原発性異形性神経膠腫は浸潤性の増殖とイソクエンテインゲナーゼI突然変異

要約

悪性神経膠腫は、臨床的および分子的特徴が異なる非常に浸透性の高いグリア新生物の不均一なグループを構成する。原発性異形移植片は、前臨床動物モデルにおける悪性神経膠腫サブタイプの組織病理学的および分子的特徴を再現する。

要約

悪性神経膠腫は、臨床的および分子的特徴が異なる非常に浸透性の高いグリア新生物の不均一なグループを構成する。原発性異形移植片は、前臨床動物モデルにおける悪性神経膠腫サブタイプの組織病理学的および分子的特徴を再現する。移植アッセイでIIIおよびIV悪性神経膠腫を採点するWHOをモデル化するために、ヒト腫瘍細胞は免疫不全マウスの同位体部位、脳に異種移植される。培養した腫瘍細胞を利用する二次異種移植片とは対照的に、ヒトグリオーマ細胞は切除標本から解離され、組織培養で事前に通過せずに移植され、原発性異種移植片を生成する。この報告書の手順は、腫瘍サンプル調製、免疫不全マウスへの頭蓋内移植、腫瘍生着および腫瘍収穫のモニタリングを詳述し、その後のレシピエント動物への通過または分析を行う。腫瘍細胞の調製は2時間を必要とし、外科的処置は20分/動物を必要とする。

概要

悪性神経膠腫は、脳および時には脊髄で起こる中枢神経系の原発性グリア腫瘍である。神経膠腫は、組織学的に天文学的に類似しており、組織学的に占星細胞、オリゴデンドロサイトまたはエセンディマル細胞に従って分類され、悪性腫瘍の病的特徴について数値的に等級(I〜IV)に分類される。最も一般的な組織学的サブタイプは、アストロサイトーマ、オリゴデンドロリオ腫および混合オリゴアストロサイトーマである。WHOグレードII〜IVを包含する悪性神経膠腫は、侵襲的な成長および現在の治療法への再特性によって特徴付けられる。米国では毎年、約15,750人が悪性神経膠腫と診断され、推定12,740人の患者がこの病気に屈しています。これらの統計は、悪性神経膠腫の特に致死的な性質と強化された治療効果の重要な必要性を強調する。

がんモデルは、腫瘍生物学や治療法の調査に不可欠です。ヒト癌細胞株は、インビトロ操作および生体内異種移植研究(二次異種移植片⁾¹に対する重要な第一歩を表す。しかしながら、標準的な癌細胞培養は、二次異種移植片⁵では回復し得ない形質および遺伝子型変換^2~4を受ける。さらに、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(IDH)変異⁶などの遺伝子改変は、癌細胞培養において、明確な幹細胞集団⁷および主要なシグナル伝達経路⁸への依存性が失われ得る。ゲノムプロファイルは、癌球培養においてより良い程度まで維持することができるが、原発性腫瘍^2,3の遺伝子型を完全にミラーリングすることができない。直接の異形性移植は、インビトロ培養の影響を否定し、適切な微小環境を提供し、腫瘍開始細胞^9,10の完全性を維持する。したがって、原発異種移植片は、将来の臨床試験^5,11,12の合理的な設計を支援するために、標的剤を厳格に試験するための強力で関連性の高い前臨床モデルを表す。

プロトコル

1. 腫瘍細胞懸濁液の調製

注: 原発性異種異種移植片を確立し維持するためには、患者材料および動物の使用に関する適切な制度的承認が必要である。ヴァンダービルト大学医療センターでは、診断目的で必要なものを超える切除腫瘍材料を、研究組織リポジトリの患者の同意を得て収集します。検体は無作為化された5桁のREDcapデータベース番号でラベル付けされ、すべての患者固有の識別子が除去される。REDcapデータベースには、性別、年齢(年)、人種、生存状態、病理、癌治療、切除年、および進行までの時間を含む組織リポジトリ内の各標本の同定解除された臨床データが含まれています。滅菌を維持し、原発異種移植法の成功を最適化するために、試薬、蒸気オートクレーブ手術器具、および外科部位は事前に組み立てるか、または準備する必要があります。

