Isolation und Kultur der erwachsenen Maus Kardiomyozyten für Cell Signaling und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Herzhypertrophie

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine zuverlässige Methode zur Isolierung von adulten Herzmuskelzellen der Maus. Dieses Protokoll liefert ein konsistentes Ergebnis für die Kultur von funktionellen adulten Kardiomyozyten aus einer Vielzahl von gentechnisch veränderten Mäusen.

Zusammenfassung

Technologische Fortschritte haben genetisch veränderte Mäuse, einschließlich transgener und Gen-Knockout-Mäusen, ein wesentliches Instrument in vielen Forschungsfeldern. Adulte Kardiomyozyten sind weit verbreitet als ein gutes Modell für die Herzzellphysiologie und Pathophysiologie sowie für pharmazeutische Intervention angenommen. Genetisch veränderte Mäuse, schließen die Notwendigkeit für komplizierte Kardiomyozyten Infektionsprozessen, um den gewünschten Genotyp, was ineffizient aufgrund der terminalen Differenzierung Kardiomyozyten 'sind zu generieren. Isolation und Kultur von hoher Quantität und Qualität funktionellen Kardiomyozyten wird dramatisch profitieren Herz-Kreislaufforschung und ein wichtiges Instrument für die Zellsignalübertragung Forschung und Wirkstoffentwicklung. Hier beschreiben wir eine gut etablierte Methode zur Isolierung von adulten Herzmuskelzellen der Maus, die mit wenig Training umgesetzt werden können. Die Maus Herz herausgeschnitten und zu einem isolierten Herzsystem Kanüle, dann mit einem Calcium-frei und hoch p blutetenotassium Puffer, gefolgt von Typ-II-Kollagenase-Verdauung im Langendorff-Modus retrograde Perfusion. Dieses Protokoll liefert ein konsistentes Ergebnis für die Sammlung von Funktions erwachsenen Maus Kardiomyozyten aus einer Vielzahl von gentechnisch veränderten Mäusen.

Einleitung

Kardiomyozyten sind nicht proliferativen. Es gibt einige atrialen Kardiomyozyten-Zelllinien, wie HL-1 und AT-1 Zellen von Maus Vorhof Tumoren abgeleitet sind; jedoch gibt es keine Erwachsenen ventrikulären Kardiomyozyten Zelllinien für die Forschung zur Verfügung. Primärzellkulturen von adulten Maus Kardiomyozyten eine leistungsstarke Modell für Herzforschung auf zellulärer und molekularer Ebene. Bisher sie weitgehend für biochemische, physiologische und pharmakologische Forschung ¹ verwendet wurden. Darüber hinaus hat die häufige Verwendung von genetisch veränderten Mäusen effektive Methoden der Kardiomyozyten-Isolation notwendig. Kultur pur ermöglicht Bedingungen frei von Wechselwirkungen mit anderen Organen und den systemischen Kreislauf, zB durch endogene neurohormonalen und hormonähnlichen Faktoren ^2,3. Allerdings kann erfolgreiche Isolierung von Kardiomyozyten Herausforderung sein.

Das Protokoll wir hier vorstellen wird auf unseren Erfahrungen mit erwachsenen Ratte cardiomyocyt Basisn und die von O'Connell et al ^4,5 beschriebenen Methode. Vor allem im Jahr 2007 ⁵ beschrieben sie detaillierte Techniken aus Puffer Vorbereitungen zur Zellkultur-und Funktionstest. Seit Muskelzellen der Maus sind sehr anfällig für Kontraktur im Vergleich zu den Ratten-Herzmuskelzellen, werden die Puffer oder Medien für die Durchblutung, Verdauung, Ca ^{2 +} Duldung, Beschichtung und Kultur in der Maus-Protokoll verwendet, mit einer unspezifischen Erregung und Kontraktion Kopplung Inhibitor, 2 ergänzt, 3-Butandion Monoxim (BDM), um ihre spontane Kontraktion hemmen, daher die Rentabilität und den Ertrag von stabförmigen Muskelzellen deutlich verbessern. In der hier vorgestellten Protokoll werden die Muskelzellen in einem hohen Kalium-Puffer aus dem isolierten Herzen durch modifizierte Langendorff-Perfusion mit Kollagenase Typ II getrennt. Collagenase II effektiv bricht die interzelluläre Matrix und gibt Zellen. Die Perfusion Lösung hält auch den Zellstoffwechsel auf niedrigem Niveau ^6. In additiauf das isolierte Herz System von Harvard Apparatus verwendeten wir hier für eine präzise Temperatur-und Konstantdruckregelung ⁷ gut entwickelt. Dieser Ansatz bietet hoch reproduzierbare und gleichmäßige Zubereitungen Populationen Zelltyp, der in Übernachtkultur zum Messen Signalproteine ​​oder 2-3 Tage alten Kultur für Herzhypertrophie Assays verwendet werden können.

