Выделение и Культура взрослой мыши кардиомиоцитов для клеточной сигнализации и<em&gt; В пробирке</em&gt; Гипертрофия сердца

Резюме

Мы описываем надежный способ для изоляции кардиомиоцитов взрослых мышей. Этот протокол дает согласованный результат для культуры функциональных взрослых кардиомиоцитов из множества генетически модифицированных мышей.

Аннотация

Технологические достижения сделали генетически модифицированных мышей, в том числе трансгенных и ген мышей с, незаменимого инструмента во многих областях исследований. Взрослые кардиомиоциты получили широкое признание как хорошей моделью для сердечной клеточной физиологии и патофизиологии, а также для фармацевтической вмешательства. Генетически модифицированные мыши исключает необходимость сложных процессов инфекции кардиомиоцитов генерировать искомого генотипа, которые являются неэффективными из-за терминальной дифференцировки кардиомиоцитов. Выделение и культивирование высокого количества и качества функциональных кардиомиоцитов резко пользу сердечно-сосудистой исследования и обеспечить важный инструмент для исследования трансдукции клеточной сигнализации и разработки лекарственных препаратов. Здесь мы описываем устоявшихся метод для изоляции взрослых кардиомиоцитов мышей, которые могут быть реализованы с небольшим опытом. Сердце мыши вырезали и канюлировали в изолированной системе сердца, то перфузии с бескальциевой и высокой рotassium буфер с последующим Тип II коллагеназой в Лангендорфа режиме ретроградной перфузии. Этот протокол дает последовательную результат для сбора функциональных кардиомиоцитов взрослых мышей из различных генетически модифицированных мышей.

Введение

Кардиомиоциты не пролиферативная. Есть некоторые предсердные кардиомиоциты клеточные линии, как HL-1 и АТ-1 клеток, полученных из мышиных предсердий опухолей; Однако, нет никаких взрослых желудочковая клеточные линии кардиомиоцитов, доступные для исследования. Первичные культуры клеток из взрослых кардиомиоцитов мыши обеспечивают мощную модель для исследования сердца на клеточном и молекулярном уровнях. На сегодняшний день они широко используются для биохимического, физиологического и фармакологического исследования ^1. Кроме того, частое использование генетически модифицированных мышей потребовало эффективные методы изоляции кардиомиоцитов. Чистая культура позволяет условиях, свободных от взаимодействия с другими органами и большом круге кровообращения, например, через эндогенных нейрогормональных и гормоноподобных факторов ^2,3. Тем не менее, успешная изоляция кардиомиоцитов может быть сложной задачей.

Протокол введем здесь, основана на нашем опыте с взрослой крысы cardiomyocytES и способ, описанный О'Коннелом соавт ^4,5. Особенно в 2007 году ^5, они описаны подробные приемы из буферных препаратов в культуре клеток и функциональном анализе. С миоциты мыши сильно подвержены контрактуры по сравнению с кардиомиоцитов крыс, буферы или среды, используемые для перфузии, пищеварения, Ca ^{2 +} веротерпимости, обшивки и культуры в протоколе мыши дополняются неспецифического возбуждения-сжатия соединительной ингибитора, 2, 3-бутандион monoxime (БДМ) ингибировать их самопроизвольное сжатие, следовательно, жизнеспособность и выход из стержнеобразных миоцитов значительно улучшить. В протоколе, введенной здесь, миоциты разделяются в высоком буфера калия из изолированного сердца по модифицированной Лангендорфа перфузии Тип II коллагеназы. Коллагеназы II эффективно разрушает межклеточный матрикс и релизы клетки. Решение перфузии также держит клеточный метаболизм на низком уровне ^6. В дополнительна, изолированная система сердца из Гарвардского аппарата мы использовали здесь хорошо для точного температуры и постоянного контроля давления ^7. Такой подход обеспечивает высокую воспроизводимость препараты и однородные популяции одного типа клеток, которые могут быть использованы в ночной культуры для измерения сигнальных белков или 2-3 дня культуру для сердечных гипертрофических анализов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все исследования на мышах было сделано в соответствии с процедурами и руководящими принципами Национальных Институтов Здоровья, и протоколы были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета Университета Толедо, медицинский колледж и наук о жизни на.

1. Перфузии подготовки системы

1. За день до изоляции, заполнить всю систему перфузии (в том числе резервуаров) с раствором быстро щелочной без остатка моющего средства. Разрешить решение, чтобы впитать в систему в течение нескольких часов или на ночь.
2. На следующее утро, регулировать температуру амплификаторе до 37 ° С и дайте раствору нагреться. Снимите моющий раствор и промыть систему стерилизованной дистиллированной воды. Не забывайте все боковые ветви.
3. Заполните систему перфузии буфера через постоянном перистальтического насоса и сделать все пузырьки воздуха из аорты камеры (пузырь ловушки) с боковым расположением шприца для защитысердце от коронарной окклюзии. Скорость потока перистальтического насоса должны быть проверены в установленном порядке.