注: グリオーマ標本には、多くの場合、大量のミエリンおよび破片が含まれています。試料のサイズによっては、ミエリンやデブリを適切に除去するために4つ以上の不連続勾配チューブを使用する必要があります。

注: このプロセスは、明確に見える解剖されていない組織が残っていない場合、またはほとんど残っていない場合に完了する。トリアージプロセス中に気泡の導入を避けてください。

注: 解離後の細胞生存率は、典型的には>90%である。低い生存率は、手術室からの最適でない組織処理または輸送時間、凍結保存法、またはパパイン解離技術を含む多くの変数を反映し得る。しかし、十分な数の生存可能な生存率が適切な体積で移植される限り、より低い細胞の生存率は依然として十分である。各マウスに対して、50,000-200,000個の生存細胞が2μlの容積に埋め込まれます。シリンジ針のベベル先端により、最終的な体積に5μlの細胞懸濁液を追加して、各注射用の注射器に適切な材料を引き込むことができるようにする必要があります。例えば、5匹のマウスに2μl/マウスを注入するには、最終体積は15μl(15μl=(5 x 2 μl)+5μlでなければなりません。

1. 実験室への輸送のために氷の上に滅菌されたキャップ付き容器に、切除され、識別され直された患者材料を置きます。移植のために直接検体を処理するか、液体窒素(下記参照)で標本を凍結保存し、液体窒素に保管し、後で使用します。
2. キットコンポーネントとメーカーから提供される指示と滅菌フードにパパイン解離液(パパイン溶液、洗浄/プロテアーゼ阻害剤溶液および不連続勾配溶液)を準備します。ラベル無菌15 mlポリスチレン対等管と次のようにソリューションを配布します。
   • チューブ1:パパイン溶液5ml
   • チューブ2:3 mlの洗浄/プロテアーゼ阻害剤溶液
   • チューブ 3-6: 5 ml 不連続勾配溶液
3. 5 mlのパパイン溶液でグリオーマ標本をチューブ1に入れ、10〜20分の期間にわたって5mlピペットでトリチュレートします。
4. 材料を10回上下にピペットし、次のトリアーレーションサイクルを開始する前に室温で2〜3分間インキュベートします。
5. 5 ml ピペットの先端を円錐形チューブの底に近づけ、トリチャレーションの各サイクルで、先端が最後の 2 サイクルチューブの底面に触れるようにします。
6. 室温で5分間300×gで遠心分離機。上清を取り除き、3mlの洗浄/プロテアーゼ阻害剤溶液中の10倍のペレットを上下にピペットします。
7. 慎重に「重力」分配速度に設定されたピペットで、5 mlの不連続勾配溶液(チューブ3〜6)の各上に懸濁液の等量を重ね合わせた。
8. スイングバケットローターを装備した遠心分離機にチューブを入れ、加速速度を最低の設定に下げ、ブレーキをオフにします。室温で12分間76×gで遠心分離機。ブレーキをオフにすると、一般的に20分後に遠心分離が完了します。
9. 上清を取り除き、再懸濁し、各ペレットを5mlの無菌バランス塩溶液に組み合わせ、細胞を氷の上に置きます。
10. 細胞懸濁液の部分(10〜100 μl)を取り除き、ヘモサイトメーターによるトリパンブルー排除により生存細胞の密度を決定します。
11. 遠心分離機 300 x g で 5 分間上清を取り除き、μl当たり25,000-125,000個の生存細胞の密度で細胞ペレットを再懸濁します。
12. 細胞懸濁液の十分な容積を200 μlマイクロ遠心分離管(PCRチューブ)に移し、氷の上に置きます。

2. 手術部位と器具の準備

注: 滅菌外科用手袋は処置の間に着用される。各機関の要件に応じて、外科用ガウン、キャップ、フェイスガードが必要な場合があります。

1. 動物の準備、操作フィールドおよび動物の回復のための分離された隣接領域とげっ歯類の外科のための、分解されたベンチトップを準備する。
2. 蒸気オートクレーブで手術器具を殺菌する。続いて、ホットビーズ滅菌器を使用して、ある動物の対象から次の動物に移行する際に器具をフラッシュ滅菌します。

3. 誘導、麻酔、麻酔

注: マウスが麻酔された時点から15分を超える手術は、接触熱源を必要とする。低体温症を予防するために、マウスは術前および術後の期間中に熱源(循環湯毛布)を提供される。

1. 各マウスが体重1グラム当たり10 μlのカクテルを注入してケタミン100mg/kgおよびキシラジン10mg/kgを受け取るような誘導麻酔用ケタミン/キシラジンカクテルを調製します。
2. 表 1.麻酔カクテル。

   	在庫集中	準備するボリューム
   		1つのマウス	5匹のマウス	10匹のネズミ
   ケタミン	100 mg/ml	25 μl	125 μl	250 μl
   キシラジン	100 mg/ml	2.5 μl	12.5 μl	25 μl
   等張生理生理		223 μl	1,113 μl	2,225 μl
   トータル		250 ul	1,250 μl	2,500 μl

3. ストック溶液(10 mg/ml)1:20を無菌で1:20に希釈して鎮痛用ケトプロフェン溶液を調製し、各マウスが体重1グラム当たり10μlの溶液を注入して5mg/kgの用量を受け取るようにします。
4. 計量し、術前の体重を記録します。個々のマウスウェイトは異なりますが、一般的には18〜22gの範囲です。
5. マウス体重1グラム当たりケタミン/キシラジンカクテルをインスリン注射器で腹腔内空間に10μl注入します。例えば、20gマウスに200μlを注入します。
6. 後ろ足のつまみでマウスが完全に麻酔を受けるかどうかを確認します。マウスがピンチから撤退しなくなるのに、一般的に3〜5分かかります。
7. マウス体重1グラム当たりのケトプロフェン溶液をインスリン注射器で脇腹の緩い皮膚に皮下に10μl注入する。例えば、20gマウスに200μlを注入します。
8. 頭蓋骨の上に髪をバリカンで剃り、綿の先端アプリケーターを使って露出した頭皮をポビドネヨウ素でこすり、アルコールパッドを拭きます。これらのステップを繰り返し、ポビドネヨウ素スクラブとアルコール拭き、さらに2回。
9. マウスの目に眼科軟膏を塗布する。
10. 無菌メスの刃で目の前に耳の後ろから伸びる1cmの正中線切開を作ります。
11. マウスを解剖スコープの下に置き、頭蓋骨を露出させて縫合線を特定します。ドリルで円形の動きを使用して、2.5mmの横方向のバリ穴をブレグマに、1 mm後部をコロナ縫合糸に中央に配置します。

4. 頭蓋内移植

注: 2.5 μlを超える注入量は、マウスに対して致死的である可能性があります。

1. 上部の切り込み部を切り身バーの上に引っ掛け、鼻クランプを適用して、頭蓋骨が中立的な位置にしっかりと保持されるようにして、ステレオチックフレームにマウスを置きます。
2. マイクロ遠心分離管内の細胞の5〜10 μlを数回上下に引き込み、立体式マニピュレータのプローブホルダーにクランプした10μlのハミルトンシリンジに取り込み、懸濁液を混合して気泡を除去します。プランジャーを押し下げるので、シリンジに2μl(1匹の動物を注入するのに十分な量)がロードされます。
3. 皮膚切開部の横縁を引っ張ってバリ穴を露出させ、マイクロマニピュレーターで針をバリ穴に入れ、ベバ部分が頭蓋骨表面のすぐ下になるようにします。
   1. 針を3mm進めてから針を0.5mm引き出して、注射用のスペースを作ります。
   2. プランジャーを30秒以上ゆっくりと進め、針を脳内に残してさらに2分間進めます。0.5 mm上昇して徐々に針を引き出し、さらに30秒待ってから、脳から針を取り除きます。
4. 定位フレームからマウスを取り外し、オートクリップで巻を閉じます。
5. 体温を維持し、粘膜と露出した組織(足の裏)の呼吸パターンと色を継続的に監視するために、加温パッドの上にマウスを置きます。
6. 麻酔(胸部および外来)から完全に回復したら、無菌ミクロアイソレーターケージにマウスを入れ、動物の住宅施設に戻します。