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Protokoll

Alle Forschung an Mäusen wurde nach Verfahren und Richtlinien der National Institutes of Health durchgeführt, und die Protokolle wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee der University of Toledo, Hochschule für Medizin und Lebenswissenschaften genehmigt.

1. Perfusionssystem Vorbereitung

1. Der Tag vor der Isolierung, füllen die gesamte Durchblutung System (einschließlich Stauseen) mit einer Lösung von alkalischen schnell rückstandsfreie Reinigungsmittel. Lassen Sie die Lösung in das System für einige Stunden oder über Nacht einweichen.
2. Am nächsten Morgen, stellen Sie den Thermocycler Temperatur auf 37 ° C und die Lösung, um sich aufzuwärmen. Entfernen Sie die Reinigungslösung und spülen Sie das System gründlich mit sterilisiertem destilliertem Wasser. Vergessen Sie nicht, alle Seitenäste.
3. Füllen Sie das System mit Perfusionspuffer über eine Konstante Schlauchpumpe und zeichnen mögliche Luftblasen aus der Aorta Kammer (Luftfalle) mit einer seitlich angebrachten Spritze zum Schutzdas Herz von der koronaren Okklusion. Die Strömungsrate der peristaltischen Pumpe regelmäßig überprüft werden.

2. Herstellung von Puffern, Kultur, Medien und Gerichte

1. Perfusion Buffer: Stellen Sie 500 ml 1x Perfusionspuffer vor der Verwendung. Diese Calcium-freien Puffer enthält 113 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,6 mM KH ₂ PO _4, 0,6 mM Na ₂ HPO _4, 1,2 mM MgSO _4, 10 mM Na-HEPES, 12 mM NaHCO _3, 10 mM KHCO _3, 0,032 mM Phenolrot, 30 mM Taurin, 10 mM BDM und 5,5 mM Glucose. Den pH-Wert auf 7,0 mit 2 M HCl und durch ein 0,2 um Filter, Lagerung bei 4 ° C
   Anmerkung: a) Die Perfusionslösung sollte am gleichen Tag hergestellt werden, wenn es verwendet wird. In einigen Fällen ist es akzeptabel, die Lösung weniger als 3 Tage bei 4 ° C aufbewahren b) Dieser Puffer hat einen hohen Kalium-Konzentration von bis zu 15,3 mM, die die Herzmuskelzellen Ruhe halten können, zu reduzieren ATP consumption und erhöhen die Ca ^{2 +-Fähigkeit} tolerant.
2. Digestion Buffer (300 U / ml, 25-50 ml / Herz): Vorbereitung unmittelbar vor der Perfusion. Wiegen 15.000 U Gesamtaktivität von Typ-II-Kollagenase, in 50 ml Perfusionspuffer in Kultur Haube lösen. In 25 ul 100 mM CaCl ₂ (Stammlösung, Filter sterilisiert), um die endgültige Calciumkonzentration machen 50 uM. Wärmen Sie den Puffer auf 37 ° C, wenn Sie bereit für die Isolierung. Im Gegensatz zu Trypsin, Collagenase am besten in Gegenwart von 50-100 &mgr; M Ca ^{2 +.}
3. Anschlagpuffer (50 ml / Herz): Betreiben Sie in Kultur Kapuze. Mischungs 45 ml Perfusionspuffer mit 5 ml sterilem FBS.
   1. Ca ^{2 +-Lösung} I (12,5 &mgr; M Ca ^{2 +):} In 2,5 &mgr; l 100 mM CaCl ₂ und 20 ml Stoppuffer und mischen.
   2. Ca ^{2 +-Lösung} II (100 &mgr; M Ca ^{2 +):} In 10 ul 100 mM CaCl ₂ und 10 ml Stoppuffer und mischen.
   3. Ca ^{2 +-Lösung} III (400 &mgr; M Ca ^{2 +}): In 40 ul 100 mM CaCl ₂ und 10 ml Stoppuffer und mischen.
   4. Ca ^{2 +-Lösung} IV (900 &mgr; M Ca ^{2 +):} In 90 ul 100 mM CaCl ₂ und 10 ml Stoppuffer und mischen.
4. Plating-Medium (50 ml / Herz): Transfer 43 ml MEM mit 2 mM L-Glutamin und 1,26 mM CaCl ₂ in ein steriles 50-ml konischen Röhrchen in Kultur Kapuze und 5 ml FBS, 1 ml BDM-Stammlösung ( 500 mm, filtersterilisiert), und 0,5 ml Penicillin / Streptomycin (10.000 U / ml). Mischen und ins Gleichgewicht für 2-3 Stunden vor myocyte Isolation in 2% CO _2, 37 ° C Inkubator mit den Kappen lose. Kurz vor myocyte Beschichtung, 0,5 ml 200 mM ATP (pH-Wert 7,2, Stammlösung, Filter-sterilisiert) in das Medium.
5. Kulturmedium (50 ml / Herz): Transfer 48 ml MEM mit 2 mM L-Glutamin und 1,26 mM CaCl ₂ in ein steriles 50-ml konischen Röhrchen in Kultur Kapuze und 1 ml BDM-Stammlösung (500 mM, filter sterilisiert) und 0,5 ml Penicillin / Streptomycin (10.000 U / ml). Mischen und ins Gleichgewicht in 2% CO _2, 37 ° C Inkubator vor myocyte Isolation. Vor der Verwendung werden 0,5 ml einer 100 mg / ml BSA (sterilfiltriert) in das Medium.
   Hinweis: Die Verwendung von 2% CO _2-Inkubator ermöglicht die Aufrechterhaltung der Kultur bei mittlerer pH 6,9 bis 7,0, die die myoctyes behalten ihre stäbchenförmige Morphologie bis zu 24 Stunden hilft.
6. Laminin (1-2 &mgr; g / cm ^{2)-beschichteten} Schalen oder Platten: Transfer 200 ul 1 mg / ml Maus-Laminin natürliche zu 20 ml sterilisiertem PBS (w / o Calcium und Magnesium) und mischen. 1 ml auf 35-mm-Platten, 2,5 ml auf 60-mm-Schalen, oder 5 ml bis 100-mm-Schalen, schütteln gleichmäßig bedecken die Oberflächen und in 2% CO _2, 37 ° C Inkubator bis Myozyten-Beschichtung.
   Hinweis: Wenn der Schalen oder Platten nicht am Tag beschichtet verwendet werden, können sie mit Parafilm versiegelt und bei 4 ° C über Nacht (langsame Coating) gespeichert. Die Abdichtung ist requIRED Verdunstung und Verunreinigung zu verhindern. Beschichteten Platten können bei 4 ° C für bis zu 1 Woche aufbewahrt.

