Regie dopaminergen Neuron Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen

Zusammenfassung

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson’s disease.

Zusammenfassung

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson’s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

Einleitung

Dopaminergen (DA) Neuronen in verschiedenen Hirnregionen, einschließlich des Mittelhirns, dem Hypothalamus, der Netzhaut und Riechkolben finden. Die A9 DA Neurone in der Substantia nigra pars compacta (SNpc) Regelverhalten und Bewegung durch die Projektion zum Striatum im Vorderhirn und Formen des extrapyramidal-motorischen Systems. Degeneration der A9 DA Neuronen führt zu Parkinson-Krankheit (PD), die die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung menschlichen und derzeit unheilbar ist. Zellersatztherapie ist eine der vielversprechendsten Strategien für die Behandlung von PD ^1, daher besteht ein großes Interesse bei der Ableitung A9 DA-Neuronen von menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs), die sowohl menschliche embryonale Stammzellen (hES) und jüngsten Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs).

Viel Forschung hat versucht, A9 DA Neuronen aus hPSCs mit verschiedenen Methoden abzuleiten. Die frühesten Berichte alle generierten DA Neuronen durch ein neuronalesRosette Vorläuferstadium. Durch Co-Kultivierung mit MS5 ² oder PA6 ^3-5 Stromazellen mit oder ohne externe Wachstumsfaktoren für 2-4 Wochen, L. Studer und Kollegen und drei anderen Gruppen erfolgreich induzierte neuronale hES Rosetten zu produzieren. Sie bereicherten dann diese Rosetten durch mechanische Präparation oder enzymatische Verdauung zur weiteren Differenzierung. In anderen Berichten, erzeugt Forscher neuralen Rosetten durch Embryoidkörper (EB) schwimmenden Kultur Differenzierung ^6-9. Später etablierte Forscher eine Monoschicht auf Basis Differenzierung Methode ^10,11, wo sie vergoldet und hES hiPSCs auf extrazellulären Matrix, fügte verschiedene Wachstumsfaktoren in der Kultur, die Differenzierung von hPSCs DA Neuronen, die die In-vivo-embryonalen Entwicklung DA Neuronen imitiert induzieren . Obwohl alle diese Studien erhalten Tyrosinhydroxylase (TH) exprimierenden Zellen mit einigen Merkmalen der DA-Neuronen, die gesamte Prozesszeit Differenzierung und arbeitsaufwendig,im allgemeinen ineffizient, und noch wichtiger, sind die A9 Identität dieser Neuronen in den meisten Studien, außer dem einen mit LMX1A ektopische Expression ¹² gezeigt. Kürzlich wurde eine neue Bodenplatte (FP) basierenden Protokoll wurde entwickelt, ^13-16, bei der die FP-Vorstufen mit DA Neuron Potential wurden zuerst durch Aktivierung des Sonic-Hedgehog und Wnt-Signalwege während der frühen Phase der Differenzierung erzeugt wird, und dann Die FP-Zellen wurden weiter auf DA-Neuronen angegeben. Obwohl dieses Protokoll ist effizienter, gibt es noch einige Probleme; zum Beispiel, dauert der gesamte Differenzierung lange Zeit (mindestens 35 Tage) und feeder-Zelle abhängig ¹⁵ oder ¹⁶ abhängig ist, EB oder A9 Identität nicht nachgewiesen wurde ^14.

Hier, auf der Basis der Kenntnis von in vivo embryonalen DA Neuronenentwicklung und andere Forscher veröffentlichten Ergebnisse haben wir die Kulturbedingungen für die eff optimiertiziente Generation von DA Neuronen von beiden HES-Zellen und hiPSCs. Zunächst erzeugt FP-Vorläuferzellen durch Aktivierung des kanonischen Wnt-Signalmolekül mit kleinen CHIR99021 und Sonic Hedgehog-Signal mit kleinen Molekülen und SAG purmorphamine. Diese FP-Zellen exprimieren FOXA2, LMX1A, CORIN, OTX2 und NESTIN. Wir angegebene dann diese FP-Zellen zu DA Neuronen mit Wachstumsfaktoren, einschließlich BDNF, GDNF, etc. Die erzeugten DA Neuronen der A9 Zelltyp, wie sie sind für GIRK2 positive und negative für Calbindin ^17. Dieses Protokoll ist Feederzell-oder EB-unabhängigen, hocheffiziente und reproduzierbar. Mit diesem Protokoll kann man DA Neuronen in weniger als 4 Wochen aus hES-Zellen oder hiPSCs von Normalpersonen für Zelltransplantation Studie oder von hiPSCs von PD-Patienten für die in vitro Modellierung der PD oder Test potentielle therapeutische Mittel für PD abzuleiten.