5. 移植後の動物のケアと観察

注: 腫瘍の生着および浸潤成長の最も信頼できる徴候は、ハンチ姿勢および粗い毛髪の上皮の発達を伴う漸進的で持続的な体重減少である。まれに、神経学的欠乏は運動失調、麻視、発作を含む指摘される。異形性原発異種移植片は非常に侵襲性が高く、長期間にわたって発達する。マウスは通常、移植後3〜6ヶ月の腫瘍増殖の症状を現す。

1. 切開部位での食物および水の摂取、行動、グルーミング、および感染の兆候について、異交性異種移植片を持つマウスを毎日観察する。
2. 痛みや苦痛が術後に観察された場合、ケトプロフェン(皮下5mg/kg、1日1〜2倍)を投与する。
3. 手術後8~10日後にオートクリップを取り外します。
4. マウスの体重は毎週です。
5. 腫瘍の生着の徴候および症状を監視する。

6. 腫瘍ハーベスティング

注: この方法により、第1のコロナスライス(#1)は、嗅球の後部の側面と前葉の前部の側面を含む。生着した腫瘍は、その後の3つのコロナスライス(スライス#2、#3、#4)の右半球に最も豊富であり、注射部位はコロナスライス#3に日常的に含まれています。実験の必要性に応じて、材料は、腫瘍の通過、凍結組織切片、ホルマリン固定パラフィン埋め込み組織切片、解離組織のフローサイトメトリー、DNA、RNA、またはタンパク質分析のための細胞培養またはリセートに使用され得る。腫瘍の一部は、80〜95%の範囲の細胞生存率を有する将来のニーズのために凍結保存され得る。

1. 二酸化炭素への長期暴露によってマウスを安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行う。
2. 脳の基部(頭蓋マグナムレベル)で大きな手術用ハサミで安楽死させたマウスを切断し、切開から皮膚を前方に引っ張って頭蓋骨を完全に露出させる。
3. 脳を取り除く。
   1. 頭蓋骨の左側に沿って後頭部骨を切断するために、左外部聴覚肉のレベルに孔マグナムの側面に細かい外科用ハサミの1つの先端を挿入します。右側に同じカットを実行します。
   2. 一方の外部聴覚肉からもう一方の外熱部に沿って後頭部骨を切断し、小脳を露出させるために骨を取り除く。
   3. 目の間の鼻骨板を切ります。
   4. 鼻骨板から尾大に矢状縫合糸に沿って後に切断することによって、矢状縫合を切断します。ラムダからブレグマに前から切断することによって、矢状縫合に沿って正中切開を完了します。
   5. 慎重に頭蓋の開口部に沿って鉗子の細かいペアの先端を挿入して、頭蓋骨の硬膜接着を脳に引き裂き、2つの頭蓋骨を横に皮をむいて脳と嗅球を逆に露出させる。
   6. 嗅球の腹側の側面と頭蓋骨の間の鉗子を滑って、あらゆる癒着を解放する。
   7. 頭蓋骨を後ろに傾けて、視神経やその他の脳神経が露出するように脳を後退させます。脳神経を切断し、脳を無菌PBSを含む皿に放出する。
4. 重さのあるヘラで脳をマトリックススライサーに移し、カミソリの刃で2mmコロナスライスを生成します。
5. さらに目視検査と組織処理のために滅菌PBSを含む皿にコロナスライスを配置します。