2. Подготовка буферов, культура Медиа, и блюда

1. Перфузии буфера: Сделайте 500 мл 1x перфузии буфера до его использования. Это кальций без буфер содержит 113 мм NaCl, 4,7 мм KCl, 0,6 мМ KH ₂ PO _4, 0,6 мМ Na ₂ HPO _4, 1,2 мМ MgSO _4, 10 мМ Na-HEPES, 12 мМ NaHCO _3, 10 мМ _КНСО3, 0,032 мМ фенол красный, 30 мм таурин, 10 мМ БДМ, и 5,5 мМ глюкозы. Доводят рН до 7,0 с помощью 2 М HCl и фильтруют через 0,2 мкм фильтр, хранения при 4 ° С.
   Примечание: а) раствор перфузии должны быть готовы в тот же день, когда она используется. В некоторых случаях, это приемлемо для хранения решение для менее 3 дней при 4 ° С. б) Этот буфер имеет высокую концентрацию калия до 15,3 мм, что может держать кардиомиоцитов покоя, снизить ATP Consumption и увеличить Ca ^{2 +-толерантного} способность.
2. Переваривание буфера (300 Ед / мл, 25-50 мл / сердце): готовить непосредственно перед перфузии. Взвесьте 15000 U от общего деятельности Тип II коллагеназы, растворить в 50 мл перфузии буфера в капот культуры. Добавить 25 мкл 100 мМ CaCl ₂ (исходный раствор, фильтр стерилизуют), чтобы сделать окончательный концентрации кальция 50 мкм. Теплый буфер до 37 ° С, когда готов к изоляции. В отличие от трипсина, коллагеназы работает лучше в присутствии 50-100 мкМ Са ^{2 +.}
3. Упор (50 мл / сердце): Управляйте в капот культуры. Смешайте 45 мл перфузии буфера с 5 мл стерильной FBS.
   1. Са ^{2 +} решение, которое я (12,5 мкМ Са ^{2 +):} Добавить 2,5 мкл 100 мМ CaCl ₂ до 20 мл стоп-буфера и перемешать.
   2. Са ^{2 +} решение II (100 мкМ Са ^{2 +):} Добавить 10 мкл 100 мМ CaCl ₂ до 10 мл стоп-буфера и перемешать.
   3. Са ^{2 +} решение III (400 мкМ Са ^{2 +}): Добавить 40 мкл 100 мМ CaCl ₂ до 10 мл стоп-буфера и перемешать.
   4. Са ^{2 +} решение IV (900 мкМ Са ^{2 +):} Добавить 90 мкл 100 мМ CaCl ₂ до 10 мл стоп-буфера и перемешать.
4. Покрытие среду (50 мл / сердце): Передача 43 мл MEM, содержащего 2 мМ L-глутамина и 1,26 мМ CaCl ₂ в стерильный 50 мл коническую трубку в капот культуры и добавляют 5 мл FBS, 1 мл BDM маточного раствора ( 500 мм, фильтр стерилизуют) и 0,5 мл пенициллина / стрептомицина (10000 ЕД / мл). Смешайте и равновесия в течение 2-3 часов перед выделением миоцитов в 2% СО _2, 37 ° С инкубатор с крышками сыпучих. Прямо перед миоцитов покрытия, добавить 0,5 мл 200 мМ АТФ (рН 7.2, основной раствор, фильтр стерилизовать) в среду.
5. Культурная среда (50 мл / сердце): Передача 48 мл MEM, содержащей 2 мМ L-глутамина и 1,26 мМ CaCl ₂ в стерильный 50 мл коническую трубку в капот культуры и добавить 1 мл BDM исходного раствора (500 мм, FilteR стерилизуют) и 0,5 мл пенициллина / стрептомицина (10000 ЕД / мл). Смешайте и уравновешивают в 2% СО _2, 37 ° C инкубатор перед выделением миоцитов. Перед использованием добавьте 0,5 мл 100 мг / мл BSA (стерилизованный фильтрованием) в среду.
   Примечание: Использование 2% СО ₂ инкубатора облегчает поддержание культуральной среды рН при 6,9-7,0, который помогает myoctyes сохранить свою стержнеобразную морфологию до 24 часов.
6. ЛАМИНИНА (1-2 мкг / см ²⁾ с покрытием блюда или тарелки: Передача 200 мкл 1 мг / мл ламинином природного мыши к 20 мл стерилизованной PBS (без кальция и магния) и перемешать. Добавить 1 мл в 35-мм чашках, 2,5 мл до 60-мм чашках, или 5 мл на 100-мм чашках, встряхнуть, чтобы равномерно покрыть поверхности, а место в 2% CO _2, 37 ° С инкубатор до миоцитов обшивки.
   Примечание: Если блюда или пластины не используются в день с покрытием, они могут быть запечатаны с Parafilm и хранили при 4 ° С в течение ночи (Медленное покрытие). Уплотнение является RequIRED для предотвращения испарения и загрязнения. Покрытые пластины могут быть выдерживали при 4 ° С в течение до 1 недели.

3. Мышь Сердце Снятие и Катетеризация

1. Замочите ножницы и щипцы в 70% этаноле в течение 30 мин и дайте им высохнуть.
2. Взвесьте мышь с точностью до 0,1 грамма. Запишите свой вес тела, процедить, пол и дату рождения.
3. Введите 200 мкл гепарина (100 МЕ / мышь) IP 10 мин до анестезии для предотвращения коагуляции крови в коронарных артерий. Обезболить мышь с 200 мг / кг массы тела кетамина и 10 мг / кг массы тела ксилазина по инъекцией и ждать в течение 5-10 мин, пока мышь не перестает реагировать на хвост / ног пинчах.
4. Закрепите мышь в положении лежа на спине, слегка фиксируя передние лапы и hindpaws к pinnable рабочей поверхности (т.е. пенополистирола) на лоток животное хирургии или настольный скамейке у системы перфузии.
5. Протрите грудь и живот с 70% этанола. Сделайте срединный I кожиncision с середины живота к диафрагме с хирургической ножницами.
6. Разрежьте диафрагму с другой хирургической ножницами и удерживайте грудины с изогнутыми зубчатыми щипцами. Вырезать на двусторонней основе и retroflect грудной клетки, чтобы разоблачить сердце.
7. Поднимите сердце слегка использованием тонких изогнутых зубчатые и атравматичные щипцы и анализировать сердце из грудной полости, как можно ближе к спинной грудной стенки.
8. Перенести сердце к 100-мм блюдо с холодной буфер перфузии. Осторожно обрежьте соединительной ткани, такие как легкие, тимуса и бронхов.
9. Определить аорты и ее ветвей черепных, которые обычно скрыты от тимуса и жировой ткани. Вырезать аорту ниже первой ветви ^13, возьмитесь за стенки аорты, поднимите сердце, и слегка скольжения его к перфузии заполненной жидкостью аорты канюли (1,0 мм OD нержавеющей стали канюли с тупым / плоским наконечником и насечками 1 и 2 мм выше верхушка, или 22 G многоразовые кормления иглы) с помощью двух ультра тонкой наконечник пorceps.
   Примечание: а) перфузионной жидкости следует капать в течение сердечной пункции, чтобы предотвратить пузырьки газа от входа коронарные артерии; б) Держите кончик канюли чуть выше аортального клапана.
10. Зажмите аорту к канюли и перевязывать аорту к канюли с 6-0 хирургического шелка. Весь катетеризация должно занять менее 120 сек.

4. Сердце перфузии и Пищеварение

1. Заливать сердце бескальциевой перфузии буфера при скорости потока 4 мл / мин около 4-5 мин, пока стоки не стало ясно, затем переключиться на пищеварение буфере, содержащем 50 мкМ CaCl ₂ и заливать на 3.5-20 мин в зависимости от линии мышей, перфузионное давление и активность коллагеназы. Если возможно, увеличить давление аорты до 70-80 мм рт когда переваривания. При необходимости, фермент Перфузат можно возвращать для пищеварения. Как правило, 300 Ед / мл фермента буфер переварить сердца в 10-12 мин при скорости потока 4 мл / мин;Если применяя давление постнагрузки на 70 мм рт.ст., 300 ед / мл займет всего 3,5-5,5 мин при скорости потока 4 мл / мин.
2. Остановить пищеварение, когда сердце становится немного бледной и вялой. Она должна быть губчатой ​​при легком зажат.

5. Клетки диссоциация и кальция реинтродукции

1. Потяните аорту из канюли с 70% этанола пропитанной пинцетом и положил сердце в стерильный 60-мм блюдо, содержащей 2,5 мл пищеварения буфера. Переместить в капот культуры с использованием стерильных поставки, оставаясь внимательными стерильных методов для этого и последующих шагов.
2. Удалить аорту, атриумы и крупные сосуды с тонкой хирургическими ножницами. Аккуратно дразнить желудочек в 10-12 мелкие кусочки с двумя тонкой наконечником щипцов.
3. Аккуратно пипетки кусочки сердца и клетки вверх и вниз ~ 10x с 10-мл пипетки, а затем передать в 15-мл полипропилен коническую трубку. Промойте блюдо с 7,5 мл раствора кальция я содержащего 12,5 мкМ CaCl ₂ и передачиэто в трубу, в результате чего в конечном объеме 10 мл.
4. Аккуратно пипетки клеточной суспензии вверх и вниз с помощью пипетки передачи тонкой наконечник для разгона больших кусков ткани сердца.
5. Затем центрифугируют в течение 3 мин при 20 мкг выделить малые не-миоцитов клеток, таких как эндотелиальные клетки и фибробласты.
6. Аспирируйте от супернатанта и ресуспендируют миоцитов гранул в 10 мл раствора кальция Я с доплатой 100 мкл 200 мМ АТФ (рН 7,2, исходный раствор, фильтр стерилизовать). Оставьте трубку в капюшоне в течение 3-5 мин.
7. Передача дублировать 10 мкл аликвоты в гемацитометре рассчитывать палочковидные и круглые миоцитов. Рассчитайте общее количество миоцитов и вычислить процент палочковидных миоцитов.
8. Центрифуга миоцитов в течение 3 мин при 20 х г. Удалить супернатант и ресуспендируют гранул в 10 мл кальция II раствора, содержащего 100 мкМ CaCl _2. Дисперсные миоциты с помощью пипетки для переноса тонкой наконечником с помощью пипеткивверх и вниз.
9. Повторите предыдущий шаг (5.8) с помощью раствора кальция III (400 мкМ CaCl ₂₎ и IV (900 мкМ CaCl _2), соответственно.
10. Для мышь миоцитов первичной культуре, ресуспендируют окончательный миоцитов осадок в 5 мл посева среду. Подсчитать общее количество миоцитов и вычислить процент палочковидных миоцитов.

6. Культура клеток

1. Регулировка концентрации стержнеобразных миоцитов 25000 стержнеобразных миоцитов / мл в 50-мл пробирку. Аккуратно пипетки миоциты с использованием 10-мл пипетки приостановить их хорошо. Избегайте клеток осадка в пипетку и трубки для обеспечения равного плотности клеток для каждого блюда или тарелку.
2. После аспирации от решения ламинином покрытия, плиты миоциты в тех блюд или пластин. Аккуратно вставьте посуду или пластин вперед и назад и из стороны в сторону в кросс-как шаблон три-четыре раза на поверхности капот культуры.
3. Поместите посуду или пластин в 2% CO₂ инкубатор при 37 ° С Инкубировать в течение 1-3 часов, чтобы позволить прикрепление миоцитов в размере около 80%.
4. После прикрепления, мягко аспирации от среды, содержащей одиноких миоцитов и остатков клеток. Осторожно добавьте культуральной среды к сторонам блюд или пластин. Выполните эту среднего изменения по одному. Сразу вернуться посуду или пластин в инкубатор.
5. После O / N культуры, миоциты могут быть изменены в той же среде без БДМ до исследований сигнализации короткий срок клеток. Держите BDM в долгосрочной культуры для гипертрофических или апоптоза анализов.
   Примечание: BDM (2,3-бутандион monoxime) может ингибировать миозина-АТФазы и предотвратить сокращение. Его ингибирование сокращения миозина основе легко обратимы. Он сообщил, что БДМ может иметь некоторые потенциальные побочные эффекты, такие как выступает в качестве неспецифической фосфатазы, увеличение высвобождение кальция из СР, и изменение концентрации свободных кальция и клеточной электрической Недвижимrties, поэтому до начала лечения, BDM должны быть удалены. Кроме того, в некоторых случаях, определенный миозина II ингибитор Blebbistatin может быть альтернативой лекарственное средство для ингибирования кардиомиоцитов сжатия ^8,9. Тем не менее, в наших случаях, BDM лучше, чем Blebbistatin ради качества и количества кардиомиоцитов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

1. Успешная изоляция Количественное

Два критерия используются для количественной успех изоляции: во-первых, общее число кардиомиоцитов изолированных, а во-вторых, отношение палочковидных кальция толерантных округлить-устойчивых миоцитов. Вообще этот протокол занимает ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Для лучшего подготовки, наиболее важными шагами являются: 1) незамедлительно подключения сердце мыши, чтобы канюли после удаления; 2) необходимости сердце перфузии. Кроме того, обратите внимание, что качество воды, температура перфузии, рН буфера, стерилизации, химическую чистоту и чистым, не загря?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolated heart system for small rodent	Harvard Apparatus	IHSR-mouse 73-4019
Aortic Cannula, OD 1.0 mm	Harvard Apparatus	73-2816
Dumont #4 Forceps	Fine science tools	11294-00
Straight sharp serrated scissors	Fine science tools	14070-12
Serrated Graefe forceps	Fine science tools	11050-10
Curved, serrated Graefe forceps	Fine science tools	11052-10
Straight Mini Serrefines clamps	Fine science tools	18054-28
MEM	Gibco	11575-032
Collagenase II	Worthington	4176
Mucosal universal detergent	Sigma	Z637181	Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent.