Réalisé neurone dopaminergique différenciation de cellules pluripotentes humaines souches

Résumé

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson’s disease.

Résumé

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson’s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

Introduction

Dopaminergique (DA) des neurones peuvent être trouvés dans plusieurs régions du cerveau, y compris le mésencéphale, hypothalamus, la rétine et bulbes olfactifs. Les neurones DA A9 dans la substantia nigra pars compacta (SNpc) et un comportement de commande de mouvement en projetant dans le striatum du cerveau antérieur et formant le système moteur extrapyramidal. La dégénérescence des neurones DA A9 conduit à la maladie de Parkinson (PD), qui est la deuxième maladie neurodégénérative humaine la plus courante et actuellement incurable. la thérapie de remplacement cellulaire est l'une des stratégies les plus prometteuses pour le traitement de PD ^1, par conséquent, il ya eu un grand intérêt pour dériver neurones A9 DA à partir de cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs), y compris les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et la cellules dernières anthropiques souches pluripotentes (hiPSCs).

Beaucoup de recherches ont tenté de tirer les neurones A9 DA de hPSCs en utilisant diverses méthodes. Les premiers rapports tous les neurones DA générés par un neuronalstade rosette progénitrices. En co-culture avec MS5 ² ou PA6 ^3-5 cellules stromales avec ou sans facteurs de croissance externe pour 2-4 semaines, L. Studer et collègues et trois autres groupes induits succès CSEh pour produire des rosettes de neurones. Ils ont ensuite enrichi ces rosettes par dissection mécanique ou digestion enzymatique pour une différenciation plus poussée. Dans d'autres rapports, les chercheurs ont généré des rosettes de neurones par corps embryoïdes (EB) la différenciation de culture ^6-9 flottants. Par la suite, les chercheurs ont établi un procédé de différenciation de la monocouche à base de ^10,11, où ils étalées cellules hES et hiPSCs sur la matrice extra-cellulaire, ajouter différents facteurs de croissance dans la culture pour induire la différenciation de hPSCs de neurones dopaminergiques, qui imite l'vivo DA embryonnaire du développement dans des neurones . Bien que toutes ces études obtenus tyrosine hydroxylase (TH) cellules exprimant certaines caractéristiques des neurones dopaminergiques, le processus de différenciation ensemble est temps et de travail consommant,généralement inefficaces, et plus important encore, l'identité A9 de ces neurones n'ont pas été démontrée dans la plupart des études, sauf celle avec Lmx1a expression ectopique ^12. Récemment, une nouvelle plaque de plancher (FP) du protocole à base a été développé ^13-16, dans lequel les précurseurs de PF avec DA potentiel de neurone ont d'abord été générés par l'activation de la sonic hedgehog et canoniques voies de signalisation Wnt au cours de la phase précoce de la différenciation, puis ces cellules PF ont été précisées pour les neurones dopaminergiques. Bien que ce protocole est plus efficace, il ya encore quelques problèmes; par exemple, l'ensemble du processus de différenciation prend beaucoup de temps (au moins 35 jours) et de cellules nourricières est dépendante ^15, ou EB est dépendante de l'identité ou de ¹⁶ A9 ¹⁴ n'a pas été démontrée.

Ici, sur la base de la connaissance de in vivo développement embryonnaire DA neurone et les résultats publiés d'autres chercheurs de, nous avons optimisé les conditions de culture pour l'effgénération isant des neurones dopaminergiques de deux CSEh et hiPSCs. Nous avons généré des cellules précurseurs première FP par l'activation de la signalisation Wnt canonique avec une petite molécule et CHIR99021 signalisation Sonic Hedgehog avec de petites molécules et purmorphamine SAG. Ces cellules expriment PF FOXA2, Lmx1a, CORIN, OTX2 et nestine. Nous avons ensuite précisé ces cellules PF à neurones dopaminergiques avec des facteurs de croissance, y compris BDNF, GDNF, etc. Les neurones dopaminergiques sont générés de A9 type de cellule car ils sont positifs pour GIRK2 tout négatif pour Calbindin ^17. Ce protocole est une cellule d'alimentation ou EB indépendante, hautement efficace et reproductible. En utilisant ce protocole, on peut dériver neurones DA en moins de 4 semaines à partir de CSEh ou hiPSCs des personnes normales pour l'étude de la transplantation de cellules, ou de hiPSCs de patients parkinsoniens pour la modélisation in vitro de PD ou de tester des agents thérapeutiques potentiels pour PD.

Protocole

1 Préparation de milieux de culture

1. Préparer la souris fibroblastes embryonnaires (MEF) moyen en combinant la suivante: 445 ml de DMEM, 50 ml de sérum de veau fœtal (FBS), et 5 ml 100x pénicilline / ampicilline solution stock. Maintenir le filtre milieu stérilisé à 4 ° C pendant au plus 14 jours.
2. Préparer le milieu de culture HPSC en combinant les éléments suivants contenant du sérum: 385 ml de DMEM / F12, 100 ml de remplacement de sérum de finale (KSR), 5 ml 100x non essentiels solution solution acide aminé d'achat d'actions, 5 ml 100x pénicilline / ampicilline actions, 5 ml 100x mercaptoéthanol solution mère, et 10 ng / ml de bFGF. Maintenir le filtre milieu stérilisé à 4 ° C pendant au plus 10 jours.
3. Préparer un milieu sans sérum mTeSR1 en combinant les éléments suivants: 400 ml mTeSR1 milieu de base, 100 ml 5x supplément, et 5 ml 100x pénicilline / ampicilline solution stock. Gardez milieu à 4 ° C pendant pas plus de 10 jours.
4. Préparer IV solution mère 10x collagénase: peser 0,5 g puissance collagénase IV, etdissoudre avec 50 ml de DMEM / F12 et stériliser par filtration. Faire aliquotes et les stocker à -20 ° C pendant plusieurs mois.
5. Préparer une solution de gélatine à 0,1%: peser 0,5 g de gélatine (peau de bovin, type B) de puissance et dissoudre avec de l'eau désionisée. Gardez solution stérilisée en autoclave à la température ambiante pendant des semaines.
6. Préparer milieu de différenciation KSR en combinant la suivante: 410 ml de DMEM, 75 ml KSR, 5 ml 100x solution non acide aminé essentiel actions, 5 ml 100x pénicilline / ampicilline solution stock, 5 ml 100X mercaptoéthanol solution de stock. Maintenir le filtre milieu stérilisé à 4 ° C pendant au plus 10 jours.
   REMARQUE: KSR varie d'un lot à l', ce qui peut affecter l'efficacité de la différenciation. Il est donc préférable de tester plusieurs lots de KSR pour trouver la meilleure solution pour la différenciation.
7. Préparer milieu de différenciation N2 en combinant les éléments suivants: 98 ml de DMEM, 1 ml 100x supplément N2 et 1 ml 100x pénicilline / ampicilline solution stock. Maintenir le filtre milieu stérilisé à 4° C pendant au plus 10 jours.
8. Préparer milieu de différenciation de B27 en combinant la suivante: 480 ml de milieu neurobasal, 10 ml 50x B27 supplément, 5 ml 100X Glutamax solution mère, et 5 ml 100x pénicilline / ampicilline solution stock. Maintenir le filtre milieu stérilisé à 4 ° C pendant au plus 10 jours.

2. culture des CSEh et hiPSCs sur des cellules nourricières MEF

Les CSEh H9 proviennent de l'Institut de recherche et WiCell hiPSCs ont été établis dans le laboratoire Reijo Pera par transduction rétrovirale médiation de Yamanaka facteurs OCT3 / 4, SOX2, KLF4 et c-MYC ^18.

1. Au moins un jour avant le passage des cellules, la préparation des plaques de gélatine par addition de 1 ml de gélatine à 0,1% à 1 puits de plaques à 6 puits et incuber les plaques à 37 ° C pendant au moins 30 min.
2. Après incubation, les plaques de gélatine aspiration, et l'irradiation des semences cellules MEF inactivées sur les plaques à la densité de 1,6 x 10 ⁵ cellules/ Puits dans le milieu MEF utilisant un hémocytomètre pour compter les cellules.
   REMARQUE: préparer option mangeoires MEF dès 3 jours avant le passage de la cellule.
3. cellules Passage d'un jour après l'étalement mangeoires MEF: Aspirer le milieu de hPSCs, ajouter 1 mg / ml de collagénase IV de cellules à 1 ml / puits et incuber les cellules à 37 ° C pendant 1 heure.
4. Pendant cette incubation, laver les mangeoires MEF fois avec du PBS, puis ajoutez chaud (37 ° C) HPSC milieu de culture contenant du sérum à 1,5 ml / puits.
5. Après 1 heure, appuyez sur la plaque de culture une couple de fois de sorte que la plupart des colonies indifférenciées se détacher des plaques, tandis que les colonies différenciées restent attachés. Recueillir soigneusement les colonies flottantes, et de les transférer en tube de 15 ml.
6. Lavez délicatement la plaque une fois avec chaud (37 ° C) DMEM / F12 et transférer DMEM / F12 dans le même tube de 15 ml.
7. Centrifuger les tubes à 179 g pendant 3 min.
8. Aspirer le milieu des tubes, en faisant attention de ne pas perturber le culot. Ajouter guerremilieu de culture m HPSC, la pipette les cellules de haut en bas plusieurs fois pour les briser en petits groupes et mélangez-les bien.
9. Transférer les cellules sur de nouveaux départs MEF à 1: 3-1: 6 rapport.
10. Changer le support chaque jour et le passage des cellules tous les 5-6 jours.

3 Préparation des cellules pour la différenciation

1. Au moins un jour avant la préparation de cellules, préparer des plaques de Matrigel (typiquement 3 puits d'une plaque à 6 puits). Diluer avec du Matrigel froid (4 ° C) du milieu DMEM / F12 à 01:40 et ajouter 1 ml de Matrigel par puits de plaques à 6 puits. Incuber les plaques de Matrigel à 4 ° C pendant une nuit. NOTE: On peut sceller les plaques de Matrigel avec du Parafilm et les stocker à 4 ° C pendant aussi longtemps qu'une semaine.
2. Utiliser des cellules (voir étape 2) 4 jours après le passage. Retirez toutes les colonies différenciées des plaques. Aspirer le milieu de la plaque de culture, ajouter 1 ml Accutase par puits, et incuber les cellules à 37 ° C pendant 5 min.
3. Pendant l'incubation, préparer quelques gelatin plaques par addition de 1 ml de gélatine à 1 puits de plaques à 6 puits. Placez ces plaques et les Matrigel plaques préparées la veille dans l'incubateur.
4. Après la 5 minutes d'incubation ou lorsque les cellules sont devenues semi-flottant, les cellules de pipette de haut en bas plusieurs fois pour en faire des cellules individuelles.
5. Recueillir des cellules individuelles dans tubes de 15 ml et centrifuger à 258 g pendant 3 min.
6. Resuspendre les cellules avec suffisamment de sérum contenant du milieu de culture, et HPSC Thiazovivin ajouter à la concentration finale de 2 uM.
7. Transfert des cellules sur des plaques recouvertes de gélatine à 1: 1, et les cellules incuber à 37 ° C pendant 30 min pour éliminer les mangeoires MEF.
8. Transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml, ajouter un milieu contenant du sérum approprié HPSC et compter les cellules avec un hémocytomètre.
9. Centrifuger les cellules à 258 g pendant 3 min.
10. Au cours de centrifugeuse, ajouter Thiazovivin de s'approprier moyen mTeSR1 pour obtenir une concentration de 2 uM.
11. Après centrifugation, unespirate le milieu et ajouter mTeSR1 milieu approprié avec Thiazovivin sorte qu'il n'y a 1,8 x 10 ⁵ cellules / ml de milieu.
12. Sortez les plaques Matrigel de l'incubateur, aspirer le Matrigel et ajouter 2 ml de cellules mixtes sur 1 puits des plaques de 6 puits.
    REMARQUE: La densité cellulaire doit être de 3,6 x 10 ⁴ cellules / cm ² de surface.
13. Remettre les plaques de retour à l'incubateur, et que les cellules se fixent pendant 24 heures.
14. 24 heures après l'étalement des cellules, aspirer ancien milieu et ajouter 2 ml nouveau média mTeSR1 par puits et laisser les cellules se développent pour un autre 24 heures avant le début de la différenciation.

La différenciation des cellules

1. Lancer la différenciation 48 heures après les plaquant les cellules sur des plaques de Matrigel.
2. Aspirer le milieu de culture de la plaque, se laver les cellules une fois avec du PBS, et ajouter 2 ml de milieu de différenciation suivante par puits: milieu de différenciation KSR complété avec 10 uM SB431542 et 100 nM LDN-193189. Marquer ce jour D0 de différenciation.
3. Changer le milieu tous les jours de D0 à D20.
   NOTE: On peut préparer le milieu pour une utilisation pas plus de 2 jours à la fois.
4. Utilisez le milieu suivant pour D1 et D2: milieu de différenciation KSR complété avec 10 uM SB431542, 100 nM LDN-193189, 0,25 uM SAG, 2 uM purmorphamine, et 50 ng / ml FGF8b.
5. Utilisez le milieu suivant pour D3 et D4: milieu de différenciation KSR complété avec 10 uM SB431542, 100 nM LDN-193189, 0,25 uM SAG, 2 uM purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b, et 3uM CHIR99021.
6. Utilisation du support suivant pour D5 et D6: 75% de milieu de différenciation KSR plus 25% milieu de différenciation N2 complété avec 100 nM LDN-193189, 0,25 uM SAG, 2 uM purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b, et 3 uM CHIR99021.
7. Utilisez le milieu suivant pour D7 et D8: 50% de milieu de différenciation KSR plus 50% de milieu de différenciation N2 complété avec 100 nM LDN-193189 et 3 uM CHIR99021.
8. Utilisez le milieu suivant pour D9 et D10: 25% KSR milieu de différenciation plus 75% de milieu de différenciation N2 complété avec 100 nM LDN-193189 et 3 uM CHIR99021.
9. Utilisation du support suivant pour D11 et D12: milieu de différenciation B27 additionné de 3 uM CHIR99021, 10 ng / ml de BDNF, 10 ng / ml GDNF 1 ng / ml TGF3, 0,2 mM d'acide ascorbique et 0,1 mM d'AMPc.
10. Utilisation du support suivant pour le reste de la différenciation: milieu de différenciation B27 supplémenté avec 10 ng / ml de BDNF, 10 ng / ml GDNF 1 ng / ml TGF3, l'acide ascorbique 0,2 mM et 0,1 mM d'AMPc.
11. A peu près à D16 de la différenciation, de préparer des poly-L-ornithine laminine / plaques / fibronectine. Diluer poly-L-ornithine solution stock de froid (4 ° C) PBS à 15 pg / ml, ajouter 1 ml à 1 puits de plaques 6 puits et incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit.
12. Aspirer la solution poly-L-ornithine, laver les plaques 3 fois avec de l'eau stérile, puis sécher à l'air les plaques.
13. Diluer la laminine stocks solution de froid (4 ° C) PBS à 1 pg / ml, ajouter 1 ml d'un puits de plaques 6 puits et incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit.
14. Aspirer la solution de laminine, laver les plaques 3 fois avec de l'eau stérile, puis sécher à l'air les plaques.
15. Diluer la solution de fibronectine du stock de froid (4 ° C) PBS à 2 pg / ml, ajouter 1 ml à 1 puits de plaques 6 puits et incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit.
16. plaques d'étanchéité avec du parafilm et placer à 4 ° C pendant jusqu'à deux semaines.
17. Après 20 jours de différenciation, Réensemencement cellules aux plaques / laminine / fibronectine Poly-L-ornithine. milieu de différenciation Aspirer, ajouter 1 ml chaude (37 ° C) Accutase à 1 puits de plaques 6 puits et incuber les cellules à 37 ° C pendant 5 min.
18. Au cours de l'incubation, placer les poly-L-ornithine laminine / plaques / fibronectine dans l'incubateur.
19. Après la 5 minutes d'incubation ou lorsque les cellules sont devenues semi-flottant, en douceur les cellules de pipette de haut en bas plusieurs fois àrendre dans des cellules individuelles.
20. Recueillir les cellules individuelles dans 15 ml tubes coniques, et ajouter la quantité appropriée de milieu neurobasal pour le comptage des cellules, qui varie en fonction de l'expansion (après 11 jours de différenciation, les cellules peuvent augmenter 15-20 fois). Compter les cellules en utilisant un hématimètre.
21. Centrifuger les cellules à 258 g pendant 3 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules avec du milieu de différenciation B27 de sorte que la concentration cellulaire est de 1 x 10 ⁶ cellules / ml de milieu.
22. Aspirer la fibronectine à partir des plaques, laver deux fois avec du PBS, et ajouter 2 ml de cellules à une puits de plaques à 6 puits.
    REMARQUE: La densité cellulaire pour réensemencement doit être de 2 x 10 ⁵ cellules / cm ² de surface.
23. Changer le milieu de 24 heures plus tard pour enlever les cellules mortes seules.
24. Changer le milieu tous les deux jours jusqu'à ce que les points de temps souhaités pour une expérience donnée.

Résultats

Un aperçu du protocole de différenciation est représenté sur la Figure 1. L'efficacité du protocole de différenciation présentée ici se fonde sur l'état des cellules de départ. Par conséquent, il est essentiel de faire en sorte que, tout d'abord une supprime toutes les colonies différenciées avant dissociation hPSCs dans des cellules individuelles de la différenciation, et d'autre part, une épuise la plupart, si pas toutes, les cellules nourricières MEF par l'incubati...

Discussion

Les cellules souches pluripotentes humaines (y compris les cellules hES hiPSCs) et peuvent être différenciées in vitro afin de générer la plupart, sinon tous, les types de notre corps, y compris les neurones dopaminergiques, qui a été démontré dans des études précédentes ¹⁹ cellules. Ici, basée sur la connaissance de dopaminergique développement embryonnaire des neurones ²⁰ et protocoles publiés par les autres laboratoires ^14,15, nous avons optimisé les condition...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Life Technologies	10569-010
FBS	Life Technologies	26140
penicillin/ampicillin	Life Technologies	15140-122
DMEM/F12	Life Technologies	10565-018
KSR	Life Technologies	10828-028
Non-essential amino acid	Life Technologies	11140-050
b-mercaptoethanol	Millipore	ES-007-E
bFGF	R&D Systems	233-FB-025
mTesR1	STEMCELL Technologies	5850
Collagenase IV	Life Technologies	17104-019
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391
N2 supplement	Life Technologies	17502-048
B27 supplement	Life Technologies	17504-044
Neurobasal	Life Technologies	21103-049
Glutamax	Life Technologies	35050-061
PBS	Life Technologies	10010-023
Growth factor reduced matrigel	BD Biosciences	354230
Accutase	MP Biomedicals	1000449
Thiazovivin	Santa Cruz Biotechnology	sc-361380
SB431542	Tocris Bioscience	1614
LDN-193189	Stemgent	04-0074
SAG	EMD Millipore	566660-1MG
Purmorphamine	Santa Cruz Biotechnology	sc-202785
FGF8b	R&D Systems	423-F8-025
CHIR99021	Cellagen Technology	C2447-2s
BDNF	R&D Systems	248-BD-025
GDNF	R&D Systems	212-GD-010
TGF-beta3	R&D Systems	243-B3-002
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4034
cAMP	Sigma-Aldrich	D0627
Mouse anti human NESTIN antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927	1/1,000 dilution
Rabbit anti human OTX2 antibody	Millipore	AB9566	1/2,000 dilutiion
Goat anti human FOXA2 antibody	R&D Systems	AF2400	1/200 dilution
rabbit anti human LMX1a antibody	Millipore	AB10533	1/1,000 dilution
Rabbit anti human TH antibody	Pel Freez	P40101	1/500 dilution
Chicken anti human TH antibody	Millipore	AB9702	1/500 dilution
Mouse anti human TUJ1 antibody	Covance	MMS-435P	1/,2000 dilution
Rabbit anti human GIRK2 antibody	Abcam	ab30738	1/300 dilution
Rabbit anti human Calbindin antibody	Abcam	ab25085	1/400 dilution
Centrifuge	Eppendorf	5804