7. 腫瘍凍結保存

1. 凍結保存培地のストック溶液を準備する。
   1. 増殖サプリメント50ml、ペニシリン100x溶液5ml、レンサマイシン溶液5ml、0.2%ヘパリン450μlを450mlの基底培地に加えます。
   2. 光から保護された4°Cで在庫液を保管してください。
2. 凍結保存媒体の作業溶液を準備します。
   1. 50mlポリプロピレンコニカルチューブに47.5mlの凍結保存培地と2.5mlの無菌DMSOを組み合わせてよく混ぜます。
   2. アリコート1.0 mlの作業溶液を各クライボシャルにし、光から保護された4°Cで保存します。
3. ゼノグラフトされた脳の2mmコロナスライスを氷の上に凍結保存培地を含む凍結に入れる。
4. バイアルをしっかりとキャップし、-80°Cの冷凍容器に入れます。 翌日、凍結液を液体窒素タンクに移し、より長く貯蔵します。

結果

解剖したグリオーマ細胞は、免疫不全マウスの脳に直接移植され、一次異形移植ラインを得る。各腫瘍標本には、保護された健康情報を除去する識別プロセスの一環として、移植前に無作為化数が割り当てられる。この目的のために、5桁のREDcapデータベース番号を使用します。 図1 は、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ1(IDH1)変異アルギニン132をヒスチジン(R132H)と共に神経膠芽腫(G...

ディスカッション

培養細胞株、異種移植片および遺伝子組み換えマウスは、神経膠腫をモデル化するための最も一般的な方法であり、各モデルシステム^3,13,14には明確な利点と限界がある。原発性異形性神経膠腫の関連する利点には、びまん性神経膠腫を代表する浸潤性増殖と、培養グリオーマ細胞で維持することが非常に困難な遺伝的変化および重要なシグナル伝達メカニズムの保持が含まれる。例?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline	Life Technologies	14040-133
Papain dissociation system	Worthington Biochemical Corp.	LK003150
Trypan blue solution 0.4%	Life Technologies	15250061
Ketamine HCl	Obtained from institutional pharmacy or local veterinary supply company
Xylazine HCl
Ketoprofen
Ophthalmic ointment
Povidone-iodine	Fisher Scientific	190061617
Cryopreservation medium and proliferation supplement	StemCell Technologies	05751
0.2% Heparin sodium salt in PBS	StemCell Technologies	07980
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D6250-5X10ML
NOD.Cg-Prkdcscid I/2rgtm1Wjl/SzJ mice	The Jackson Laboratory	005557	NSG mice
Anti-human vimentin antibody	Dako	M7020	Use 1:200 to 1:800
Anti-human IDH1 R132H antibody	Dianova	DIA-H09	Use 1:100 to 1:400
Centrifuge with swinging bucket rotor
Pipetter with dispensing speed control
Disposable hemocytometer	Fisher Scientific	22-600-100
Sterile surgical gloves	Fisher Scientific	11-388128
Disposable gown	Fisher Scientific	18-567
Surgical mask	Fisher Scientific	19-120-1256
Tuberculin syringe	BD	305620
Alcohol pads	Fisher Scientific	22-246-073
Portable electronic scale	Fisher Scientific	01-919-33
Zoom stereomicroscope
Surgical clipper	Stoelting	51465
Scalpel handle	Fine Science Tools	10003-12
Scalpel blades, #10
Stereotaxic instrument	Stoelting	51730
High-speed drill	Stoelting	51449
Drill bit, 0.6 mm	Stoelting	514552
Hamilton syringe	Hamilton	80336
Autoclip, 9 mm	BD	427630
Circulating water warming pad	Kent Scientific	TP-700 TP-1215EA
Hot bead dry sterilizer	Kent Scientific	INS300850
Surgical scissors	Fine Science Tools	14101-14
Fine scissors	Fine Science Tools	14094-11
Spring scissors	Fine Science Tools	15018-10
Dumont forceps	Fine Science Tools	11251-30
Semimicro spatulas	Fisher Scientific	14374
Mouse brain slicer matrix	Zivic Instruments	BSMAS002-1
Cryogenic storage vials	Fisher Scientific	12-567-501