İzolasyon ve Kültür Yetişkin Fare Hücre Sinyal için kardiyomiyositlerin ve<em&gt; In vitro</em&gt; Kalp hipertrofisi

Özet

Biz yetişkin fare kardiyomiyositlerin izolasyonu için güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, genetik olarak tadil edilmiş farelerin çeşitli fonksiyonel yetişkin kardiyomiyositlerde kültürü için tutarlı bir sonuç elde edilir.

Özet

Teknolojik gelişmeler transjenik ve gen knockout farelerde, bir çok araştırma alanlarında gerekli bir araç da dahil olmak üzere, genetik olarak modifiye edilmiş fareler yaptık. Yetişkin kardiyomiyositler yaygın iyi bir kalp hücresel fizyoloji ve patofizyolojisi için model yanı sıra ilaç müdahale olarak kabul edilir. Genetik olarak modifiye edilmiş farenin nedeniyle kardiyomiyositlerde 'terminal farklılaşma verimsiz olan arzu edilen genotip oluşturmak için karmaşık kardiyomiyosit enfeksiyon işlemleri için duyulan ihtiyacı ortadan kaldıracak. Yüksek miktar ve kalite fonksiyonel kardiyomiyositlerin izolasyonu ve kültürü önemli ölçüde kardiyovasküler araştırma yararlanacak ve hücre sinyal iletimi araştırma ve ilaç geliştirme için önemli bir araç sağlayacaktır. Burada, küçük eğitim ile uygulanabilecek yetişkin fare kardiyomiyositlerde izolasyonu için iyi kurulmuş bir yöntemi tarif eder. Fare kalp kesilmiş ve izole edilmiş kalp sistemine kanül, daha sonra, kalsiyum içermeyen ve yüksek p ile perfüzeotassium Langendorff retrograd perfüzyon modu tip II kollajenaz sindirimi ve ardından tampon. Bu protokol, genetiği değiştirilmiş farelerde çeşitli fonksiyonel bir yetişkin fare kardiyomiyositlerin toplanması için tutarlı bir sonuç verir.

Giriş

Kardiyomiyositler proliferatif değildir. HL-1 ve atriyal fare tümörlerinden türetilmiş AT-1 hücreleri gibi bazı atrial kardiyomiyosit hücre çizgileri, vardır; Ancak, araştırma için hiçbir yetişkin ventriküler kardiyomyosit hücre hatları vardır. Yetişkin fare kardiyomiyositlerin birincil hücre kültürleri hücresel ve moleküler seviyede kalp araştırma için güçlü bir model sağlar. Bugüne kadar, bunlar, biyokimyasal, fizyolojik ve farmakolojik araştırmalar ¹ için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, genetiği değiştirilmiş farelerin sık kullanılması kardiyomyosit tecrit etkili yöntemler gerektirmiştir. Saf kültür diğer organlar ile etkileşimden şartlar ve bu endojen nörohormonal ve hormon benzeri faktörler ^2,3 aracılığıyla gibi sistemik dolaşım sağlar. Ancak, kardiyomiyositlerin başarılı izolasyonu zor olabilir.

Biz burada tanıtmak protokol erişkin sıçan cardiomyocyt ile tecrübelere dayanmaktadıres ve O'Connell ve ark ^4,5 tarafından tanımlanan metot. Özellikle 2007 ^5'de, bu hücre kültürü ve işlevsel tahlil tampon preparatlar ayrıntılı teknikleri tarif. Fare myocytes Sıçan kardiyomiyositlerinde göre kontraktürü son derece duyarlı olduğu için, fare protokolünde perfüzyon, sindirim, Ca ^{2 +} tolerans, kaplama ve kültür için kullanılan tamponlar veya ortamı, spesifik olmayan uyanlma-kasılma bağlama inhibitörü, 2 ile takviye edilmiştir kendiliğinden kasılmasını inhibe 3-Butandion monoxime (BDM), dolayısıyla canlılığı ve çubuk şekilli miyositlerin verimi önemli ölçüde artırır. Burada tanıtılan Protokolde, miyositler tip II kolajenaz ile modifiye edilmiş Langendorff perfüzyonu ile izole edilmiş kalp yüksek potasyum tamponu içinde ayrılır. Kolajenaz II etkili hücrelerarası matrisi ve bültenleri hücreleri ayırır. Perfüzyon çözelti, aynı zamanda düşük bir seviyede ⁶ hücresel metabolizmayı tutar. Additi yılında, biz burada kullanılan Harvard Apparatus izole kalp sistemi, hassas sıcaklık ve sabit basınç kontrolü ⁷ için iyi tasarlanmış. Bu yaklaşım, yüksek oranda tekrarlanabilir hazırlıklar ve hipertrofik kalp tahlilleri için sinyal proteinleri ya da 2-3 günlük kültür ölçülmesi için bir gece boyunca kültür içinde kullanılabilecek tek bir hücre tipi, homojen popülasyonları içerir.