3. Maus Herz Aus-und Kanülierung

1. Weichen Sie die Schere und Pinzette in 70% Ethanol für 30 Minuten und lassen Sie sie trocknen.
2. Wiegen Sie die Maus, um 0,1 Gramm. Nehmen Sie seine Körpergewicht, Stamm, Geschlecht und Geburtsdatum.
3. Injizieren 200 ul Heparin (100 IU / Maus) ip 10 min vor der Anästhesie, um die Koagulation von Blut in die Koronararterien zu verhindern. Anesthetize die Maus mit 200 mg / kg Körpergewicht Ketamin und 10 mg / kg Körpergewicht Xylazin durch ip-Injektion und warten 5-10 Minuten, bis die Maus nicht mehr reagiert bis zum Schwanz / Zeh drückt.
4. Sichern Sie die Maus in die Rückenlage, indem Sie vorsichtig die Festsetzung der Vorderpfoten und Hinterpfoten an einen pinnable Arbeitsfläche (dh Styropor) auf einem Tierchirurgie Fach oder Tischbank in der Nähe der Perfusion System.
5. Wischen Sie die Brust und Bauch mit 70% Ethanol. Machen Sie eine Mittellinie Haut incision von Mitte Bauch auf die Membran mit einer chirurgischen Schere.
6. Schneiden Sie die Membran mit einem anderen chirurgischen Schere und halten Sie das Brustbein mit gekrümmten gezackten Pinzette. Schneiden bilateral und Retroflect Brustkorb, das Herz freizulegen.
7. Heben Sie das Herz etwas mit feinen geschwungenen gezackt und atraumatischen Pinzette und sezieren das Herz aus dem Brustraum so nah wie möglich an der dorsalen Thoraxwand.
8. Übertragen Sie das Herz zu einer 100-mm-Schale mit kaltem Perfusionspuffer. Sorgfältig schneiden Sie das Bindegewebe wie Lunge, Thymus und Bronchien.
9. Identifizieren Sie die Aorta und ihre Schädel Zweige, die in der Regel von Thymus und Fettpolster versteckt sind. Schneiden Sie die Aorta unterhalb der ersten Filiale ^13, fassen Sie die Aortenwand, heben Sie die Herzen und leicht rutschen sie auf die Perfusion mit Flüssigkeit gefüllte Aorten-Kanüle (1,0 mm OD Kanüle aus rostfreiem Stahl mit stumpfen / flachen Spitze und Kerben 1 und 2 mm über die Spitze, oder ein 22 G wiederverwendbare Fütterung Nadel) unter Verwendung von zwei ultrafeinen Spitze-forceps.
   Hinweis: a) Die Perfusion Flüssigkeit sollte bei Herz-Kanülen tropft von Gasblasen aus der Eingabe der Herzkranzgefäße zu verhindern; b) Halten Sie die Spitze der Kanüle direkt über der Aortenklappe.
10. Klemmen Sie die Aorta an der Kanüle und Ligation der Aorta an der Kanüle mit 6-0 chirurgische Seide. Die ganze Kanülierung sollte weniger als 120 Sekunden dauern.

