Regia neuroni dopaminergici differenziazione da cellule staminali pluripotenti umane

Riepilogo

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson’s disease.

Abstract

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson’s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

Introduzione

Dopaminergica (DA), i neuroni possono essere trovati in diverse regioni del cervello, tra cui il mesencefalo, l'ipotalamo, retina, e bulbi olfattivi. I neuroni A9 DA nella pars compacta della substantia nigra (SNPC) comportamento di controllo e il movimento proiettando alla striato nel proencefalo e formare il sistema motorio extrapiramidale. La degenerazione dei neuroni A9 DA conduce alla malattia di Parkinson (PD), che è la seconda malattia neurodegenerativa umana più comune e attualmente incurabile. Terapia di sostituzione cellulare è una delle strategie più promettenti per il trattamento della malattia di Parkinson ^1, quindi, c'è stato un grande interesse derivante neuroni A9 DA da cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs), includendo sia le cellule staminali embrionali umane (hESC) e il recenti cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSCs).

Molta ricerca ha cercato di ricavare neuroni A9 DA da hPSCs utilizzando vari metodi. Le prime relazioni di tutti i neuroni DA generati attraverso una neuralefase progenitore rosetta. In co-coltura con MS5 ² o PA6 ^3-5 cellule stromali con o senza fattori di crescita esterna per 2-4 settimane, L. Studer e colleghi e di altri tre gruppi indotte con successo hESC per produrre rosette neurali. Hanno poi arricchito queste rosette di dissezione meccanica o digestione enzimatica per un'ulteriore differenziazione. In altri rapporti, i ricercatori hanno generato rosette neurali attraverso il corpo embrioide (EB) galleggianti cultura differenziazione ^6-9. In seguito, i ricercatori hanno stabilito un monostrato basato metodo differenziazione ^10,11, dove si placcati hESC e hiPSCs sulla matrice extracellulare, aggiunti diversi fattori di crescita nella cultura di indurre la differenziazione di hPSCs di neuroni DA, che imita il vivo DA sviluppo embrionale dei neuroni in . Anche se tutti questi studi ottenuti tirosina idrossilasi (TH) cellule esprimente con alcune caratteristiche di neuroni DA, l'intero processo di differenziazione è il tempo e il lavoro consumo,generalmente inefficiente, e, soprattutto, l'identità A9 di questi neuroni non sono state dimostrate nella maggior parte degli studi, eccetto quella con Lmx1a espressione ectopica ^12. Recentemente, un piatto nuovo piano (FP) basata su protocollo è stato sviluppato ^13-16, in cui i precursori FP con DA potenziale del neurone sono stati generati dall'attivazione del riccio Sonic e canoniche vie di segnalazione Wnt durante la fase iniziale della differenziazione, e quindi queste cellule FP sono stati ulteriormente specificati per neuroni DA. Anche se questo protocollo è più efficiente, ci sono ancora alcuni problemi; per esempio, l'intero processo di differenziazione richiede molto tempo (almeno 35 giorni) ed è dipendente cella alimentatore ^15, o è dipendente EB ¹⁶ o l'identità A9 non è stato dimostrato ^14.

Qui, sulla base delle conoscenze di sviluppo embrionale in vivo DA neurone e risultati pubblicati di altri ricercatori, abbiamo ottimizzato le condizioni di coltura per l'effgenerazione icient di DA neuroni da entrambi hESC e hiPSCs. In primo luogo abbiamo generato cellule FP precursori dalla attivazione del segnale Wnt canonica con piccola molecola CHIR99021 e sonic hedgehog segnalazione con piccole molecole SAG e purmorphamine. Queste cellule esprimono FP Foxa2, Lmx1a, CORIN, OTX2 e nestina. Abbiamo poi specificato queste cellule FP a neuroni DA con fattori di crescita, tra cui BDNF, GDNF, ecc. I neuroni DA generati sono di tipo cellulare A9 come sono positivi per GIRK2 mentre negativo per calbindin ^17. Questo protocollo è cella alimentatore o EB indipendente, altamente efficiente e riproducibile. Usando questo protocollo, si può ricavare neuroni DA in meno di 4 settimane dalla hESC o hiPSCs di persone normali per lo studio trapianto di cellule, o da hiPSCs di pazienti PD per la modellazione in vitro di PD o testare potenziali agenti terapeutici per il PD.

Protocollo

1 Preparazione della Cultura media

1. Preparare topo fibroblasti embrionali (MEF) medium combinando il seguente: 445 ml di DMEM, 50 ml di siero fetale bovino (FBS), e 5 ml 100x penicillina / ampicillina soluzione stock. Tenere il filtro medio sterilizzato a 4 ° C per non più di 14 giorni.
2. Preparare siero contenente HPSC terreno di coltura combinando il seguente: 385 ml DMEM / F12, 100 ml di siero sostituzione knockout (KSR), 5 ml di 100x non essenziali aminoacidi soluzione madre, 5 ml 100x penicillina / ampicillina soluzione madre, 5 ml di 100x -mercaptoethanol soluzione stock, e 10 ng / ml bFGF. Tenere il filtro medio sterilizzato a 4 ° C per non più di 10 giorni.
3. Preparare mTeSR1 terreno privo di siero combinando il seguente: 400 ml mTeSR1 medio basale, 100 ml 5x supplemento, e 5 ml 100x penicillina / ampicillina soluzione stock. Mantenere il substrato a 4 ° C per non più di 10 giorni.
4. Preparare IV soluzione madre 10x collagenasi: pesare 0,5 g potere collagenasi IV, esciogliere con 50 ml di DMEM / F12 e filtro sterilizzare. Preparare delle aliquote e li scorta a -20 ° C per mesi.
5. Preparare la soluzione di gelatina allo 0,1%: pesare 0,5 g di gelatina (da pelle bovina, di tipo B), il potere e scioglierlo con acqua deionizzata. Mantenere soluzione sterilizzata in autoclave a temperatura ambiente per settimane.
6. Preparare KSR medio differenziazione combinando il seguente: 410 ml di DMEM, 75 ml KSR, 5 ml di soluzione 100X non essenziali aminoacidi magazzino, 5 ml 100x penicillina / soluzione madre ampicillina, 5 ml di soluzione madre 100X -mercaptoethanol. Tenere il filtro medio sterilizzato a 4 ° C per non più di 10 giorni.
   NOTA: KSR varia da lotto a lotto, che possono influenzare l'efficienza di differenziazione. E 'quindi meglio provare diversi lotti di KSR per trovare quello migliore per la differenziazione.
7. Preparare N2 medio differenziazione combinando il seguente: 98 ml di DMEM, 1 ml 100x supplemento N2 e 1 ml 100x penicillina / ampicillina soluzione stock. Tenere il filtro medio sterilizzato a 4° C per non più di 10 giorni.
8. Preparare B27 medio differenziazione combinando il seguente: 480 ml di mezzo Neurobasal, 10 ml 50x B27 supplemento, 5 ml di 100x Glutamax soluzione madre, e 5 ml 100x penicillina / ampicillina soluzione stock. Tenere il filtro medio sterilizzato a 4 ° C per non più di 10 giorni.

2. Cultura di hESC e hiPSCs su cellule di alimentatore MEF

Le hESC H9 sono stati ottenuti da WiCell Research Institute e hiPSCs sono stati stabiliti in laboratorio Reijo Pera attraverso retrovirus-mediata trasduzione di Yamanaka fattori Oct3 / 4, SOX2, Klf4, e c-MYC ^18.

1. Almeno un giorno prima del passaggio delle cellule, preparare alcuni piatti gelatina aggiungendo 1 ml di 0,1% di gelatina a 1 pozzetto di piastre da 6 pozzetti e incubare le piastre a 37 ° C per almeno 30 min.
2. Dopo l'incubazione, aspirare gelatina dalle piastre e sementi irradiazione inattivato cellule MEF sulle piastre alla densità di 1,6 x 10 ⁵ cellule/ Pozzetto in mezzo MEF utilizzando un emocitometro per contare le cellule.
   NOTA: In alternativa preparare alimentatori MEF fin da 3 giorni prima del passaggio delle cellule.
3. Cellule Passage Un giorno, dopo la placcatura alimentatori MEF: media aspirato da hPSCs, aggiungere 1 mg / ml di collagenasi IV a celle a 1 ml / pozzetto e incubare le cellule a 37 ° C per 1 ora.
4. Durante questa incubazione, lavare alimentatori MEF una volta con PBS, e quindi aggiungere calda (37 ° C) siero contenente HPSC terreno di coltura a 1,5 ml / pozzetto.
5. Dopo 1 ora, toccare la piastra di coltura un paio di volte in modo che la maggior parte delle colonie indifferenziate si staccherà dalle piastre, mentre le colonie differenziate rimangono attaccati. Raccogliere accuratamente le colonie galleggianti, e trasferirli in provetta 15 ml.
6. Lavare delicatamente la piastra una volta con acqua calda (37 ° C) DMEM / F12 e trasferire DMEM / F12 nello stesso tubo da 15 ml.
7. Centrifugare le provette a 179 xg per 3 min.
8. Aspirare il terreno dai tubi, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Aggiungi guerram HPSC terreno di coltura, le cellule pipettare su e giù più volte per romperli in piccoli gruppi e mescolare bene.
9. Trasferire le cellule su nuovi alimentatori MEF a 1: 3-1: 6 rapporto.
10. Cambiare la media ogni giorno e il passaggio delle cellule ogni 5-6 giorni.

3 Preparazione di cellule di Differenziazione

1. Almeno un giorno prima della preparazione delle cellule, preparare alcuni piatti Matrigel (tipicamente 3 pozzetti di una piastra da 6 pozzetti). Diluire il Matrigel con il freddo (4 ° C) DMEM / F12 a 01:40 e aggiungere 1 ml di Matrigel per pozzetto di 6 pozzetti. Incubare le piastre Matrigel a 4 ° C durante la notte. NOTA: Si può sigillare le piastre Matrigel con Parafilm e scorta a 4 ° C per tutto il tempo una settimana.
2. Utilizzare cellule (vedi punto 2) 4 giorni dopo il passaggio. Rimuovere tutte le colonie differenziate dalle piastre. Aspirare il terreno dalla piastra di coltura, aggiungere 1 ml accutase per pozzetto e incubare le cellule a 37 ° C per 5 min.
3. Durante l'incubazione, preparare alcuni gelAtin piatti con l'aggiunta di 1 ml di gelatina a 1 pozzetto di 6 pozzetti. Posizionare questi piatti e le Matrigel piastre preparate il giorno prima in incubatrice.
4. Dopo 5 min di incubazione o quando le cellule sono diventati semi-flottante, le cellule pipetta su e giù più volte per farli in cellule singole.
5. Raccogliere singole cellule in provette da 15 ml e centrifugare a 258 xg per 3 min.
6. Risospendere le cellule con un'adeguata quantità di siero contenente HPSC mezzo di coltura, e aggiungere Thiazovivin alla concentrazione finale di 2 micron.
7. Trasferire le cellule su piastre di gelatina rivestite in rapporto 1: 1, e incubare le cellule a 37 ° C per 30 minuti per rimuovere alimentatori MEF.
8. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml, aggiungere siero appropriato contenente HPSC medio e contare le cellule con un emocitometro.
9. Centrifugare le cellule a 258 xg per 3 min.
10. Durante centrifuga, aggiungere Thiazovivin appropriarsi mTeSR1 mezzo per effettuare una concentrazione di 2 mM.
11. Dopo centrifuga, unaspirano medio e aggiungere mezzo appropriato mTeSR1 con Thiazovivin modo che ci sono 1,8 x 10 ⁵ cellule / ml medie.
12. Estrarre le piastre Matrigel dal termostato, aspirare il Matrigel e aggiungere 2 ml di cellule miste su 1 bene dei 6 pozzetti.
    NOTA: La densità delle cellule dovrebbe essere 3,6 x 10 ⁴ cellule / cm ² di superficie.
13. Riportare le piastre torna l'incubatrice, e lasciare che le cellule attaccano per 24 ore.
14. 24 ore dopo la placcatura le cellule, aspirare vecchio medio e aggiungere 2 ml nuovo mezzo mTeSR1 per pozzetto e lasciare le cellule crescono per un altro 24 ore prima di iniziare la differenziazione.

Differenziazione cellulare

1. Inizia differenziazione 48 ore dopo replating le cellule su piastre Matrigel.
2. Aspirare il terreno di coltura dalla piastra, lavare le cellule una volta con PBS, e aggiungere 2 ml della seguente mezzo di differenziazione per pozzetto: medio differenziazione KSR supplementato con 10 mM SB431542 e 100 nM LDN-193189. Segna questo giorno come D0 di differenziazione.
3. Modificare media ogni giorno da D0 a D20.
   NOTA: Si può preparare mezzo per uso non più di 2 giorni alla volta.
4. Utilizzare il seguente mezzo per D1 e D2: media differenziazione KSR supplementato con 10 mM SB431542, 100 nM LDN-193.189, 0,25 mM SAG, 2 mM purmorphamine, e 50 ng / ml FGF8b.
5. Utilizzare il seguente mezzo per D3 e D4: media differenziazione KSR supplementato con 10 mM SB431542, 100 nM LDN-193.189, 0,25 mM SAG, 2 mM purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b, e 3 mM CHIR99021.
6. Utilizzare il seguente mezzo per D5 e D6: 75% KSR terreno di differenziamento più il 25% medio di differenziazione N2 integrato con 100 nM LDN-193.189, 0,25 mM SAG, 2 mM purmorphamine, 50 ng / ml FGF8b, e 3 mM CHIR99021.
7. Utilizzare il seguente mezzo per D7 e D8: 50% KSR terreno di differenziamento più il 50% medio di differenziazione N2 integrato con 100 nM LDN-193.189 e 3 micron CHIR99021.
8. Utilizzare il seguente mezzo per D9 e D10: 25% KSR terreno di differenziamento più il 75% medio di differenziazione N2 integrato con 100 nM LDN-193.189 e 3 micron CHIR99021.
9. Utilizzare il seguente mezzo per D11 e D12: media B27 differenziazione integrato con 3 mM CHIR99021, 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 1 ng / ml TGF3, acido ascorbico 0,2 mM e 0,1 mM cAMP.
10. Utilizzare il seguente mezzo per il resto della differenziazione: B27 medio differenziazione supplementato con 10 ng / ml BDNF, 10 ng / ml GDNF, 1 ng / ml TGF3, acido ascorbico 0,2 mM e 0,1 mM cAMP.
11. A circa D16 di differenziazione, preparare alcuni piatti / laminina / fibronectina Poly-L-ornitina. Diluire Poly-L-ornitina soluzione madre con il freddo (4 ° C) PBS a 15 mcg / ml, aggiungere 1 ml a 1 pozzetto di 6 pozzetti e incubare le piastre a 37 ° C durante la notte.
12. Aspirare la soluzione di poli-L-ornitina, lavare i piatti 3 volte con acqua sterile e poi asciugare le piastre.
13. Diluire laminina magazzino solution con il freddo (4 ° C) PBS a 1 mcg / ml, aggiungere 1 ml di un pozzetto di 6 pozzetti e incubare le piastre a 37 ° C durante la notte.
14. Aspirare la soluzione laminina, lavare i piatti 3 volte con acqua sterile e poi asciugare i piatti.
15. Diluire la soluzione fibronectina magazzino con il freddo (4 ° C) PBS per 2 mcg / ml, aggiungere 1 ml a 1 pozzetto di 6 pozzetti e incubare le piastre a 37 ° C durante la notte.
16. Chiudere le piastre con parafilm e metterli a 4 ° C per la durata di due settimane.
17. Dopo 20 giorni di differenziamento, le cellule replate alle piastre / laminina / fibronectina Poly-L-ornitina. Aspirare il terreno di differenziazione, aggiungere 1 ml di acqua calda (37 ° C) Accutase a 1 pozzetto di 6 pozzetti e incubare le cellule a 37 ° C per 5 min.
18. Durante l'incubazione, posizionare le piastre / laminina / fibronectina Poly-L-ornitina nell'incubatrice.
19. Dopo 5 min di incubazione o quando le cellule sono diventati semi-flottante, delicatamente le cellule pipetta su e giù diverse volte pertrasformarli in cellule singole.
20. Raccogliere le singole cellule in 15 ml tubi conici, e aggiungere la giusta quantità di mezzo Neurobasal per il conteggio delle cellule, che variano a seconda espansione (dopo 11 giorni di differenziamento, le cellule possono espandersi 15-20 volte). Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
21. Centrifugare le cellule a 258 xg per 3 min. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule con terreno di differenziamento B27 in modo che la concentrazione cellulare è di 1 x 10 ⁶ cellule / ml medie.
22. Aspirare fibronectina dalle piastre, lavare due volte con PBS e aggiungere 2 ml di cellule di 1 pozzo di 6 pozzetti.
    NOTA: La densità delle cellule per replating dovrebbe essere 2 x 10 ⁵ cellule / cm ² di superficie.
23. Modificare media 24 ore più tardi per rimuovere tutte le cellule morte senza legami.
24. Modificare media ogni giorno fino a quando i punti di tempo desiderati per un dato esperimento.

Risultati

Una panoramica del protocollo differenziazione è mostrato in Figura 1. L'efficienza del protocollo differenziazione presentato qui invoca lo stato delle celle di partenza. Pertanto, è fondamentale fare in modo che, prima rimuove tutte le colonie differenziate prima di dissociare hPSCs in celle singole per la differenziazione, e la seconda, una esaurisce la maggior parte, se non tutte, le cellule di alimentazione MEF incubando le cellule su piastre di gelatina rivestite per 30 minuti, e il terzo, u...

Discussione

Le cellule staminali pluripotenti umane (inclusi sia hESC e hiPSCs) possono essere differenziate in vitro per generare la maggior parte, se non tutti, i tipi di cellule del nostro corpo tra cui neuroni DA, che è stata dimostrata in studi precedenti ^19. Qui, sulla base delle conoscenze da dopaminergici embrionale neurone sviluppo ²⁰ e protocolli pubblicati da altri laboratori ^14,15, abbiamo ottimizzato le condizioni di coltura per la generazione di neuroni DA provenienti da hESC...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Life Technologies	10569-010
FBS	Life Technologies	26140
penicillin/ampicillin	Life Technologies	15140-122
DMEM/F12	Life Technologies	10565-018
KSR	Life Technologies	10828-028
Non-essential amino acid	Life Technologies	11140-050
b-mercaptoethanol	Millipore	ES-007-E
bFGF	R&D Systems	233-FB-025
mTesR1	STEMCELL Technologies	5850
Collagenase IV	Life Technologies	17104-019
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391
N2 supplement	Life Technologies	17502-048
B27 supplement	Life Technologies	17504-044
Neurobasal	Life Technologies	21103-049
Glutamax	Life Technologies	35050-061
PBS	Life Technologies	10010-023
Growth factor reduced matrigel	BD Biosciences	354230
Accutase	MP Biomedicals	1000449
Thiazovivin	Santa Cruz Biotechnology	sc-361380
SB431542	Tocris Bioscience	1614
LDN-193189	Stemgent	04-0074
SAG	EMD Millipore	566660-1MG
Purmorphamine	Santa Cruz Biotechnology	sc-202785
FGF8b	R&D Systems	423-F8-025
CHIR99021	Cellagen Technology	C2447-2s
BDNF	R&D Systems	248-BD-025
GDNF	R&D Systems	212-GD-010
TGF-beta3	R&D Systems	243-B3-002
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4034
cAMP	Sigma-Aldrich	D0627
Mouse anti human NESTIN antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927	1/1,000 dilution
Rabbit anti human OTX2 antibody	Millipore	AB9566	1/2,000 dilutiion
Goat anti human FOXA2 antibody	R&D Systems	AF2400	1/200 dilution
rabbit anti human LMX1a antibody	Millipore	AB10533	1/1,000 dilution
Rabbit anti human TH antibody	Pel Freez	P40101	1/500 dilution
Chicken anti human TH antibody	Millipore	AB9702	1/500 dilution
Mouse anti human TUJ1 antibody	Covance	MMS-435P	1/,2000 dilution
Rabbit anti human GIRK2 antibody	Abcam	ab30738	1/300 dilution
Rabbit anti human Calbindin antibody	Abcam	ab25085	1/400 dilution
Centrifuge	Eppendorf	5804