Protokol

Fareler üzerinde tüm araştırma işlemleri ve Sağlık Ulusal Enstitüleri kurallarına göre yapıldığını ve protokolleri Toledo Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu, Tıp ve Yaşam Bilimleri Koleji tarafından kabul edildi.

1.. Perfüzyon Sistem Hazırlama

1. Izolasyon bir gün önce, hızla alkali tortu içermeyen bir deterjan çözeltisi (rezervuar da dahil olmak üzere), tüm perfüzyon doldurun. Çözelti bir kaç saat veya gece boyunca sisteme emmek için izin verin.
2. Ertesi sabah, 37 ° C'ye kadar PCR sıcaklığını ayarlamak ve çözelti ısınmaya bırakın. Deterjan çözeltisini çıkarın ve steril damıtılmış su ile iyice yıkayın sistemi. Tüm yan dalları unutma.
3. Sabit bir peristaltik pompa vasıtasıyla perfüzyon tamponu ile sistemini doldurun ve herhangi bir hava korumak için bir yan monte şırınga ile aorta odasının (kabarcık tuzak) dışarı kabarcıklar çekmekkoroner tıkanmasından kaynaklanan kalp. Peristaltik pompanın akış hızı, rutin olarak kontrol edilmelidir.

2.. Tamponlar hazırlanması, Kültür Medya ve Yemekleri

1. Perfüzyon Tamponu: 1x perfüzyon tamponu 500 ml kullanım öncesinde emin olun. Bu, kalsiyum içermeyen tampon maddesi 113 mM NaCI, 4.7 mM KCI, 0.6 mM KH ₂ PO _4, 0.6 mM Na ₂ HPO _4, 1.2 mM MgSO _4, 10 mM Na-HEPES, 12 mM NaHCO _3, 10 mM KHCO ₃ içerir, 0.032 Kırmızı mM fenol, 30 mM taurin, 10 mM BDM ve 5.5 mM glukoz. 2 M HCI ile 7.0 'a pH ayarlamak ve 4 ° C' de bir 0.2 mikron filtre içinden geçirilerek filtre mağaza
   Not: kullanıldığında a) perfüzyon çözeltisi aynı gün hazırlanmalıdır. Bazı durumlarda, bu, 4 ° C de en az 3 gün için bir çözüm depolamak için kabul edilebilir b) Bu tampon ATP c'yi azaltmak, hareketsiz kardiyomiyositlerin tutabilirsiniz 15.3 mM yüksek potasyum konsantrasyonu kadar, varonsumption ve Ca ^{2 +-toleranslı} yeteneğini artırır.
2. Sindirim Tampon (300 U / ml, 25-50 ml / kalp): hemen öncesinde perfüzyon hazırlamak. Kültürü kaputu 50 ml perfüzyon tamponunda çözülür, tip II kollajenazının toplam aktivitenin 15.000 U tartılır. Nihai kalsiyum konsantrasyonu 50 uM olmak için 100 mM _{CaCl, 2} 25 ul (steril stok solüsyonu, filtre) ilave edin. Izolasyonu için hazır 37 ° C tampon ısıtın. Tripsin farklı olarak, kolajenaz 50-100 uM Ca ^{2 +} varlığında, en iyi şekilde çalışır.
3. Dur Buffer (50 ml / kalp): kültürü kaputu İşlet. , 5 ml steril FBS ile perfüzyon tampon maddesi 45 ml karıştırın.
   1. Ca ^{2 +} çözeltisi (12.5 uM Ca ^{2 +):} durdurma tamponu, 20 ml 100 mM _CaCI2 2.5 ul ilave et ve karıştır.
   2. Ca ^{2 +} II çözeltisi (100 uM Ca ^{2 +):} durdurma tamponu, 10 ml 100 mM _CaCI2 içinde 10 ul ilave et ve karıştır.
   3. Ca ^{2 +} III çözeltisi (400 uM Ca ^{2 +}) Durdurma tamponu, 10 ml 100 mM _CaCI2 içinde 40 ul ilave et ve karıştır.
   4. Ca ^{2 +} IV çözeltisi (900 uM Ca ^{2 +):} durdurma tamponu, 10 ml 100 mM _CaCI2 içinde 90 ul ilave et ve karıştır.
4. Aktarım kültürü kaputu steril 50 ml konik tüp içine 2 mM L-glutamin ve 1.26 mM _CaCl2 ihtiva eden ve FBS 5 ml MEM içinde 43 mi, BDM stok çözeltisinden 1 ml ((50 ml / kalp) orta Kaplama 500 mM, süzülerek sterilize edilmiş) ve 0.5 ml penisilin / streptomisin (10,000 U / ml). Karıştır ve% 2 _CO2, gevşek kapakları ile 37 ° C inkübatör önce miyosit izolasyon 2-3 saat boyunca dengeye getirin. Sağ miyosit kaplama önce, ortama 200 mM ATP, 0.5 ml (pH 7.2, stok çözeltisi, steril filtre) ekleyin.
5. Kültür ortamı (50 ml / kalp): Aktarım 48 kültür başlığı içinde steril bir 50 ml'lik konik bir tüp içine 2 mM L-glutamin ve 1.26 mM _CaCl2 ihtiva eden MEM ile ml BDM stok çözeltisi (500 mM, 1 ml, filte eklemekr) sterilize edilmesi ve 0.5 ml penisilin / streptomisin (10,000 U / ml). Mix ve% 2 CO _2, 37 ° C inkübatör önce miyositlerdeki izolasyon dengeye. Kullanımdan önce, ortama 100 mg / ml BSA, 0.5 ml (steril filtre) ekleyin.
   Not:% 2 _CO2 inkübatör kullanarak myoctyes 24 saate kadar kendi çubuk-benzeri morfolojiye korunmasına yardımcı olur 6,9-7,0 de kültür ortamı pH, muhafaza kolaylaştırır.
6. Laminin (1-2 ug / cm ²⁾ ile kaplanmış tabaklar veya plakalar: steril PBS (w / o kalsiyum ve magnezyum), 20 ml ve karıştırın Aktarma / ml doğal fare laminin 1 mg 200 ul. , 100 mm yemekleri 35 mm yemekleri, 60-mm yemekleri, 2.5 ml veya 5 ml için 1 ml ekleyin eşit yüzeylerini sallamak, yer ve CO _2% 2, 37 ° C inkübatör miyositlerdeki kaplama kadar.
   Not: yemekler veya kaplanmış plakalar gününde kullanılmaz, bunlar Parafilm ile kapatılır ve 4 ° C'de gece boyunca (Slow Coating) saklanabilir. Sızdırmazlık requ olduğunuired buharlaşmayı ve kirlenmeyi önlemek için. Kaplanmış plakalar, 1 hafta boyunca 4 ° C'de muhafaza edilebilir.

3.. Fare Kalp Kaldırma ve Kanülasyon

1. 30 dakika boyunca% 70 etanol içinde makas ve forseps ıslatın ve kurumaya bırakın.
2. 0.1 gram fare tartılır. Onun vücut ağırlığı, gerginlik, seks ve doğum tarihini kaydedin.
3. 200 ul heparin enjekte edilir (100 IU / fare) 10 dakika önce ip koroner arterlerde kan pıhtılaşmasını önlemek için anesteziye. 200 ketamin / kg vücut ağırlığı mg ve ip enjeksiyonu ile ksilazin 10 mg / kg vücut ağırlığı ile fare anestezi ve fare kuyruk / ayak tutam yanıt vermiyor 5-10 dakika kadar bekleyin.
4. Hafifçe perfüzyon sistemine yakın bir hayvan cerrahisi tepsi veya masa bankta bir pinnable çalışma yüzeyi (yani strafor) için forepaws ve pençelerin sabitleme tarafından yatar pozisyonda fare sabitleyin.
5. % 70 etanol ile göğüs ve karın silin. Ortahat cilt i yapmakBir cerrahi makas ile diyaframa orta karın ncision.
6. Başka bir cerrahi makas ile diyaframı kesin ve kavisli dişli forseps ile sternum tutun. Bilateral kesilmiş ve kalp maruz göğüs kafesi retroflect.
7. Ince kavisli tırtıklı ve atravmatik forseps kullanarak hafifçe kalp kaldırın ve dorsal göğüs duvarı mümkün olduğunca yakın göğüs boşluğundan dışarı kalbini incelemek.
8. Soğuk perfüzyon tampon içeren bir 100 mm tabak için kalp aktarın. Dikkatle akciğerler, timus, ve bronşlar gibi bağ dokuları uzak trim.
9. Genellikle timus ve yağ yastığı tarafından gizli aorta ve kranial dalları, tanımlayın. Kalp kaldırın, aort duvarı kavramak, ilk şubesini ¹³ aşağıda aort kesin ve hafifçe perfüzyon sıvı dolu aort kanül (düz / künt ucu ve çentikler yukarıdaki 1 ve 2 mm ile 1,0 mm OD paslanmaz çelik kanül için slip iki ultra ince uçlu f kullanarak veya 22 G yeniden beslenme iğne); ucuorceps.
   Not: a) perfüzyon sıvısı koroner arterleri girmesini gaz kabarcıklarını önlemek için kalp kanülasyonu sırasında damlayan olmalıdır; b) sadece aort üzerinde kanül ucu tutun.
10. Kanül aort Kelepçe ve 6-0 cerrahi ipek ile kanül aort Arter. Bütün kanulasyon 120 saniyeden az almalıdır.

4. Kalp Perfüzyon ve Sindirim

1. 4 ml akış hızında, kalsiyum içermeyen perfüzyon tamponu ile kalp serpmek / dakika, yaklaşık 4-5 dakika da çıkış berrak hale gelene kadar, daha sonra 50 mM CaCl ₂ ihtiva eden sindirim tamponu değiştirmek ve fare türüne bağlı olarak, 3,5-20 dakika boyunca perfüze, perfüzyon basıncı ve kolajenaz aktivitesi. Varsa sindirildiği zaman, 70-80 mmHg aorta basıncını artırır. Gerekli olduğunda, enzim 'in perfüze sindirim için yeniden sirküle edilebilir. Tipik haliyle, 300 U / ml enzim tamponu ml / dak, 4 'lık bir akış hızında, 10-12 dakika içinde, bir kalp sindirir;70 mmHg basınç uygulayarak yükleme sonrası durumu varsa, 300 U / ml 4 ml / dk 'lık bir akış hızında gerekli olan sadece 3,5-5,5 dakika sürer.
2. Kalp biraz soluk ve sarkık olduğunda sindirim durdurmak. Nazikçe sıkışmak zaman süngerimsi olmalıdır.

5. Hücreler çözüşüm ve kalsiyum yeniden yerleştirilmesi

1. % 70 etanol-batırılmış forseps ile kanül aort çekin ve 2.5 ml sindirim tampon içeren steril bir 60 mm çanak içine kalbini koydu. Bu steril tekniklerin dikkatli kalan ve takip adımlar, steril malzemeleri kullanarak kültürü kaputu içine taşıyın.
2. Ince cerrahi makas ile aort, atrial ve büyük damarları çıkarın. Yavaşça iki ucu ince forseps ile 10-12 küçük parçalar halinde ventrikül kızdırmak.
3. Yavaşça 10 ml transfer pipet ile kalp parçaları ve hücreleri yukarı ve aşağı ~ 10x pipet ve daha sonra bir 15-ml polipropilen konik tüp transferi. Ben 12.5 mM CaCl ₂ ve transferini içeren 7.5 ml kalsiyum çözeltisi ile çanak durulayınBu tüp içine, 10 ml 'lik bir son hacim elde edilir.
4. Yavaşça yukarı ve kalp dokusunun büyük parçalarını dağıtmak için ince uçlu transfer pipet kullanarak aşağı hücre süspansiyonu pipetle.
5. Daha sonra, endotelyal hücreler ve fibroblastlar gibi küçük olmayan miyosit hücreleri ayırmak için 20 x g'de 3 dakika boyunca santrifüj.
6. Süpernatan aspire ve 10 mi kalsiyum çözeltisi içindeki miyosit pelet tekrar süspansiyon 200 mM ATP, 100 ul (pH 7.2, stok çözeltisi, steril filtre) bir takviyesi ile I. 3-5 dakika için kaputu tüp bırakın.
7. Transferi çubuk şekilli ve yuvarlak miyositleri saymak için bir hemasitometrede 10 ul hacimde çoğaltmak. Miyositlerin toplam sayısını hesaplayın ve çubuk şekilli miyositlerin yüzdesini hesaplamak.
8. 20 x g'de 3 dakika boyunca miyositleri santrifüjleyin. Süpernatantı ve 100 uM ₂ CaCl ihtiva eden 10 ml kalsiyum çözeltisi II pelet tekrar süspansiyon. Pipetleme ucu ince bir transfer pipet miyositleri Dağılanyukarı ve aşağı.
9. Sırasıyla, kalsiyum III çözeltisi (400 uM _CaCl2) ve IV (900 uM _CaCl2) kullanılarak, yukarıdaki adım (5.8) tekrarlayın.
10. Fare miyosit Birincil kültür için, orta kaplama 5 ml nihai miyosit pelletini. Miyositlerin toplam sayısını ve çubuk şekilli miyositlerin yüzdesini hesaplamak.

6.. Hücre Kültürü

1. 50 ml bir tüp içinde 25.000 çubuk şeklinde bir myocytes / ml 'ye çubuk şekilli miyosit konsantrasyonunu ayarlayın. Yavaşça de onları askıya almak için bir 10 ml pipet kullanarak miyositleri pipetle. Her bir tabak veya levha için eşit hücre yoğunluğu sağlamak için pipet ve tüp hücre sedimantasyon kaçının.
2. Laminin kaplama çözümü aspire sonra, bu yemekleri veya plakalar halinde miyositleri plaka. Yavaşça kültürü kaputu yüzeyinde yemekler veya plakaları öne ve arkaya doğru ve yan-yana bir haç şeklinde bir örüntü içinde 3-4 kez kaydırın.
3. % 2 CO yemekleri veya tabak yerleştirin37 ° C'de ₂ inkübatör Yaklaşık% 80 arasında bir oranda miyosit bağlantısı oluşturmak için 1-3 saat boyunca inkübe edin.
4. Eki sonra, yavaşça serbest miyositleri ve hücre artıkları içeren orta aspire. Yavaşça yemekler veya levha yanlarına kültür ortamı ilave edin. Biri tarafından bu orta değişim birini yapın. Hemen inkübatör yemekleri veya plakaları dönmek.
5. O / N kültürden sonra, kısa süreli myocytes hücre sinyal çalışmaları daha önce BDM olmayan aynı ortam için değiştirilebilir. Hipertrofik ya da apoptoz tahliller için uzun vadeli kültür BDM tutun.
   Not: BDM (2,3-bütandion monoxime) miyozin-ATPaz inhibe ve kasılmasını önlemek olabilir. Miyozin-tabanlı daralmanın bunun önlenmesi kolayca tersine çevrilebilir. Bu BDM örneğin spesifik olmayan bir fosfataz olarak hareket SR kalsiyum serbest kalmasını arttırır ve serbest kalsiyum konsantrasyonu ve hücresel elektrik prope değiştirilmesi gibi bazı potansiyel yan etkilere sahip olduğu rapor edilmiştirilgili taraflar, bu nedenle tedavi öncesi, BDM çıkarılmalıdır. Ayrıca, bazı durumlarda, belirli bir miyozin II inhibitörü Blebbistatin kardiyomiyosit daralma ^8,9 inhibe etmek için alternatif bir ilaç olabilir. Ancak, bizim durumlarda, BDM kardiyomiyositlerin nitelik ve nicelik uğruna Blebbistatin daha iyidir.

Sonuçlar

1.. Başarılı İzolasyon Kantitasyonu

Iki kriter izolasyonu başarısını ölçmek için kullanılır: İlk olarak, toplam izole kardiyomiyositlerde sayısı, ve ikinci olarak, çubuk şeklinde kalsiyum toleranslı yuvarlak olmayan dayanıklı miyosit oranıdır. Genellikle bu protokol kalp kaldırılması miyosit kaplama ve bir yetişkin fare kalbinden verimleri yaklaşık 1 milyon çubuk şeklindeki kardiyomiyositlerin (hasat toplam miyositlerin% 70-90) yaklaşık 75-90 dakika sürer. Bu f...

Tartışmalar

En iyi hazırlanması için, en kritik adımlar şunlardır: 1) derhal çıkarıldıktan sonra kanül fare kalp çengel; 2) uygun kalp perfüzyon. Ayrıca, bu su kalitesini, perfüzyon sıcaklığı, tampon pH, sterilizasyon, kimyasal saflığı ve temiz, kirli olmayan boru ve odaları da önemli faktörlerdir unutmayın. M 18.2 moleküler biyoloji dereceli H ₂ O yüksek tampon hazırlanması için özellikle tavsiye edilir. 200 mM ATP stok çözeltisinin pH değeri 7.2, kolaylıkla kaçırılmaz bir adıma ayarlanmalıdır.

...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolated heart system for small rodent	Harvard Apparatus	IHSR-mouse 73-4019
Aortic Cannula, OD 1.0 mm	Harvard Apparatus	73-2816
Dumont #4 Forceps	Fine science tools	11294-00
Straight sharp serrated scissors	Fine science tools	14070-12
Serrated Graefe forceps	Fine science tools	11050-10
Curved, serrated Graefe forceps	Fine science tools	11052-10
Straight Mini Serrefines clamps	Fine science tools	18054-28
MEM	Gibco	11575-032
Collagenase II	Worthington	4176
Mucosal universal detergent	Sigma	Z637181	Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent.