Fluoreszenz-Imaging mit One-Nanometer-Genauigkeit (FIONA)

Zusammenfassung

Einzel Fluorophore mit Nanometer-Präzision mit FIONA lokalisiert werden. Hier eine Zusammenfassung der FIONA-Technik wird berichtet, und wie die Durchführung FIONA Experimente beschrieben.

Zusammenfassung

Fluoreszenz-Imaging mit ein-Nanometer-Genauigkeit (FIONA) ist eine einfache, aber nützliche Technik zur Lokalisierung von einzelnen Fluorophore mit Nanometer-Präzision in der xy-Ebene. Hier eine Zusammenfassung der FIONA Technik wird berichtet, und Beispiele der Forschung, die durchgeführt wurde unter Verwendung Fiona kurz beschrieben. Erstens, wie man für FIONA Experimente, dh ein Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM), mit Details über die Ausrichtung der Optik setzen die erforderliche Ausrüstung, beschrieben. Dann, wie man auf die Lokalisierung immobilisiert Cy3-DNA einzelner Moleküle mit geeigneten Protokollen, gefolgt von der Nutzung von FIONA um die 36 nm Schrittweite von einer einzigen abgeschnitten Myosin Va Motor mit einem Quantenpunkt markiert messen Durchführung einer einfachen FIONA Experiment veranschaulicht. Schließlich jüngsten Bemühungen um die Anwendung FIONA zu dicken Proben erstrecken wird berichtet. Es wird gezeigt, dass mit einem Wasserimmersionsobjektiv und Quantenpunkte getränkt tief in Sol-Gele und Kaninchenauge Hornhäute (>200 um) Lokalisierungsgenauigkeit von 2-3 nm erreicht werden.

Einleitung

Rund 1882 Ernst Abbe festgestellt, dass die Auflösung eines Lichtmikroskops sichtbar ist ~ λ / 2NA oder ~ 200 nm (wo λ die Wellenlänge und NA die numerische Apertur) ^1,2. Daher würde jedes Objekt kleiner als diese Dimension als beugungsbegrenzten Fleck in einem optischen Mikroskop erscheinen. Jedoch ist es möglich, die Mitte des Flecks, das heißt, die Position des Objekts zu bestimmen, mit einer viel höheren Präzision ^3. Fluoreszenz-Imaging mit ein-Nanometer-Genauigkeit (FIONA) ist eine einfache, aber nützliche Technik zur Lokalisierung von einzelnen Fluorophore mit Nanometer-Präzision in der xy-Ebene ^4. Die Genauigkeit der Lokalisier....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

Ethik-Erklärung: Die Hornhaut Gewebe von Kaninchen wurde in Übereinstimmung mit der Universität von Illinois Institutional Animal Care und Verwenden Richtlinien gesammelt.

1. TIRFM-Setup

HINWEIS: Tragen Laser-Schutzbrille die ganze Zeit.

1. Stellen Sie sicher, dass alle in der Liste der Materialien aufgeführt notwendigen optischen Komponenten sind verfügbar und bereit für die Ausrichtung. Falls erforderlich, verwenden Ersatz mit gleichwertigen Funktionen von anderen Unternehmen. Stellen Sie sicher, dass Spiegel und Linsen sollten Antireflexbeschichtungen (AR) passend zum Laser im Einsatz haben.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Ein typisches Ziel-Typ TIRFM Aufbau ist in Abbildung 3 dargestellt. Zuerst wurde auf der Oberfläche immobilisierten Cy3-DNA Probe abgebildet. Ein typisches Bild ist in 4a gezeigt. Das Bild wurde mit 0,5 Sekunden Belichtungszeit aufgenommen, mit EM Verstärkung = 50 und CCD-Empfindlichkeit = 12.13 für die Kamera. Die Punktbild-Funktion (PSF) eines Cy3-DNA-Molekül ist in 4b dargestellt (von der durch den Pfeil in Figur 4a angedeutet Stelle), wo die Far.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

FIONA ist eine Technik, um die Position eines optischen Emitter (organisches Fluorophor oder Quantenpunkt) mit Nanometer-Präzision und zeitlichen Auflösung von bis zu 1 ms ^{4 bis 8} zu lokalisieren. Wenn genügend Photonen gesammelt werden, ermöglicht diese Technik, um die Position einer fluoreszierenden Emitter viel genauer als die Beugungsgrenze (~ 200 nm) zu bestimmen und somit dieses Verfahren eröffnet eine Möglichkeit, um zu beobachten, was mit herkömmlichen / traditionelle optische Mikroskopie ^.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Double-sided tape	3M		~75 µm thick
EMCCD camera	Andor Technology	DU-897E-CS0-#BV
Ultrasonic cleaner	Branson	2510
Fluorescence filter set	Chroma	49016
Actin polymerization buffer	Cytoskeleton	BSA02
Biotin G-actin	Cytoskeleton	AB07
G-actin	Cytoskeleton	AKL95
General actin buffer	Cytoskeleton	BSA01
Laser shutter (with driver)	Electro-Optical Products Corp.	SH-10-MP
IDL	Exelis Visual Information Solutions
Neutravidin	Fisher Scientific	PI-31000
Coverslip	Fisherbrand	22X30-1.5	0.16-0.19 mm thick
Microscope slide	Gold Seal Microslides	30103X1	0.93-1.05 mm thick
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001
Glass bottom dish	In Vitro Scientific	D35-20-1.5-N
Cy3-DNA oligos	Integrated DNA Technologies		5'-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3'Bio
Fluorescent beads	Invitrogen	T-7280
Qdot 605-streptavidin	Invitrogen	Q10101MP
Qdot605	Invitrogen	Q21301MP
Qdot705	Invitrogen	Q22021MP
Qdot705 Antibody Conjugation Kit	Invitrogen	Q22061MP
MATLAB	MathWorks
Optical table	Newport Corp		RS4000 Series
60X Objective	Nikon	Plan Apo VC 60x WI
100X Objective	Olympus	PlanApo 100X/1.45 Oil ∞/0.17
60X Objective	Olympus	UPlanApo 60X/1.20W
Inverted microscope	Olympus	IX71/IX70/IX81
Origin	OriginLab
Anti-FLAG antibody	Sigma Aldrich	F7425-.2MG
ATP	Sigma Aldrich	A7699
BME	Sigma Aldrich	63689-25ML-F
BSA	Sigma Aldrich	A7906
BSA-biotin	Sigma Aldrich	A8549-10MG
CK	Sigma Aldrich	C3755	Creatine Phosphokinase from rabbit muscle
CP	Sigma Aldrich	P1937	Phosphocreatine di(tris) salt
DTT	Sigma Aldrich	43815	DL-Dithiothreitol
EGTA	Sigma Aldrich	E3889	Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid
HCl	Sigma Aldrich	93363-500G
HEPES	Sigma Aldrich	H0887
KCl	Sigma Aldrich	P9333
MgCl2	Sigma Aldrich	M1028
NaCl	Sigma Aldrich	S7653
PCA	Sigma Aldrich	03930590	Protocatechuic acid
PCD	Sigma Aldrich	P8279	Protocatechuate-3,4-dioxygenase
TMOS	Sigma Aldrich	341436-25G	Tetramethyl orthosilicate
Tris-HCl	Sigma Aldrich	93363
Trolox	Sigma Aldrich	238813	6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid
1” diameter broadband dielectric mirrors with mounts	Thorlabs	BB1-E02, KM100	Quantity: 2
½” diameter posts	Thorlabs	TR4	Quantity ≥ 6
10X beam expander	Thorlabs	BE10M-A
2” diameter f = 300 mm lens with mount	Thorlabs	LA1256-A, LMR2	TIR lens
Fluorescent alignment target	Thorlabs	VRC2SM1
Laser safety goggles	Thorlabs	LG3
ND filter(s)	Thorlabs	FW1AND
Optical beam profiler	Thorlabs	BP209-VIS
Post-mounted iris diaphragm	Thorlabs	ID25	Quantity: 2
Shearing interferometer	Thorlabs	SI100
XYZ translation stage, ½” travel	Thorlabs	T12XYZ
Laser	World Star Technologies	TECGL-30	532 nm, 30 mW