Protokoll

1. Herstellung von Nährmedien

1. Bereiten embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Medium durch die Kombination der folgenden: 445 ml DMEM, 50 ml fetales Rinderserum (FBS) und 5 ml 100x Penicillin / Ampicillin-Stammlösung. Halten sterilfiltriert Medium bei 4 ° C für nicht mehr als 14 Tage.
2. Bereiten serumhaltigem HPSC Kulturmedium durch die Kombination der folgenden: 385 ml DMEM / F12, 100 ml Knockout Serumersatz (KSR), 5 ml 100x nicht-essentielle Aminosäure-Stammlösung, 5 ml 100x Penicillin / Ampicillin-Stammlösung, 5 ml 100x -Mercaptoethanol Stammlösung und 10 ng / ml bFGF. Halten sterilfiltriert Medium bei 4 ° C für nicht mehr als 10 Tage.
3. Bereiten mTeSR1 Serum-freien Medium durch die Kombination der folgenden: 400 ml mTeSR1 Grundmedium, 100 ml 5x zu ergänzen, und 5 ml 100x Penicillin / Ampicillin-Stammlösung. Halten Medium bei 4 ° C für nicht mehr als 10 Tage.
4. Bereiten 10x Kollagenase IV-Stammlösung: 0,5 g abwiegen Kollagenase IV Macht, undlösen sie mit 50 ml DMEM / F12 und Filter zu sterilisieren. Aliquots machen und versehen Sie sie bei -20 ° C für Monate.
5. Bereiten 0,1% Gelatine-Lösung: 0,5 g abwiegen Gelatine (aus Rinderhaut, Typ B) Kraft und löst ihn mit VE-Wasser. Halten Autoklaven sterilisierte Lösung bei Raumtemperatur für Wochen.
6. Bereiten KSR Differenzierungsmedium durch die Kombination der folgenden: 410 ml DMEM, 75 ml KSR, 5 ml 100x nicht-essentielle Aminosäure-Stammlösung, 5 ml 100x Penicillin / Ampicillin-Stammlösung, 5 ml 100x -Mercaptoethanol Stammlösung. Halten sterilfiltriert Medium bei 4 ° C für nicht mehr als 10 Tage.
   HINWEIS: KSR variiert von Charge zu Charge, die die Differenzierung Effizienz beeinträchtigen können. Es ist daher besser, mehrere Chargen von KSR zu testen, um das beste für die Differenzierung zu finden.
7. Bereiten N2 Differenzierungsmedium durch die Kombination der folgenden: 98 ml DMEM, 1 ml 100x N2 Ergänzung und 1 ml 100x Penicillin / Ampicillin-Stammlösung. Halten sterilfiltriert Medium bei 4° C für nicht mehr als 10 Tage.
8. Bereiten B27 Differenzierungsmedium durch die Kombination der folgenden: 480 ml Neurobasalmedium, 10 ml 50x B27 ergänzen, 5 ml 100x Glutamax Stammlösung und 5 ml 100x Penicillin / Ampicillin-Stammlösung. Halten sterilfiltriert Medium bei 4 ° C für nicht mehr als 10 Tage.

2. Kultur von hES-Zellen und hiPSCs auf MEF Feeder-Zellen

Die H9 hES wurden von WiCell Research Institute und hiPSCs wurden in der Reijo Pera Labor durch Retrovirus-vermittelte Transduktion von Yamanaka gegründet Faktoren OCT3 / 4, SOX2, Klf4 und c-MYC ^18.

1. Mindestens einen Tag vor der Zelldurchgang, bereiten einige Gelatineplatten durch Zugabe von 1 ml 0,1% Gelatine auf 1 und der 6-Well-Platten, Platten und Inkubation bei 37 ° C für mindestens 30 min.
2. Nach der Inkubation aspirieren Gelatine von den Platten und Samen Bestrahlung inaktiviert MEF-Zellen auf die Platten in einer Dichte von 1,6 x 10 ⁵ Zellen/ Well in MEF Medium mit einer Zählkammer, um die Zellen zu zählen.
   HINWEIS: Optional MEF Feeder schon nach 3 Tage vor der Zelldurchgang vorzubereiten.
3. Passage-Zellen einen Tag nach Plattierung MEF Anleger: absaugen Medium von hPSCs, fügen Sie 1 mg / ml Kollagenase IV-Zellen in 1 ml / Vertiefung und Inkubation Zellen bei 37 ° C für 1 Stunde.
4. Während dieser Inkubation, Waschen MEF Feeder einmal mit PBS, und fügen Sie dann warm (37 ° C) serumhaltigem HPSC Kulturmedium bei 1,5 ml / well.
5. Nach 1 Stunde, tippen Sie auf der Kulturplatte ein paar Mal, so dass die meisten der undifferenzierte Kolonien von den Platten lösen, während die differenzierte Kolonien befestigt bleiben. Sorgfältig sammeln die schwimmende Kolonien, und sie in 15-ml-Tube.
6. Die Platte vorsichtig waschen einmal mit warmem (37 ° C) DMEM / F12 und übertragen DMEM / F12 in den gleichen 15-ml-Tube.
7. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 179 g für 3 min.
8. Saugen Sie das Medium aus den Röhren, man aufpassen, dass das Pellet nicht zu stören. Krieg hinzufügenm HPSC Kulturmedium, Pipette die Zellen nach oben und unten mehrere Male, um sie in kleinen Gruppen zu brechen und mischen sie gut.
9. Übertragen Sie die Zellen auf neue MEF Feeder bei 1: 3-1: 6-Verhältnis.
10. Ändern Sie das Medium jeden Tag und Durchgang die Zellen alle 5-6 Tage.

3. Herstellung von Zellen zur Differenzierung

1. Mindestens einen Tag vor der Herstellung der Zellen, bereiten einige Matrigel Platten (typischerweise 3 Wells einer 6-Well-Platte). Verdünnen Sie die Matrigel mit kaltem (4 ° C) DMEM / F12 um 1:40 und 1 ml pro Vertiefung Matrigel 6-Well-Platten. Inkubieren Matrigel Platten bei 4 ° C über Nacht. Hinweis: Man kann Matrigel Platten mit Parafilm versiegeln haben und lagern bei 4 ° C solange eine Woche.
2. Verwenden Zellen (siehe Schritt 2) 4 Tage nach Durchgang. Entfernen Sie alle differenzierte Kolonien von den Platten. Absaugen Medium von der Kulturplatte, 1 ml pro Vertiefung Accutase, und Inkubation Zellen bei 37 ° C für 5 min.
3. Während der Inkubation bereiten einige GelAtins Platten durch Zugabe von 1 ml Gelatine 1 und der 6-Well-Platten. Legen Sie diese Platten und die Matrigel-Platten einen Tag vor im Inkubator bereit.
4. Nach der 5-minütigen Inkubation oder wenn die Zellen haben sich halbschwimmend, Pipetten Zellen nach oben und unten mehrere Male, um sie in Einzelzellen zu machen.
5. Sammeln Sie einzelne Zellen in 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren bei 258 g für 3 min.
6. Die Zellen mit einer geeigneten Menge an Serum, HPSC Kulturmedium, und fügen Thiazovivin bis zu einer Endkonzentration von 2 uM.
7. Übertragung von Zellen auf Gelatine-beschichteten Platten in einer 1: 1-Verhältnis, und inkubieren Zellen bei 37 ° C für 30 min bis MEF Feeder entfernen.
8. Übertragen Sie die Zellen in ein 15 ml konischen Röhrchen, fügen Sie entsprechende Serum mit HPSC Medium und zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer.
9. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 258 g für 3 min.
10. Während Zentrifuge, fügen Thiazovivin zu mTeSR1 geeignete Medium, um eine Konzentration von 2 um zu machen.
11. Nach Zentrifuge, einspirate das Medium mit der geeigneten mTeSR1 Medium mit Thiazovivin so, dass es 1,8 x 10 ⁵ Zellen / ml Medium.
12. Nehmen Sie die Matrigel Platten aus dem Inkubator, saugen Sie den Matrigel und 2 ml der gemischten Zellen auf 1 und der 6-Well-Platten.
    HINWEIS: Die Zelldichte sollte 3,6 x 10 ⁴ Zellen / cm ² Oberfläche ist.
13. Bringen Sie die Platten wieder in den Inkubator, und lassen die Zellen legen für 24 Stunden.
14. 24 Stunden nach dem Ausstreichen der Zellen absaugen alte Medium und 2 ml Medium pro neue mTeSR1 gut und lassen Zellen wachsen weitere 24 Stunden vor Beginn der Differenzierung.

Zelldifferenzierung

1. Starten Differenzierung 48 Stunden nach der Neubelegung der Zellen auf Matrigel Platten.
2. Absaugen Kulturmedium von der Platte, waschen Sie die Zellen einmal mit PBS, und 2 ml der folgenden Differenzierungsmedium pro Well: KSR Differenzierungsmedium mit 10 uM SB431542 und 100 nM LDN-193 ergänzt189. Mark diesen Tag als D0 der Differenzierung.
3. Ändern Medium täglich von D0 bis D20.
   HINWEIS: Man kann Medium zur Verwendung nicht mehr als 2 Tage zu einer Zeit vorzubereiten.
4. Verwenden Sie das folgende Medium für D1 und D2: KSR Differenzierungsmedium mit 10 uM SB431542, 100 nM LDN-193189, 0,25 um SAG 2 um purmorphamine und 50 ng / ml FGF8b ergänzt.
5. Verwenden Sie das folgende Medium für D3 und D4: KSR Differenzierungsmedium mit 10 uM SB431542, 100 nM LDN-193189, 0,25 um SAG 2 um purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b und 3 um CHIR99021 ergänzt.
6. Verwenden Sie das folgende Medium für D5 und D6: 75% KSR Differenzierungsmedium plus 25% N2 Differenzierungsmedium mit 100 nM LDN-193189, 0,25 um SAG 2 um purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b und 3 um CHIR99021 ergänzt.
7. Verwenden Sie das folgende Medium für D7 und D8: 50% KSR Differenzierungsmedium plus 50% N2 Differenzierungsmedium mit 100 nM LDN-193189 und 3 um CHIR99021 ergänzt.
8. Verwenden Sie das folgende Medium für D9 und D10: 25% KSR Differenzierungsmedium plus 75% N2 Differenzierungsmedium mit 100 nM LDN-193189 und 3 um CHIR99021 ergänzt.
9. Verwenden Sie das folgende Medium für D11 und D12: B27 Differenzierungsmedium mit 3 um CHIR99021, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 1 ng / ml TGF3, 0,2 mM Ascorbinsäure und 0,1 mM cAMP ergänzt.
10. Verwenden Sie das folgende Medium für den Rest der Differenzierung: B27 Differenzierungsmedium mit 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 1 ng / ml TGF3, 0,2 mM Ascorbinsäure und 0,1 mM cAMP ergänzt.
11. Bei etwa D16 der Differenzierung, bereiten einige Poly-L-Ornithin / Laminin / Fibronektin-Platten. Verdünnen Poly-L-Ornithin-Stammlösung mit kaltem (4 ° C) PBS bis 15 pg / ml, 1 ml auf 1 und der 6-Well-Platten, die Platten und Inkubation bei 37 ° C über Nacht.
12. Saugen Sie den Poly-L-Ornithin-Lösung, waschen Sie die Platten 3 mal mit sterilem Wasser und dann an der Luft trocknen die Platten.
13. Verdünnen Laminin Lager Solution mit kaltem (4 ° C) PBS auf 1 pg / ml, 1 ml einer gut 6-Well-Platten, die Platten und Inkubation bei 37 ° C über Nacht.
14. Saugen Sie den Laminin-Lösung, waschen Sie die Platten 3 mal mit sterilem Wasser und dann an der Luft trocknen die Platten.
15. Verdünnen Fibronektin-Stammlösung mit kaltem (4 ° C) PBS auf 2 pg / ml, 1 ml auf 1 und der 6-Well-Platten, die Platten und Inkubation bei 37 ° C über Nacht.
16. Dichtungsplatten mit Parafilm und sie bei 4 ° C für bis zu zwei Wochen.
17. Nach 20 Tagen der Differenzierung, Ausstrich der Zellen an die Poly-L-Ornithin / Laminin / Fibronektin-Platten. Absaugen Differenzierungsmedium, 1 ml warmem (37 ° C) bis 1 Accutase auch der 6-Well-Platten und Inkubation Zellen bei 37 ° C für 5 min.
18. Während der Inkubation, legen Sie die Poly-L-Ornithin / Laminin / Fibronektin-Platten in den Inkubator.
19. Nach der 5-minütigen Inkubation oder wenn die Zellen haben sich halbschwimmende, sanft Pipette Zellen nach oben und unten mehrere Male, ummachen sie in einzelne Zellen.
20. Sammeln Sie die einzelnen Zellen in 15 ml konischen Röhrchen, und fügen Sie die entsprechende Menge an Neurobasalmedium zur Zellzählung, die je nach Ausdehnung variieren (nach 11 Tagen der Differenzierung, Zellen 15-20 fach erweitern). Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer.
21. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 258 g für 3 min. Überstand wird abgesaugt, und resuspendieren Zellen mit B27 Differenzierungsmedium, so daß die Zellkonzentration 1 x 10 ⁶ Zellen / ml Medium.
22. Absaugen Fibronektin von den Platten, zweimal waschen mit PBS, und 2 ml Zellen 1 gut 6-Well-Platten.
    HINWEIS: Die Zelldichte für Replattierung sollte 2 x 10 ⁵ Zellen / cm ² Oberfläche ist.
23. Ändern Medium 24 Stunden später, um alle losen toten Zellen zu entfernen.
24. Ändern Medium jeden zweiten Tag, bis die gewünschten Zeitpunkte für einen bestimmten Experiment.

Ergebnisse

Ein Überblick über die Differenzierung Protokoll ist in 1 dargestellt. Die Effizienz der hier vorgestellten Differenzierungsprotokoll beruht auf den Status der Ausgangszellen. Daher ist es entscheidend, um sicherzustellen, dass alle ersten differenzierten Kolonien entfernt, bevor Dissoziieren hPSCs in einzelne Zellen zur Differenzierung und zweitens verbraucht eine meisten, wenn nicht alle, der MEF-Feeder-Zellen durch Inkubation der Zellen auf Gelatine-beschichteten Platten 30 Minuten, und die dritte,...

Diskussion

Menschlichen pluripotenten Stammzellen (hES und einschließlich der beiden hiPSCs) in vitro differenziert werden, um die meisten zu erzeugen, wenn nicht alle, Zellarten des Körpers einschließlich der DA-Neuronen, die in früheren Studien ¹⁹ nachgewiesen wurde. Hier, auf der Kenntnis von embryonalen dopaminergen Neuronen-Entwicklung ²⁰ und veröffentlichte Protokolle von anderen Laboratorien ^14,15 optimierten wir die Kulturbedingungen für die Erzeugung von DA-Neuronen aus HES ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Life Technologies	10569-010
FBS	Life Technologies	26140
penicillin/ampicillin	Life Technologies	15140-122
DMEM/F12	Life Technologies	10565-018
KSR	Life Technologies	10828-028
Non-essential amino acid	Life Technologies	11140-050
b-mercaptoethanol	Millipore	ES-007-E
bFGF	R&D Systems	233-FB-025
mTesR1	STEMCELL Technologies	5850
Collagenase IV	Life Technologies	17104-019
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391
N2 supplement	Life Technologies	17502-048
B27 supplement	Life Technologies	17504-044
Neurobasal	Life Technologies	21103-049
Glutamax	Life Technologies	35050-061
PBS	Life Technologies	10010-023
Growth factor reduced matrigel	BD Biosciences	354230
Accutase	MP Biomedicals	1000449
Thiazovivin	Santa Cruz Biotechnology	sc-361380
SB431542	Tocris Bioscience	1614
LDN-193189	Stemgent	04-0074
SAG	EMD Millipore	566660-1MG
Purmorphamine	Santa Cruz Biotechnology	sc-202785
FGF8b	R&D Systems	423-F8-025
CHIR99021	Cellagen Technology	C2447-2s
BDNF	R&D Systems	248-BD-025
GDNF	R&D Systems	212-GD-010
TGF-beta3	R&D Systems	243-B3-002
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4034
cAMP	Sigma-Aldrich	D0627
Mouse anti human NESTIN antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927	1/1,000 dilution
Rabbit anti human OTX2 antibody	Millipore	AB9566	1/2,000 dilutiion
Goat anti human FOXA2 antibody	R&D Systems	AF2400	1/200 dilution
rabbit anti human LMX1a antibody	Millipore	AB10533	1/1,000 dilution
Rabbit anti human TH antibody	Pel Freez	P40101	1/500 dilution
Chicken anti human TH antibody	Millipore	AB9702	1/500 dilution
Mouse anti human TUJ1 antibody	Covance	MMS-435P	1/,2000 dilution
Rabbit anti human GIRK2 antibody	Abcam	ab30738	1/300 dilution
Rabbit anti human Calbindin antibody	Abcam	ab25085	1/400 dilution
Centrifuge	Eppendorf	5804