine Science Tools	14094-11
Spring scissors	Fine Science Tools	15018-10
Dumont forceps	Fine Science Tools	11251-30
Semimicro spatulas	Fisher Scientific	14374
Mouse brain slicer matrix	Zivic Instruments	BSMAS002-1
Cryogenic storage vials	Fisher Scientific	12-567-501