4. Herzdurchblutung und Verdauung

1. Perfundieren das Herz mit Calcium-freier Perfusion Puffer bei Flussrate von 4 ml / min ca. 4-5 min, bis die Abwässer deutlich geworden, dann, um die Verdauung Puffer, der 50 uM CaCl ₂ ein-und durchströmen für 3,5 bis 20 min je nach Mausstamm, Perfusionsdruck und Collagenase-Aktivität. Erhöhen Sie ggf. die Aorta Druck auf 70-80 mmHg, wenn verdauen. Wenn nötig, kann die Enzym Perfusat für die Verdauung zurückgeführt werden. Typischerweise 300 U / ml Enzympuffer wird ein Herz in 10-12 min bei einer Flussrate von 4 ml / min zu verdauen;Wenn die Anwendung Nachlast Druck bei 70 mmHg, wird 300 U / ml nur 3,5-5,5 min bei einer Flussrate von 4 ml / min statt.
2. Stoppen Sie die Verdauung, wenn das Herz wird leicht blass und schlaff. Es sollte schwammig sein, wenn sanft eingeklemmt.

5. Cells Dissoziation und Calcium Wiedereinführung

1. Ziehen Sie die Aorta aus der Kanüle mit 70% Ethanol-getränkten Zange und legte das Herz in eine sterile 60-mm-Schale, die 2,5 ml Aufschlusspuffer. Bewegen Sie in die Kultur mit sterilen Haube liefert, bleiben bewusst sterile Techniken für diese und Follow-up-Maßnahmen.
2. Entfernen Aorta, Atrien und der großen Gefäße mit feinen chirurgischen Schere. Necken Sie vorsichtig die Herzkammer in 10-12 kleine Stücke mit zwei feinen Spitze Pinzette.
3. Vorsichtig pipettieren Herzstücke und Zellen auf und ab ~ 10x mit einem 10-ml Transferpipette und Transfer zu einem 15-ml-Polypropylen-konischen Rohr dann. Mit 7,5 ml Calciumlösung I mit 12,5 uM CaCl ₂ und Transfer Spülen Sie den Tellerdiese in das Rohr, wodurch ein Endvolumen von 10 ml gelöst.
4. Pipette vorsichtig die Zellsuspension nach oben und unten mit einer feinen Spitze-Transferpipette, die große Stücke von Herzgewebe zu zerstreuen.
5. Anschließend zentrifugieren für 3 Minuten bei 20 × g zur Abtrennung kleiner nicht-Myozyten-Zellen, wie Endothelzellen und Fibroblasten.
6. Absaugen der Überstand und resuspendieren myocyte Pellet in 10 ml Calcium-Lösung, die ich mit einem Zuschlag von 100 ul 200 mM ATP (pH-Wert 7,2, Stammlösung, Filter-sterilisiert). Lassen Sie das Rohr in der Haube für 3-5 min.
7. Über duplizieren 10 ul Aliquoten zu einer Hämazytometer zu stabförmige und runde Muskelzellen zählen. Berechnen der Gesamtzahl von Myozyten und berechnet den Prozentsatz von stabförmigen Myozyten.
8. Zentrifugieren Sie die Muskelzellen für 3 min bei 20 x g. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren des Pellets in 10 ml Calcium-Lösung II, enthaltend 100 &mgr; M CaCl _2. Dispersions die Myozyten mit der feinen Spitze-Transferpipette durch Pipettierenoben und unten.
9. Wiederholen des obigen Schritts (5.8) unter Verwendung von Calciumlösung III (400 &mgr; M CaCl ₂₎ und IV (900 &mgr; M CaCl ₂₎ auf.
10. Für Maus myocyte Primärkultur, suspendieren die endgültige myocyte Pellet in 5 ml Plattierungsmedium. Zählen der Gesamtzahl von Myozyten und berechnet den Prozentsatz von stabförmigen Myozyten.

6. Zellkultur

1. Die Konzentration an stabförmigen Myozyten 25.000 stabförmigen Myozyten / ml in einem 50-ml-Röhrchen. Vorsichtig pipettieren Muskelzellen mit einem 10-ml-Pipette, um sie gut zu suspendieren. Vermeiden Zellzentrifugation in der Pipette und Rohr gleich Zelldichte für jede Schüssel oder Platte zu gewährleisten.
2. Nach Absaugen der Laminin-Beschichtungslösung, die Platte Muskelzellen in diese Gerichte oder Platten. Sanft gleiten die Teller oder Platten nach vorne und hinten und von Seite zu Seite in einem kreuzartigen Muster drei bis vier Mal an der Oberfläche des Kulturhaube.
3. Die Schalen oder Platten in einer 2% CO_2-Inkubator bei 37 ° C. Inkubation für 1-3 h auf Myozyten Befestigung mit einer Geschwindigkeit von etwa 80% zu ermöglichen.
4. Nach der Befestigung vorsichtig absaugen das Medium, das ungebunden Muskelzellen und Zelltrümmer. Kulturmedium hinzufügen, vorsichtig an den Seiten der Gerichte oder Platten. Führen Sie diese Mediumwechsel nacheinander. Die Gerichte oder Platten sofort in den Inkubator zurück.
5. Nach O / N-Kultur können die Muskelzellen auf das gleiche Medium ohne BDM vor dem Studium der kurzfristigen Zell-Signal verändert werden. Halten Sie das BDM in Langzeitkultur für hypertrophe oder Apoptose-Assays.
   Hinweis: BDM (2,3-Butandion Monoxim) kann die Myosin-ATPase hemmen und Kontraktion. Die Hemmung der Myosin-basierte Kontraktion leicht reversibel. Es wird berichtet, dass BDM kann einige mögliche Nebenwirkungen, wie etwa die eines nicht-spezifischen Phosphatase, erhöhte Calcium-Freisetzung aus SR und Veränderung der freien Calcium-Konzentration und zellulären elektrischen prope habenrties, so vor der Behandlung, der BDM sollte entfernt werden. Ferner wird in einigen Fällen eine bestimmte Myosin II Inhibitor blebbistatin könnte eine Alternative zu Kardiomyozyten Medikament Kontraktion ^8,9 hemmen. Doch in unserem Fall ist BDM besser als blebbistatin aus Gründen der Qualität und Quantität der Kardiomyozyten.

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Ergebnisse

1. Erfolgreiche Isolation Quantifizierung

Zwei Kriterien werden verwendet, um den Erfolg der Isolation zu quantifizieren: erstens, die Gesamtzahl der Kardiomyozyten isoliert, und zweitens, das Verhältnis von stabförmigen Calcium-tolerant zu runden nicht tolerant Muskelzellen. Generell dieses Protokoll dauert etwa 75-90 min von Herzen Entfernung zu myocyte Beschichtung und Erträge rund 1 Mio. stabförmigen Kardiomyozyten (70-90% der Gesamt geerntet Muskelzellen) von einer erwachsenen Maus Her...

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Diskussion

Für die beste Vorbereitung, sind die wichtigsten Schritte: 1) unverzüglich Anschließen der Maus Herz mit der Kanüle nach der Exzision; 2) geeignete Herzdurchblutung. Beachten Sie auch, dass die Wasserqualität, die Durchblutung Temperatur, pH-Puffer, Sterilisation, chemische Reinheit und sauber, nicht kontaminierte Rohre und Kammern sind ebenfalls wichtige Faktoren. 18,2 mOhm Molekularbiologie-Grade-H ₂ O ist sehr für Puffer Vorbereitung empfohlen. Der pH-Wert von 200 mM ATP Stammlösung sollte auf 7,2, ein Schritt, der leic...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolated heart system for small rodent	Harvard Apparatus	IHSR-mouse 73-4019
Aortic Cannula, OD 1.0 mm	Harvard Apparatus	73-2816
Dumont #4 Forceps	Fine science tools	11294-00
Straight sharp serrated scissors	Fine science tools	14070-12
Serrated Graefe forceps	Fine science tools	11050-10
Curved, serrated Graefe forceps	Fine science tools	11052-10
Straight Mini Serrefines clamps	Fine science tools	18054-28
MEM	Gibco	11575-032
Collagenase II	Worthington	4176
Mucosal universal detergent	Sigma	Z637181	Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent.