Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

Zusammenfassung

Weg zur Rationalisierung der Screening für die Expression des rekombinanten Membranproteine ​​in Escherichia coli, basierend auf Fusions grün fluoreszierendes Protein dargestellt.

Zusammenfassung

Die Produktion von rekombinanten Membranproteine ​​für strukturelle und funktionelle Studien bleibt technisch anspruchsvolle aufgrund der niedrigen Expressionsniveaus und der inhärenten Instabilität vieler Membranproteine ​​einmal in Reinigungsmitteln gelöst. Ein Protokoll wird beschrieben, daß nach Ligierung unabhängiges Klonen von Membranproteinen als GFP-Fusionen mit Expression in Escherichia coli durch GFP-Fluoreszenz nachgewiesen verbindet. Dies ermöglicht die Konstruktion und Expression Screening mehrerer Membranprotein / Varianten, Kandidaten für weitere Investitionen an Zeit und Mühe zu identifizieren. Die GFP-Reporter wird in einem primären Screening der Expression durch Visualisierung GFP-Fluoreszenz nach SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) verwendet. Membranproteine, wie durch das Fehlen von freien GFP angegeben sowohl eine hohe Expressionsniveau mit minimalem Abbau zeigen, einen zweiten Bildschirm ausgewählt. Diese Konstrukte werden skaliert und einem Gesamtmembranfraktion hergestellt und löslich zu machend in vier verschiedenen Reinigungsmitteln. Nach Ultrazentrifugation Waschmittel unlösliches Material zu entfernen, werden Lysaten durch Fluoreszenzdetektion Größenausschlusschromatographie (FSEC) analysiert. Die Überwachung der Größenausschluss-Profil von GFP-Fluoreszenz liefert Informationen über die Monodispersionsgrad und die Integrität der Membranproteine ​​in verschiedenen Reinigungsmitteln. Protein: Waschmittelkombinationen, die mit einem symmetrischen Peak mit wenig oder kein freies GFP und minimale Aggregation eluieren sind Kandidaten für die nachfolgende Reinigung. Unter Verwendung der obigen Methode, die heterologe Expression in E. coli der SED (Form, Dehnung, Division und Sporenbildung) Proteine ​​aus 47 verschiedenen Arten von Bakterien untersucht. Diese Proteine ​​haben in der Regel zehn Transmembrandomänen und sind für die Zellteilung. Die Ergebnisse zeigen, dass die Herstellung der SEDs Orthologe in E. coli war sehr variabel in Bezug auf die Expressionsniveaus und der Integrität der GFP-Fusionsproteine. Das Experiment identified eine Teilmenge zur weiteren Untersuchung.

Einleitung

Es wurde geschätzt, dass die Membranproteine ​​machen etwa 20-30% der Gene in allen sequenzierten Genomen ^1, einschließlich des menschlichen Genoms ² codiert. Aufgrund ihrer kritischen Rolle in vielen biologischen Prozessen, beispielsweise Transport von Metaboliten, die Energieerzeugung und als Arzneimitteltargets besteht großes Interesse an der Bestimmung ihrer dreidimensionalen Struktur. Doch im Vergleich zu löslichen Proteine ​​sind Membranproteine ​​stark unterrepräsentiert in der Proteindatenbank. In der Tat, der 99.624 freigegebenen Strukturen in der PDB ( http://www.rcsb.org/pdb/ ) nur 471 ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) als Membranproteine ​​eingestuft. Dies entspricht den technischen Schwierigkeiten bei der Arbeit mit Membranproteinen, die von Natur aus bei relativ niedrigen Niveaus exprimiert werden; Rhodopsin ist eine der wenigen Ausnahmen ^3,4. Überexpression von rekombinanter Versions in heterologen Zellen führt oft zu Fehlfaltung und schlechte Ausrichtung auf die Membran, die das Gesamtniveau der Produktion begrenzt. Die Auswahl der besten Reinigungsmittel für die Extraktion und Solubilisierung eines Membranproteins einmal ausgedrückt macht anschließende Reinigung schwierig und erfordert eine sorgfältige Optimierung.

Escherichia coli bleibt das am häufigsten verwendete Expressionswirt für Membranproteine ​​Anteil von 72% ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) von Strukturen bisher fast ausschließlich aus Bakterienquellen sind gelöst. Spezifische E. coli-Stämme, C41 (DE3) und C43 (DE3), wurden isoliert, die nicht auf die Überexpression von Membran Proteins führen und somit die Auswirkungen der Toxizität für andere Stämme BL21 beobachtet ^5,6 zu vermeiden. Tuning das Niveau der rekombinanten Membranproteinexpression scheint entscheidend für die Optimierung der Produktionsniveau ^6,7 sein.

Vielfach erfolgreiche Herstellung von Membranproteinen zur Strukturbestimmung hat die Auswertung von mehreren Versionen einschließlich Amino- und Carboxy-terminalen Deletionen, mehrfache Orthologe natürlichen Sequenzvariation und verschiedene Fusionsproteine ^​​6-8 auszunutzen erforderlich. Daher ist ein Verfahren zur Expression Untersuchung von zahlreichen Membranproteinen parallel wesentlich. Eine üblicherweise verwendete Ansatz besteht darin, das Protein das grün fluoreszierende Protein (GFP) ermöglicht Ausdruck zu verschmelzen, ohne die Notwendigkeit, das Protein zu reinigen, verfolgt werden. Auf diese Weise können Informationen über die Expressionsstärke, Stabilität und Verhalten in verschiedenen Waschmitteln mit geringen Mengen an nicht-gereinigte Material ^9-12 bewerten.

In diesem Artikel wird eine optimierte Protokoll für Klonierungs- und Expressions-Screening von Membranproteinen in E. beschreiben wir coli mittels Fusion mit GFP als Reporter der Produktion und die anschließende Charakterisierung der Reinigungsmittel: Protein-Datei herunterladenLexes (Abbildung 1).

Protokoll

1. Konstruktion von Expressionsvektoren

1. Verwenden PCR Infusion Klonen parallel mit den Vektoren pOPINE-3C-GFP und popin-N-GFP, die entweder spaltbare C-terminalen oder N-terminalen GFP-His6 Fusionen zu den Sequenzen ¹³ bzw. in den zu 96 Expressionsplasmide konstruieren up.
   Anmerkung: Die Wahl des Vektors wird durch die Topologie des Proteins diktiert, da die GFP muss im Cytosol exprimiert werden, wodurch die für ein Protein mit einer zytosolischen N-Terminus und C-Terminus der extrazellulären wir POPIN-N-GFP und verwenden würden einer extrazellulären N-Terminus und C-Terminus cytosolischen in wir pOPINE-3C-GFP verwenden würden. Wo beide Enden sind cytosolische wir pOPINE-3C-GFP verwenden würde, es sei denn funktionellen Gründen nicht auf den C-Terminus zu markieren.
2. Verstärken die DNA-Sequenzen, die Membranproteine ​​mit Primern unter Einbeziehung folgender gezeigt Erweiterungen Codierung:
   pOPINE-3C-GFP (Forward Primer - AGGAGATATACCATG; Rückwärtsprimer - CAGAACTTCCAGTTT) und popin-N-GFP (Vorwärtsprimer - AAGTTCTGTTTCAGGGCCCG; Rückwärtsprimer - ATGGTCTAGAAAGCTTTA).
3. Analyse der PCR-Reaktion durch Agarose-Gelelektrophorese. Einmal sauber PCR-Produkte erhalten wurden, fügen Sie 5 U DpnI in jede Vertiefung (Make-up in 5 ul 1x DpnI Reaktionspuffer). Aufreinigung der PCR-Produkte unter Verwendung von magnetischen Kügelchen in eine 96-Well-Format.
   Hinweis: DpnI hinzugefügt, um die Vorlage Vektor zu entfernen; Dieser Schritt ist nicht notwendig, wenn genomische DNA als Matrize verwendet.
4. 1 ul (100 ng) des geeigneten linearisierten Vektor an jede Vertiefung einer PCR-Platte.
5. Mit einer Mehrkanalpipette Add x ul des gereinigten PCR-einfügen in die entsprechenden Vertiefungen des PCR-Platte. Stellen Sie sicher, dass alle Produkte im Bereich von 10 bis 250 ng.
6. Hinzufügen (9-x) & mgr; l Wasser zu dem gut und übertragen die gesamte 10 ul zu einem Röhrchen, das die Austrocknungs in-Fusions Reagenz. Lassen Sie für 30 Sekunden.
7. Mischen Sie Inhalte kurz durch Auf- und Abpipettieren. Transferdie Reaktionen wieder auf den ursprünglichen PCR-Platte und Dichtung.
8. Inkubieren für 30 min bei 42 ° C in einem Thermocycler.
9. Die Reaktionen auf Eis sofort übertragen, sobald die Reaktion vollständig ist, und fügen Sie 40 ul TE (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA).
10. Frieren Sie auf einmal oder zu transformieren in kompetente Zellen. Für die Transformation verwenden 3 ul der verdünnten Reaktions pro 50 ul-Aliquot hohe Kompetenz (> 5 x 10 ⁹ Transformanten / ug) kompetente E. coli-Zellen.
11. 1 ml LB-Agar mit 50 ug / ml Carbenicillin pro Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte ergänzt (für das Klonen, bereiten Brunnen für 2 x Anzahl der Konstrukte).
12. Nach Auswachsen, Nach-Auswuchs Platte aus 25 ul und 25 ul einer 1: 5 Verdünnung der Kultur auf dem Agar-24-Well-Gewebekulturplatten.
13. Verbreiten Sie die Zellen durch leichtes Kippen der Platte.
14. Die Platte mit dem Deckel off für 10-15 Minuten bei 37 ° C oder in einem flow Abzug bei Raumtemperatur.
15. Setzen Sie den Deckel und drehen Sie die Platte auf den Kopf und Inkubation über Nacht bei 37 ° C.
16. Wählen Sie zwei Kolonien und Mini-Prep die Vektoren.
17. PCR überprüfen Sie die Konstrukte mit dem Konstrukt spezifische Reverse-Primer und einen Vektor spezifischen Vorwärtsprimer (zB pOPIN_FOR GAC CGA AAT TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG).

2. Transformation von E. E-coli-Stämme xpression

Anmerkung: Vor der Durchführung dieses Protokolls E. coli-kompetente Zellen werden hergestellt, aliquotiert und bei -80 ° C eingefroren, wie zuvor beschrieben ^13. Membran-Protein-Expression wird routinemäßig in zwei Stämme gescreent Lemo21 (DE3) und C41 (DE3) pLysS. Zur Interpretation der Ergebnisse helfen kann es hilfreich sein, eine positive Kontrolle, beispielsweise ein Plasmid, die GFP oder ein Membranprotein mit GFP fusioniert bekannt zu äußern und einen leeren Vektor Negativkontrolle einzubeziehen.

1. Auftauen aliquotted E. coli auf Eis. In 3 ul Mini vorbereitet Expressionsplasmid zu jedem Aliquot kompetenter Zellen.
2. Inkubieren Sie die Mischung auf Eis für 30 min.
3. Hitzeschock der Zellen für 30 Sekunden bei 42 ° C.
4. Sodass die Zellen auf Eis für 2 Minuten zu erholen, und dann werden 300 ul Kraftbrühe in jedes Röhrchen.
5. Inkubieren für 1 Stunde in einem 37 ° C statischen Inkubator.
6. Vorbereiten des LB-Agar in einer 24-Well-Gewebekulturplatte mit 50 ug / ml Carbenicillin und 35 ug / ml Chloramphenicol ergänzt. Hinzufügen Rhamnose zu einer Endkonzentration von 0,25 mM zu den Vertiefungen, die Lemo21 (DE3).
   Hinweis: Wenn das Produkt wahrscheinlich toxisch die Vertiefungen mit C41 zu sein (DE3) pLysS mit 1% (w / v) Glucose ergänzt werden.
7. Transfer 30 ul Zellen aus dem Transformationsgemisch auf LB-Agar-Platten. Verbreiten Sie und trocknen Sie die Platte nach 1,13-1,15 beschrieben.

3. Herstellung der Übernachtung Starterkulturen

Hinweis: Immer Übernachtkulturen nach der Transformation noch nie von einem alten Transformationsplatte bereiten den Tag.

1. Hinzufügen von 0,7 ml Netz Brühe in jede Vertiefung einer 96-well Deepwell-Platte mit 50 ug / ml Carbenicillin und 35 ug / ml Chloramphenicol ergänzt. Hinzufügen Rhamnose in die Vertiefungen enthaltenden Lemo21 (DE3) bis zu einer Endkonzentration von 0,25 mM. Optional ergänzen C41 (DE3) pLysS mit 1% (w / v) Glucose; siehe oben (2.6) verbindlich.
2. Wählen Sie eine Kolonie von den über Nacht Transformationsplatten in jede Vertiefung. Verschließen Sie den Block mit einem gasdurchlässigen Dichtung.
3. Rütteln des Blocks bei 250 Upm in einem Inkubator mit einer großen Wurf (zB ein 25 mm Umlaufbahn) oder mit 600 Upm in einem Inkubator mit einer geringen Schwingbewegung (zB 4,3 mm Bahn) bei 37 ° C über Nacht.

4. Wachstum und Induktion der Kulturen

1. 3 ml Kraftbrühe mit 50 ug / ml Carbenicillin und 35 ug / ml Chloramphenicol zu jedem w ergänztell der 24-Loch-Deepwell-Platte. In L-Rhamnose (und Traubenzucker), wie in Abschnitt 3.1 beschrieben. Verwenden Sie 3 ml Kultur bis zur Ernte in zweifacher Ausfertigung zu ermöglichen und für einige Verdunstung von Wasser durch die gasdurchlässige Dichtung zu ermöglichen.
2. Bis die Expressionskulturen durch Zugabe von 150 ul Lemo21 (DE3) oder C41 (DE3) pLysS Übernachtkulturen in jede Vertiefung der 24-Loch-Deep-Well Blöcke gesetzt.
3. Schütteln Sie die Blöcke bei 37 ° C, bis die mittlere OD bei 595 nm ist ~ 0,5 durch die Platte.
4. Induzieren die Expression durch Zugabe von IPTG zu den Kulturen bis zu einer Endkonzentration von 1,0 mM IPTG.
5. Wachsen die Kulturen über Nacht (18-20 Stunden) bei 20 ° C schüttelnd.

5. Analyse der Expression von In-Gel-Fluoreszenz

1. Ernte in zweifacher Ausfertigung. 1 ml der Kultur aus jeder Vertiefung in ein Quadrat gut, konischer Boden, 96-Loch-Deep-Well-Block.
   Hinweis: Ernte in zweifacher Ausfertigung bei Bruch des Blocks oder die Erprobung eines alternati ermöglichenve Reinigungsmittel, falls gewünscht.
2. Abdichten der Blöcke und Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 6.000 × g für 10 min.
3. Kehren Sie die Block und dekantiert die Medien. Tippen Sie auf den Block vorsichtig auf ein Papiertuch, Stoffreste abtropfen lassen.
4. Dichten Sie die Platten und bei -80 ° C für mindestens 20 min. Wahlweise lassen das Experiment an dieser Stelle und das verarbeitete wenn bequem Block.
5. De-Frost die Pellets für 20 min bei Raumtemperatur.
6. Entweder eine Mehrkanalpipette oder eines Orbitalschüttler (1.000 Upm für 10 min) bei 4 ° C, um die Zellen vollständig in 200 ul Lysepuffer (50 mM NaH ₂ PO _4, 300 mM NaCl 10 mM Imidazol 1% v resuspendieren / v Tween 20, des pH auf 8,0 unter Verwendung von NaOH einzustellen).
7. Mit 20 ul der DLPI Lösung (20 & mgr; l DNase I (4.000 Einheiten / ml), 20 mg Lysozym und 20 & mgr; l Protease-Inhibitor-Cocktail in einem Endvolumen von 2 ml Wasser). Inkubieren für 10 min unter Schütteln (~ 1000 rpm) bei 4 ° C.
8. Hinzufügen von 25 ul 10% n-Dodecyl-β-D-maltosid (DDM).
9. Inkubieren für 60 min unter Schütteln (~ 1000 rpm) bei 4 ° C.
10. Zentrifuge die Tief-Well-Block mit 6000 xg für 30 min bei 4 ° C.
11. Transfer 10 ul des geklärten Lysats, um eine Mikrotiterplatte und gibt 10 ul SDS-PAGE-Gel-Ladepuffer (100 mM Tris, pH 6.8, 4% w / v SDS, 0,2% w / v Bromphenol blau, 10% v / v β -Mercaptoethanol und 20% v / v Glycerol). VORSICHT! Nicht kochen die Probe.
12. Last 10 ul Probe aus Schritt 5.11 / Vertiefung auf SDS PAGE-Gel (e) und führen bei 100-120 V (konstante Spannung) in einen kalten Raum bis die Farbstoff-Front den Boden (2-2,5 h) erreicht.
13. Legen Sie das Gel auf einem Bildwandler (zB mit einem Blaulicht-Filter, um die GFP-Fusionsproteine ​​zu erkennen). Die Belichtungszeit wird so gewählt, dass die hellsten Bänder nicht gesättigt.

6. Scale-up von Zellkulturen

1. Verwandeln Sie ein Aliquot zuständigen E. coli, wie in Kapitel 2 beschrieben.
2. Wählen Sie eine Kolonie in 10 ml Kraftbrühe (ergänzt, wie in Kapitel 3 beschrieben) und über Nacht wachsen bei 37 ° C.
3. 5 ml der Übernacht-Kultur in 500 ml Kraftbrühe.
4. Wachsen unter Schütteln bei 250 Upm bei 37 ° C, bis die OD bei 595 nm von ~ 0,5.
5. Induzieren die Expression durch Zugabe von IPTG bis zu einer Endkonzentration von 1,0 mM.
6. Wachsen über Nacht unter Schütteln bei 250 Upm bei 20 ° C.
7. Ernten der Zellen durch Zentrifugation bei 5.000 xg für 15 min.
8. Überstand verwerfen. Zellpellets bei -80 ° C gelagert werden.

7. Herstellung von Membranen

1. Tau-Zellen (falls nötig) bei Raumtemperatur und resuspendieren in 1x PBS, pH 7,5, in einem Volumen von 5 ml pro Gramm Zellpellet; Lautstärke erhöhen wie nötig, bis die Viskosität reduziert, um eine laufende Konsistenz. Hinzufügen MgCl ₂ bis zu einer Endkonzentration von 1 mM, DNAse I bis zu einer Endkonzentration von 10 ug / ml und einemabgepackte Proteaseinhibitor Tablette pro 20 g Zellpellet. Brechen Sie Zellen unter Verwendung eines gekühlten Zelle Disruptor bei einem Druck von 30 kpsi.
2. Pellet die nicht aufgebrochenen Zellen und Trümmer bei 30.000 g für 15 min bei 4 ° C. Überstand in einem Ultrazentrifugenröhrchen.
3. Sammeln Sie den gesamten Membranfraktion durch Abzentrifugieren des Überstandes in einer Ultrazentrifuge bei 200,000 × g für 1 h bei 4 ° C.
4. Überstand verwerfen.
5. Re-suspend die Membran Pellet in eiskaltem 10 ml PBS, pH 7,5, mit einem Zell Homogenisator. Für jedes Reinigungsmittel werden 1 ml resuspendiert Membranen erforderlich. Optional kann in diesem Stadium, Flash Einfrieren der Membransuspension in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C.

8. Solubilisierung und Analyse der Membranfraktion

1. Tau-Membranfraktion (falls erforderlich), und für jede Reinigungsmittel für die Solubilisierung verwendet werden aliquote 900 ul der Membransuspension in ein 1,5 ml Polyallomer-Mikro centrifuge Rohr.
2. Füge 100 ul jeder frisch hergestellten Waschmittel (10% w / v Lösung von DDM, DM, Cymal-6 und LDAO) zu einer Endkonzentration von 1% zu der angegebenen 1,5-ml-Röhrchen. Zur Solubilisierung der eukaryontischen Membranproteine ​​Cholesterinhemisuccinat (0,2% Endkonzentration) kann den Waschmitteln zugesetzt werden.
3. Die Gemische Inkubieren bei 4 ° C für 1 Stunde unter leichtem Schütteln.
4. Pellewaschmittel unlöslichen Fraktion mit einer Tischultrazentrifuge, wodurch Rohre mindestens halb voll, bei 150000 g bei 4 ° C für 45 min und der Überstand behalten.
   Anmerkung: Die Wirksamkeit der Waschmittel Solubilisierung unter Verwendung eines Fluoreszenz-Plattenlesegerät durch Messen der GFP-Fluoreszenz der solubilisierten Membranen mit dem Waschmittel unlöslichen Fraktion in dem gleichen Volumen von PBS resuspendiert abschätzen.
5. Analyse der Monodispersionsgrad der verschiedenen Waschmittel: Membranproteinkomplexen unter Verwendung von Fluoreszenz-erfassten Größenausschlusschromatographie (FSEC).
6. Für FSEC Analyse äquilibrieren eine Grßenausschlusssäule mit breiter Fraktionierungsbereich, zB 5.000 bis 5.000.000 Molekulargewicht, mit Laufpuffer (20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,03% DDM) bei einer Flussrate von 0,3 ml / min . Verwenden dieses Puffers für alle Proben, dh es ist nicht für jeden getesteten Waschmittel verändert.
7. Injizieren 100 ul solubilisierter Membranen auf die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,3 ml / min. Überwachen Elutionsprofil mit Fluoreszenzoptik (Anregung bei 488 nm und Emission bei 512 nm). Wenn ein Inline-Fluoreszenz-Monitor nicht verfügbar ist, sammeln die Fraktionen und lesen Sie die Fluoreszenz in einem Plattenlesegerät.
8. Import Elutionsvolumen und die Fluoreszenzintensität von Daten in ein Tabellenkalkulationsprogramm zur grafischen Darstellung.
9. Analyse verbleibenden solubilisierten Membranmaterial durch in-Gel-Fluoreszenz, wie in Abschnitt 5 beschrieben.

Ergebnisse

Das SEDS-Proteinfamilie (Form, Dehnung, Division und Sporenbildung) ist von wesentlicher Bedeutung für die bakterielle Zellteilung. Diese integralen Proteine ​​haben typischerweise zehn Transmembrandomänen mit beiden Amino- und Carboxy-Termini in der Zelle. Um das oben beschriebene Protokoll zu illustrieren, wurden 47 SEDs Orthologe in den Vektor pOPINE-3C-eGFP kloniert. Eine kleine Stufendarstellung Bildschirm der Konstrukte wurde in zwei E .coli Stämmen durchgeführt, Lemo21 (DE3) in Gegenwart von 0,25 mM gezüchtet Rhamnose undichte Expression und C41 (DE3) pLysS, das routinemäßig für die Expression von Membran verwendet werden, zu blockieren Proteine ^​​8.5.

Detergens solubilisiert Lysaten von induzierten Kulturen wurden durch SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese analysiert. Unter Verwendung von in-Gel-Fluoreszenz zu visualisieren GFP exprimierten Fusionsproteine ​​zeigten, daß zwischen den beiden Stämmen 38 aus den 47 SEDs Konstrukte hergestellt wurden. Interessanterweise gibt es Unterschiede zwischen den beiden Expressionsstämmen. Von den 38 zum Ausdruck Konstrukte wurden nur 18 in beiden Stämmen, 14 in Lemo21 (DE3) und 6 nur in C41 (DE3) pLysS nur ausgedrückt produziert. Insgesamt gab es eine höhere Erfolgsrate für die Lemo21 (DE3), verglichen mit dem C41 (DE3) pLysS (38 vs. 24). Allerdings ist die Beobachtung, dass einige Proteine ​​schien Stamm genau zu sein bedeutet, dass das Screening sowohl sinnvoll ist.

Repräsentative Daten für 24 von den 47 SEDs Konstrukte sind in Abbildung 1 dargestellt. Die Intensität der Banden geben einen Hinweis auf das Ausmaß der Expression, beispielsweise das Fusionsprotein in und C4 in Figur 1A und 1B ist in beiden Stämmen sind jedoch die zusätzlichen exprimiert Untermolekularen Banden nahe, dass das Protein teilweise abgebaut. In vielen Gassen gibt es eine Band, die in Größe allein entspricht GFP. Eine qualitative Bewertung der Integrität des Proteins kann, indem man die Intensität des Fusionsproteins gegenüber dem freien GFP durchgeführt werden;zB G4 und H4 sind komplett auf freie GFP in C41 (DE3) pLysS (1B), während in der Lemo21 (DE3) gebrochen es einige intakte Protein (Abbildung 1A). 14 der 38 exprimierten Proteine ​​die Intensität des freien GFP Band ist ähnlich der des Fusionsproteins, 21 die Intensität des freien GFP Band größer ist als die des Fusionsproteins und einer Minderheit der Fusionsproteine ​​(3 / 38 ausgedrückt) zB F6 und G6 in 1A gegenüber dem Fusionsprotein haben relativ wenig freies GFP.

Zwei der Konstrukte, die auch in den primären Screen B5 (Hochintensitätsbändern kostenlos GFP und Fusionsproteine) und G6 (wenig freies GFP) exprimiert wurden und eine Gesamtmembranfraktion aus 500 ml Zellkultur hergestellt ausgedrückt. Resuspendierten Membranen in Aliquote aufgeteilt und durch Fluoreszenz-erfassten Größenausschlusschromatographie (FSEC) analysiert. Die FSEC Profile sind in Figur präsentiertE 2A und 2B und zeigen, dass die beiden SEDs Proteine ​​in den vier untersuchten Reinigungsmittel verhalten sich anders. In einem Fall (Abbildung 2A: Probe B5) das Protein nur ergab ein symmetrischer Peak mit wenig Aggregation im DDM die daher das Reinigungsmittel der Wahl für die anschließende Reinigung wäre. Im Gegensatz dazu der andere Fusionsprotein (2B: Probe G6) hat ein ähnliches Profil in allen getesteten Waschmitteln.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der Arbeitsabläufe für das Screening von Membranproteinexpression in E. coli mit einem GFP-Reporter.

Abbildung 2: Primäre Bildschirm von Membranproteinexpression mittels in-Gel-Fluoreszenz. Reinigungsmittel Lysaten von E. coli-Zellen wurden durch SDS-PAGE analysiert und die Gele aufgenommen mit Blau Epi-Beleuchtung und einen 530/28 Filter. Die Ergebnisse sind für 24-Konstrukte (bezeichnet A4-H6 basierend auf ihrer Lage in einer 96-Well-Platte) gezeigt. Die Positionen der Banden für freies GFP und GFP-Fusionsproteine ​​(A) Proteine ​​in Lemo21 (DE3). (B) Proteine ​​in C41 (DE3) pLysS exprimiert angegeben..

Fig. 3: ein zweites Display Membranprotein-Expression unter Verwendung von Fluoreszenz-erfassten Größenausschlusschromatographie (FSEC) Gesamtmembran-Fraktionen wurden in vier verschiedenen Detergentien extrahiert und die solubilisierte Membranproteine ​​analysiert durch Grßenausschlußchromatographie unter Verwendung eines FPLC-Systems zu einem Fluoreszenzdetektor gekoppelt ist. FSEC Profile für (A) Membranprotein B5 und (B) Membranprotein G6. Die Position der Peaks, die aggregierte Protein solubilisierten GFP-Fusionsprotein und freie GFP sind angegeben. Die getesteten Detergenzien unter den Profilen angedeutet.

Diskussion

Bei der in diesem Artikel beschriebenen Protokoll wird Ligierung unabhängigen Klonen in einen GFP-Reporter-Vektor mit Fluoreszenzdetektion kombiniert, um schnellen Screening der relativen Expression mehrerer Membranproteine ​​in E. coli. Vektoren können in vier Arbeitstagen mit primären Ausdruck Screening unter eine weitere Woche durchgeführt werden. In-Gel-Fluoreszenz Detergenslysate ganzer Zellen wird verwendet, um Rang Ausdruck trifft zur weiteren Analyse in einem sekundären Bildschirm. Der primäre Ausdruck Bildschirm präsentiert keine spezielle Ausrüstung abgesehen von einem Schüttelinkubator für wachsende Zellen in tiefen Brunnen Bausteine ​​benötigen. Alle anderen Flüssigkeitshandhabungs mit 96 Vertiefungen SBS Platten kann unter Verwendung von Mehrkanalpipetten erfolgen. Das Protokoll kann leicht modifiziert werden, um andere E. coli-Stämme unter verschiedenen Expressionsbedingungen (zB niedrigere Temperatur) angebaut sind. In dem Fall des LEMO21 (DE3) Titrieren der Ebene von Rhamnose (0 bis 2,0 mM)zugegeben, um die Rate der Transkription modulieren, kann die Höhe der Expression einiger Membranproteinen ⁷ erhöhen. Außer DDM Waschmittel könnten für die Extraktion in der primären Bildschirm verwendet wenn härtere Waschmittel können Proteine ​​aus Einschlusskörper löslich und somit liefern falsche Positivmeldungen werden. Es ist klar, desto umfangreicher der Startbildschirm wird, desto mehr Zeit in Anspruch, das Experiment.

Der sekundäre Bildschirm ist die Vorbereitung einer Gesamtmembranfraktion aus den Expressions Treffer im primären Screening identifiziert. Dies ist ein entscheidender Schritt, da sie die Lokalisierung des Fusionsproteine ​​an der Membran des E. bestätigen coli-Zellen. Nachfolgende Extraktion der GFP-Fusionsproteins in verschiedenen Waschmitteln durch fluoreszenz detektiert Grßenausschlußchromatographie solubilisiertes Material überwacht, um das mono-Dispersität der Waschmittel-Protein-Komplexe zu beurteilen. Dies ist ein weiterer wichtiger Schritt, da sie die am besten geeigneten Waschmittel für die identifiziertSolubilisierung des Membranproteins zur nachfolgenden Weiterverarbeitung. Die Erfahrung zeigt jedoch, daß eine weitere Optimierung der Wahl des Waschmittels (en) enthalten, während der Reinigung und Kristallisation erforderlich. Beweise einheitliches Verhalten in verschiedenen Waschmitteln einschließlich solcher mit einem relativ kleinen Micellen Größe (zB LDAO) scheint guter Indikator einer Neigung zur Bildung gut streuenden Kristallen mindestens für prokaryotische Membranproteine ^​​14 zu sein. In dieser Hinsicht scheint der für das Membranprotein in 2B dargestellte Profil sehr günstig.

Der Hauptvorteil der Verwendung eines GFP-Reporter ist, dass es eine schnelle Auslesung der Expression in nicht-gereinigten Proben. Ein Nachteil ist, dass das GFP-Fusionsprotein, die während der Reinigung des Proteins zur Kristallisation entfernt werden. Im Falle der hier verwendeten Vektoren, Rhinovirus 3C Protease eine Website ermöglicht die Spaltung der GFP. Alternativ dazu ist es einfachum Kandidatenproteine, in dem Bildschirm identifiziert-Klon wieder in Vektoren, die nur einen Polyhistidin oder andere Affinität Tag hinzuzufügen für anschließende Reinigung. Dies setzt voraus, dass die Fusion mit GFP ist nicht für die Expression erforderlich. Die wichtigste Alternative zur Verwendung von Fusions GFP zum Nachweis von Membranprotein-Expression und Solubilisierung ist, nur einen Histidin-Tag hinzuzufügen. Allerdings erfordert diese Vorgehensweise in der Regel beginnend mit einer Membranfraktion ^15, die für die Auswertung von vielen Varianten wäre sehr zeitaufwendig geworden.

Zusammenfassend ist der Hauptzweck des in diesem Artikel beschriebenen Protokoll zu ermöglichen, eine große Anzahl von Membranproteinsequenzvarianten schnell im Ausdruck und Waschmittel Solubilisierung ausgewertet und für tiefere Analyse priorisiert werden.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
pOPIN-N-GFP	addgene (www.addgene.org)
pOPINE-3C-GFP	addgene (www.addgene.org)
C41(DE3)pLysS	Lucigen (http://lucigen.com/)	60444-1
LEMO21(DE3)	New England Biolabs	C2528H
In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns	Clontech/Takara	639688
Power broth	Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/)	MD12-106-1
Protease Inhibitor tablets	Roche	11697498001
cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836170001
L-Rhamnose monohydrate	Sigma-Aldrich	83650
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	P8849
DNAse 1	Sigma-Aldrich	DN25
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L7651
Cholesterol hemisuccinate	Sigma-Aldrich	C6512
CYMAL-6 (6-Cyclohexyl-1-Hexyl-β-D-Maltoside)	Anatrace	C326
DDM (n-Dodecyl β-maltoside)	Generon	D97002
DM (n-Decyl β-maltoside)	Generon	D99003
LDAO (N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide)	Generon	D71111
E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 µl	Thermo Scientific	4672030
Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1,200 µl LTS Spacer	Anachem	LA6-300XLS
Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20 µl LTS	Anachem	L8-20XLSPLUS
Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1,200 µl LTS Tip	Anachem	L8-1200XLS
24 well V bottom deep well blocks	Porvair sciences	360115
BenchMark Fluorescent Protein Standard	Life Technologies	LC5928
NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well	Life Technologies	WG1203BOX
XCell4 SureLock Midi-Cell	Life Technologies	WR0100
Vibramax 100	Heidolph	544-21200-00
Tension rollers attachment	Heidolph	549-81000-00
ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor	Beckman Coulter	393253
Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor	Beckman Coulter	393315
Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors	Beckman Coulter	B14535
Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector	Shimadzu
Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column	GE Healthcare	17-5172-01
SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 rpm	Shel Lab	SSI5R-HS
Innova44R incubator	New Brunswick /Eppendorf	Innova44R
TS Series 0.75 kW Disrupter 230 V 50 Hz 1 PH (40 kpsi)	Constant systems	PL083016
L-Rhamnose monohydrate	Sigma	83650