Verde Fluorescente à base de proteínas Expressão Rastreio de Proteínas de Membrana em<em&gt; Escherichia coli</em

Resumo

Uma abordagem simplificada para a triagem para a expressão de proteínas de membrana recombinantes em Escherichia coli com base na fusão de proteína fluorescente verde é apresentada.

Resumo

A produção de proteínas da membrana recombinante para estudos estruturais e funcionais permanece tecnicamente desafiador devido aos baixos níveis de expressão e da instabilidade inerente de muitas proteínas da membrana uma vez solubilizado em detergentes. Um protocolo é descrito que combina ligadura clonagem independente de proteínas de membrana na forma de fusões com expressão de GFP em Escherichia coli detectadas por fluorescência da GFP. Isso permite a construção e expressão de triagem de proteína de membrana múltipla / variantes para identificar candidatos adequados para posterior investimento de tempo e esforço. O repórter da GFP é utilizado em uma tela primária de expressão através da visualização da fluorescência de GFP após electroforese em gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE). As proteínas da membrana que exibem não só um elevado nível de expressão com degradação mínima, como indicado pela ausência da GFP livre, são seleccionados para um ecrã secundário. Estas construções são escalados e uma fracção total de membrana preparada e solubilizard em quatro detergentes diferentes. Após ultracentrifugação para remover o material insolúvel em detergente, os lisados ​​são analisados ​​por cromatografia de exclusão de tamanho de detecção de fluorescência (FSEC). Monitorização do perfil de exclusão de tamanho por fluorescência da GFP fornece informações sobre o mono-dispersibilidade e integridade das proteínas de membrana em diferentes detergentes. Proteína: combinações de detergentes que eluem com um pico simétrico com pouco ou nenhum acesso GFP e agregação mínimo são candidatos a purificação subseqüente. Utilizando a metodologia acima, a expressão heteróloga em E. coli de SED (forma, alongamento, divisão, e esporulação) proteínas de 47 espécies diferentes de bactérias foi analisada. Estas proteínas normalmente têm dez domínios transmembranares e são essenciais para a divisão celular. Os resultados mostram que a produção dos ortólogos SED em E. coli foi altamente variável em relação aos níveis de expressão e a integridade das proteínas de fusão de GFP. O i experimentodentified um subconjunto para uma investigação mais aprofundada.

Introdução

Estimou-se que as proteínas de membrana são responsáveis ​​por cerca de 20-30% dos genes codificados em todos os genomas sequenciados ^1, incluindo o genoma humano ^2. Dado o papel crucial em muitos processos biológicos, por exemplo, o transporte de metabolitos, a geração de energia e como alvos para fármacos, há um grande interesse na determinação da sua estrutura tridimensional. No entanto em comparação com proteínas solúveis, proteínas de membrana são muito sub-representadas no Protein Data Bank. De fato, dos 99.624 estruturas lançado no PDB ( http://www.rcsb.org/pdb/ ) apenas 471 ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) são classificadas como proteínas de membrana. Isso reflete as dificuldades técnicas de se trabalhar com as proteínas da membrana que são naturalmente expressos em níveis relativamente baixos; rodopsina é uma das poucas exceções ^3,4. A sobre-expressão da versão recombinantes em células heterólogas muitas vezes resulta em fraca enrolamento incorrecto e direccionamento para a membrana que limita o nível global de produção. Selecionando o melhor detergente para extração e solubilização de uma proteína da membrana uma vez expressou faz purificação posterior difícil e requer otimização cuidadosa.

Escherichia coli continua a ser o hospedeiro de expressão mais utilizada para as proteínas de membrana que representam 72% ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) de estruturas resolvido até ao presente que são quase exclusivamente a partir de fontes bacterianas. E. Specific estirpes de E. coli, C41 (DE3) e C43 (DE3), ter sido isolado, que não levam à expressão de proteínas através da membrana e, portanto, evitar os efeitos de toxicidade observados para a outra estirpes BL21 ^5,6. Ajustando o nível de expressão da proteína de membrana recombinante parece ser crítica para optimizar o nível de produção de ^6,7.

Em muitos casos, a produção bem sucedida de proteínas da membrana para a determinação da estrutura foi necessária a avaliação de várias versões incluindo eliminações amino e carboxi-terminais, múltiplos ortólogos de explorar variação de sequência natural e diferentes proteínas de fusão ^6-8. Por conseguinte, um método para o rastreio de expressão de múltiplas proteínas de membrana em paralelo é essencial. Uma abordagem é vulgarmente utilizada para fundir a proteína para proteína fluorescente verde (GFP), que permite a expressão a ser rastreado, sem a necessidade de purificar a proteína. Deste modo, a informação sobre o nível de expressão, estabilidade e comportamento em diferentes detergentes pode ser avaliada com pequenas quantidades de material purificado por un ^9-12.

Neste artigo vamos descrever um protocolo simplificado para clonagem e expressão de triagem de proteínas de membrana em E. coli utilizando fusão de GFP como um repórter de produção e posterior caracterização de detergente: proteína complexes (Figura 1).

Protocolo

1. Construção de Vectores de Expressão

1. O uso de infusão de clonagem por PCR para construir até 96 plasmídeos de expressão em paralelo utilizando os vectores pOPINE-3C-GFP e POPIN-N-GFP que adicionam tanto cliváveis ​​fusões GFP-His6 C-terminal ou N-terminal com as sequências ^13, respectivamente.
   Nota: A escolha do vector é ditada pela topologia da proteína desde a GFP precisa ser expresso no citosol, assim, para uma proteína com um terminal N e citosólica extracelular C-terminal seria usar POPIN-N-GFP e para um N-terminal extracelular e citosólica C-terminal em que usaria pOPINE-3C-GFP. Onde ambos os terminais são cytosolic usaríamos pOPINE-3C-GFP a menos que haja razão funcional para não marcar o C-terminal.
2. Amplificar as sequências de DNA que codificam as proteínas de membrana com primers que incorpora as seguintes extensões mostradas:
   pOPINE-3C-GFP (cartilha Atacante - AGGAGATATACCATG; primer reverso - CAGAACTTCCAGTTT) e Popin-N-GFP (cartilha Atacante - AAGTTCTGTTTCAGGGCCCG; - ATGGTCTAGAAAGCTTTA) primer reverso.
3. Analisar a reacção de PCR por electroforese em gel de agarose. Uma vez que os produtos limpos de PCR foram obtidos, adicionam-se 5 L Dpnl a cada poço (tornar-se em 5 ul de tampão de reacção Dpnl 1x). Purifica-se os produtos de PCR utilizando esferas magnéticas num formato de 96 poços.
   Nota: Dpnl é adicionado para remover o vector de molde; este passo não é necessário se o DNA genómico são utilizadas como molde.
4. Adicionar 1 ul (100 ng) do vector linearizado apropriado para cada poço de uma placa de PCR.
5. Usando um pipetador multicanal suplemento x ul de PCR purificado para inserir os poços apropriados da placa de PCR. Certifique-se de que todos os produtos estão na faixa de 10-250 ng.
6. Adicionar (9-x) ul de água para o bem e transferir a totalidade dos 10 ul a um tubo contendo o reagente seco para baixo em fusão. Deixe por 30 seg.
7. Misture o conteúdo brevemente por pipetagem cima e para baixo. Transferênciaas reações de volta para a chapa original PCR e selo.
8. Incubar durante 30 min a 42 ° C num termociclador.
9. Transferir imediatamente as reacções em gelo logo que a reacção está completa e adicionar 40 ul de TE (Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM).
10. Congelar de uma só vez ou em transformar células competentes. Para a transformação, utilizar 3 ul da reacção diluída por 50 ul alíquota de alta competência (> 5 x 10 ⁹ transformantes / ug) competentes E. células de E. coli.
11. Adicionar 1 ml de agar LB suplementado com 50 ug / ml de carbenicilina por poço de uma placa de cultura de tecido de 24 poços (por clonagem, para preparar os poços 2 x número de construções).
12. Após crescimento, a excrescência Seguindo placa 25 ul e 25 ul de uma diluição de 1 em 5 de cultura para o agar contendo 24 poços, placas de cultura de tecido.
13. Espalhe as células inclinando levemente a placa.
14. Seca-se a placa com a tampa durante 10-15 min a 37 ° C ou em um flohood w à temperatura ambiente.
15. Substituir a tampa e para girar a placa de cabeça para baixo e incubar durante a noite a 37 ° C.
16. Escolha duas colônias e mini-prep os vetores.
17. PCR verificar as construções que utilizam o específico primer reverso construção e um primer específico para a frente vector (por exemplo pOPIN_FOR GAC CGA AAT TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG).

2. Transformação de E. E coli Cepas Xpression

Nota: Antes de executar este protocolo, E. As células competentes de E. coli são feitas, aliquotado e armazenado congelado a -80 ° C tal como anteriormente descrito ^13. Expressão da proteína de membrana é rotineiramente em duas linhagens, Lemo21 (DE3) e C41 (DE3) pLysS. Para facilitar a interpretação dos resultados, pode ser útil incluir um controlo positivo, por exemplo, um plasmídeo expressando GFP ou uma proteína de membrana fundido a GFP e conhecida por expressar um vector vazio de controlo negativo.

1. Descongelar o aliquotted E. coli em gelo. Adicionar 3 mL de preparado de mini-plasmídeo de expressão para cada alíquota de células competentes.
2. Incubar a mistura em gelo durante 30 min.
3. De choque térmico das células durante 30 segundos a 42 ° C.
4. Permitir que as células recuperar em gelo durante 2 min e, em seguida, adicionar 300 mL de caldo de energia a cada tubo.
5. Incubar durante 1 h num incubador estático 37 ° C.
6. Prepare o agar LB numa placa de 24 poços de cultura de tecidos, suplementado com 50 ug / ml de carbenicilina e 35 ug / ml de cloranfenicol. Adicionar ramnose a uma concentração final de 0,25 mM para os poços que contêm Lemo21 (DE3).
   Nota: Se o produto é susceptível de ser tóxico aos poços contendo C41 (DE3) pLysS pode ser suplementado com 1% (w / v) de glucose.
7. Transferir 30 uL de células a partir da mistura de transformação em placas LB de agar. Espalhe e secar a placa conforme descrito no 1,13-1,15.

3. Preparação de fermentos Overnight

Nota: Sempre preparar culturas durante a noite do dia depois de transformação nunca de uma placa de transformação de idade.

1. Adicionar 0,7 ml de caldo de potência para cada poço de um de 96 poços de poços profundos placa suplementado com 50 ug / ml de carbenicilina e 35 ug / ml de cloranfenicol. Adicionar ramnose aos poços contendo Lemo21 (DE3) para uma concentração final de 0,25 mM. Opcionalmente, complementar C41 (DE3) pLysS com 1% (w / v) de glucose; veja acima (2.6 nota).
2. Escolha uma colônia a partir das placas de transformação durante a noite para cada poço. Selar o bloco com um selo de gás-permeáveis.
3. Agitar o bloco a 250 rpm numa incubadora com uma grande arremesso (por exemplo, uma órbita de 25 mm) ou a 600 rpm numa incubadora com uma pequena arremesso (por exemplo, uma órbita 4,3 milímetros) a 37 ° C durante a noite.

4. Crescimento e Indução de Culturas

1. Adicionar 3 ml de caldo de poder suplementado com 50 ug / ml de carbenicilina e 35 ug / ml de cloranfenicol a cada well de 24 poços de poço profundo prato. Adicionar L-ramnose (e glicose), conforme descrito na seção 3.1. Use 3 ml de cultura para permitir a colheita em duplicado e de permitir uma evaporação de água através da vedação permeável ao gás.
2. Defina-se as culturas de expressão por adição de 150 ul de Lemo21 (DE3) ou C41 (DE3) pLysS de culturas durante a noite a cada poço de os blocos de 24 poços profundos poços.
3. Agitar os blocos a 37 ° C até a densidade óptica média a 595 nm é de aproximadamente 0,5 através da placa.
4. Induzir a expressão pela adição de IPTG para as culturas para uma concentração final de IPTG 1,0 mM.
5. Crescer as culturas durante a noite (18-20 h) com agitação a 20 ° C.

5. Análise da Expressão In-gel Fluorescência

1. Colheita em duplicado. Transferir 1 ml da cultura de cada poço em uma praça bem, fundo cônico, de 96 poços bloco de poço profundo.
   Nota: Colheita em duplicado no caso de quebra do bloco ou para permitir o ensaio de um alternative detergente se desejado.
2. Selar os blocos e colher as células por centrifugação a 6000 xg durante 10 min.
3. Inverta o bloco e decantar a mídia. Toque no bloco cuidado sobre uma toalha de papel para escorrer mídia restantes.
4. Selar as placas e armazenar a -80 ° C por um período mínimo de 20 min. Opcionalmente, deixar a experiência a este ponto e o bloco processado quando conveniente.
5. De-Frost as pelotas por 20 minutos em temperatura ambiente.
6. Usar uma pipeta ou multi-canal ou num agitador orbital (1000 rpm durante 10 min) a 4 ° C para voltar a suspender as células completamente em 200 ul de tampão de lise (50 mM de NaH ₂ PO _4, 300 mM de NaCl 10 mM de imidazole a 1% v / v de Tween 20, ajustar o pH para 8,0 utilizando NaOH).
7. Adicionar 20 ul da solução DLPI (20 ul ADNasel (4000 unidades / ml), 20 mg de lisozima e 20 ul cocktail inibidor de protease num volume final de 2 ml de água). Incubar durante 10 min com agitação (~ 1000 rpm) a 4 ° C.
8. Adicionar 25 ul de 10% de n-dodecil β-D-maltósido (DDM).
9. Incubar durante 60 min com agitação (~ 1000 rpm) a 4 ° C.
10. Centrifugar o bloco de poços profundos a 6,000 xg durante 30 min a 4 ° C.
11. Transferir 10 uL do ligado clarificado para uma placa de microtitulação e adicionar 10 ul de tampão de carga de gel SDS-PAGE (Tris 100 mM, pH 6,8, 4% w / v de SDS, 0,2% w / v de azul de bromofenol, 10% v / v β mercaptoetanol, e 20% v / v de glicerol). CUIDADO! Não ferver DA AMOSTRA.
12. Carga de 10 ml de amostra a partir da etapa 5.11 / reproduzirem bem a SDS gel (s) PAGE e executar a 100-120 V (tensão constante) em câmara fria até a frente de corante atinge a parte inferior (2-2,5 hr).
13. Colocar o gel para um gerador de imagens (por exemplo, com um filtro de luz azul para detectar as proteínas de fusão GFP). O tempo de exposição é escolhido para assegurar que as bandas brilhantes não são saturados.

6. Aumento de escala de culturas de células

1. Transformar uma alíquota de competente E. coli como descrito na seção 2.
2. Escolha uma colônia em 10 ml de caldo de energia (complementados conforme descrito na seção 3) e crescer durante a noite a 37 ° C.
3. Dilui-se 5 ml da cultura durante a noite em 500 ml de caldo de potência.
4. Crescer com agitação a 250 rpm a 37 ° C até a densidade óptica a 595 nm é de ~ 0,5.
5. Induzir a expressão pela adição de IPTG até a uma concentração final de 1,0 mM.
6. Crescer durante a noite com agitação a 250 rpm a 20 ° C.
7. Células colheita por centrifugação a 5000 xg durante 15 min.
8. Sobrenadante Descartar. Os sedimentos celulares podem ser armazenadas a -80 ° C.

7. Preparação de Membranas

1. Descongelar as células (quando necessário), à temperatura ambiente e ressuspender em 1x PBS pH 7,5 a um volume de 5 mL por grama de sedimento de células; Aumentar o volume que for necessário até viscosidade reduz a uma consistência escorrendo. Adicionar _MgCl2 para uma concentração final de 1 mM, ADNase I a uma concentração final de 10 ug / ml e umapré-embalado de inibidor de protease comprimido por 20 g de sedimento celular. Quebrar células abertas utilizando um disruptor de células gelada a uma pressão de 30 kpsi.
2. Sedimentar as células intactas e os detritos a 30.000 g durante 15 min a 4 ° C. Transferir o sobrenadante para um tubo de ultracentrifugação.
3. Recolher a fracção de membrana total por centrifugação do sobrenadante para baixo de um ultra-centrifugar a 200.000 xg durante 1 h a 4 ° C.
4. Descartar o sobrenadante.
5. Re-suspender o pellet membrana no geladas 10 ml PBS pH 7,5 utilizando um homogeneizador celular. 1 ml de membranas ressuspensas são necessários para cada detergente. Opcionalmente, nesta fase, flash congelar a suspensão de membranas em azoto líquido e armazenar a -80 ° C.

8. A solubilização e Análise da fração de membrana

1. Descongelar fracção de membrana (se necessário), e para cada um detergente para ser utilizado para a solubilização, alíquotas de 900 ul da suspensão de membranas para um 1,5 ml de polialómero micro-centrifutubo de ge.
2. Adicionam-se 100 ul de cada detergente preparada de fresco (10% w / v de soluções DDM, DM, Cymal-6 e LDAO) para uma concentração final de 1% para o tubo especificado 1,5 ml. Para a solubilização de proteínas de membrana eucariótica hemissuccinato de colesterol (0,2% concentração final) podem ser adicionados aos detergentes.
3. Incubar as misturas a 4 ° C durante 1 hora com agitação suave.
4. Peletizar a fracção insolúvel em detergente com uma bancada de ultra-centrifugação, assegurando tubos são pelo menos semi-cheia, a 150000 g a 4 ° C durante 45 min e reter sobrenadante.
   Nota: A eficácia do detergente de solubilização pode ser estimada utilizando um leitor de placas fluorescente através da medição da fluorescência de GFP das membranas solubilizadas com a fracção insolúvel em detergente ressuspensas no mesmo volume de PBS.
5. Analisar o mono-dispersibilidade do detergente diferente: complexos de proteínas de membrana, utilizando cromatografia de exclusão de tamanho detectado por fluorescência (FSEC).
6. Para a análise FSEC, equilibrar uma coluna de exclusão de tamanho com uma gama ampla de fraccionamento, por exemplo 5.000 a 5.000.000 de peso molecular, com tampão de corrida (Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,03% de DDM) a um caudal de 0,3 ml / min . Utilize este tampão para todas as amostras, ou seja, ele não é alterado para cada detergente testado.
7. Injectar 100 ul de membranas solubilizadas na coluna a uma taxa de fluxo de 0,3 ml / min. Monitorar perfil de eluição usando óptica de fluorescência (excitação a 488 nm e emissão a 512 nm). Se um monitor em linha de fluorescência não está disponível, recolher as fracções e ler a fluorescência em um leitor de placas.
8. Import volume de eluição e os dados de intensidade de fluorescência em um programa de planilha para exibição gráfica.
9. Analisar restante material da membrana solubilizado por fluorescência in-gel conforme descrito no capítulo 5.

Resultados

A família de proteínas (SEDS forma, alongamento, divisão e esporulação) é essencial para a divisão celular bacteriana. Estas proteínas integrais têm tipicamente dez domínios transmembranares com ambos os terminais amino e carboxi no interior da célula. Para exemplificar o protocolo descrito acima, 47 SED ortólogos foram clonados no vector pOPINE-3C-eGFP. Uma tela de expressão em pequena escala das construções foi realizado em duas estirpes de E .coli, Lemo21 (DE3) foram cultivados na presença de 0,25 mM para bloquear a expressão ramnose gotejante e C41 (DE3) pLysS, que são rotineiramente usadas para a expressão de membrana proteínas ^5-8.

Detergentes solubilizadas lisados ​​de culturas induzidas foram analisadas por electroforese em SDS-poliacrilamida. Usando fluorescência em gel para visualizar as proteínas de fusão expressas GFP mostrou que entre as duas estirpes 38 dos 47 SED construções foram produzidas. Curiosamente havia diferenças entre as duas cepas de expressão. Dos 38 expressa construções, apenas 18 foram produzidos em ambas as linhagens, sendo 14 apenas expresso em Lemo21 (DE3) e 6 apenas em C41 (DE3) pLysS. No geral, houve uma maior taxa de sucesso para a Lemo21 (DE3) em comparação com o pLysS C41 (DE3) (38 vs 24). No entanto, a observação de que algumas proteínas parece ser específica estirpe significa que a triagem em ambos é útil.

Os dados representativos para 24 dos 47 SED construções estão apresentados na Figura 1. A intensidade das bandas dá uma indicação do nível de expressão, por exemplo, a proteína de fusão bem em C4 na Figura 1A e 1B é bem expressa em ambas as estirpes no entanto o adicional bandas de menor peso molecular sugerem que a proteína é parcialmente degradado. Em muitas pistas há uma banda que corresponde em tamanho a GFP sozinha. Uma avaliação qualitativa da integridade da proteína pode ser realizada, olhando para a intensidade da proteína de fusão relativamente à GFP livre;eg G4 e H4 são completamente discriminados ao GFP livre em C41 (DE3) pLysS (Figura 1B), enquanto que no Lemo21 (DE3) há alguma proteína intacta (Figura 1A). Para 14 das 38 proteínas expressas a intensidade da banda de GFP livre é semelhante à da proteína de fusão, por 21 a intensidade da banda de GFP livre é maior do que a da proteína de fusão e uma minoria das proteínas de fusão (3 / 38 expresso) por exemplo, F6 e G6 na Figura 1A tem relativamente pouco GFP livre em comparação com a proteína de fusão.

Duas das construções que expressavam bem nos B5 tela principal (bandas de alta intensidade para GFP livre e proteínas de fusão) e G6 (pouco livre GFP) foram expressos e uma fração de membrana total preparado a partir de 500 ml de cultura de células. Membranas ressuspensas foram divididas em alíquotas e analisadas por cromatografia de exclusão de tamanho detectado por fluorescência (FSEC). Os perfis FSEC são apresentados na Figure 2A e 2B, respectivamente, e mostram que as duas proteínas SED se comportam de maneira diferente nos quatro detergentes testados. Num dos casos (Figura 2A: amostra B5) a proteína só deu um pico simétrico, com pouca agregação em DDM que seria, portanto, o detergente de escolha para a purificação subsequente. Em contraste, a outra proteína de fusão (figura 2B: amostra G6) deu um perfil semelhante em todos os detergentes testados.

Figura 1: Diagrama de fluxo de trabalho para o rastreio de expressão de proteína de membrana em E. coli utilizando um repórter GFP.

Figura 2: tela primária de expressão da proteína de membrana utilizando fluorescência in-gel. lisados ​​detergentes de E. coli foram analisadas por SDS-PAGE e géis fotografada usando iluminação azul Epi e um 530/28 filtro. Os resultados são apresentados durante 24 construções marcadas (A4-H6 com base na sua posição em uma placa de 96 poços). São indicadas as posições das bandas de GFP livre e proteínas de fusão de GFP. (A) As proteínas expressas em Lemo21 (DE3). (B) As proteínas expressas em C41 (DE3) pLysS.

Figura 3:. Ecrã secundário da expressão da proteína de membrana utilizando cromatografia de exclusão de tamanho detectado por fluorescência (FSEC) Total de fracções de membrana foram extraídos em quatro detergentes diferentes e as proteínas de membrana solubilizadas analisada por cromatografia de exclusão de tamanho utilizando um sistema de FPLC acoplado a um detector de fluorescência. Perfis FSEC para (A) B5 proteína da membrana e (B) G6 proteína de membrana. A posição dos picos correspondentes a proteína agregada, solubilizado proteína de fusão de GFP e GFP livre são indicados. Os detergentes testados são indicados abaixo dos perfis.

Discussão

No protocolo descrito neste artigo, a clonagem independente de ligação num vector repórter GFP é combinada com detecção de fluorescência para rastrear rapidamente a expressão relativa de várias proteínas da membrana em E. coli. Vetores pode ser feita em quatro dias de trabalho com triagem expressão primária dar mais um semana. In-gel de fluorescência de lisados ​​detergentes de células inteiras é usado para classificar expressão bate para posterior análise em uma tela secundária. O ecrã primário expressão como apresentado não requer qualquer equipamento especializado para além de um incubador agitador adequado para células crescendo em blocos de poços profundos. Todas as outras manipulações, líquido que envolve placas de 96 poços SBS pode ser levada a cabo usando pipetas multicanal. O protocolo pode ser facilmente modificado para incluir outras estirpes de E. coli cultivadas sob diferentes condições de expressão (por exemplo, temperatura mais baixa). No caso de o LEMO21 (DE3) titulando o nível de ramnose (de 0 a 2,0 mM)adicionado para modular a taxa de transcrição pode aumentar o nível de expressão de algumas proteínas da membrana ^7. Excepto DDM detergentes pode ser utilizado para a extracção no ecrã primário embora detergentes mais severas podem solubilizar proteínas de corpos de inclusão e, por conseguinte, dar falsos positivos. Claramente, quanto mais elaborada da primeira tela se torna, mais o experimento demorado.

O ecrã secundário envolve a preparação de uma fracção de membranas totais a partir dos sucessos de expressão identificados no rastreio primário. Este é um passo crítico uma vez que irá confirmar a localização das proteínas de fusão com a membrana da E. células de E. coli. Extracção subsequente da proteína de fusão de GFP em diferentes detergentes é monitorizado por cromatografia de exclusão de tamanho detectado por fluorescência de material solubilizado para avaliar o mono-dispersividade dos complexos detergente-proteína. Este é mais um passo crítico, uma vez que identifica o detergente mais adequado parasolubilização da proteína de membrana para o processamento subsequente a jusante. No entanto, a experiência mostra que uma maior optimização da escolha do detergente (s) ainda pode ser necessário durante a purificação e cristalização. Evidência de comportamento uniforme em diferentes detergentes, incluindo aqueles com um tamanho de micelas relativamente pequenas (por exemplo, LDAO) parece ser um bom indicador da tendência para formar cristais bem diffracting, pelo menos, para as proteínas de membrana procariotas ^14. A este respeito, o perfil mostrado para a proteína de membrana na Figura 2B parece altamente favorável.

A principal vantagem da utilização de um repórter GFP é que dá uma rápida leitura de expressão em amostras purificadas por un. Uma desvantagem é que a proteína de fusão de GFP tem que ser removidos durante a purificação da proteína por cristalização. No caso dos vectores utilizados aqui, um sítio de protease 3C de rinovírus permite a clivagem da GFP. Em alternativa, é simplesre clone de proteínas candidatos, identificados na tela, em vetores que só adicionar um polihistidina ou outra marca de afinidade para a purificação subseqüente. Isso pressupõe que a fusão de GFP não é necessária para a expressão. A principal alternativa para a utilização da fusão para GFP para a detecção de expressão de proteína de membrana e a solubilização é adicionar apenas um marcador de histidina. No entanto, esta abordagem requer tipicamente a partir de uma fracção de membrana ^15, que para a avaliação de diversas variantes iria tornar-se muito demorado.

Em resumo, o objectivo principal do protocolo descrito neste artigo é permitir que um grande número de variantes de sequência da proteína de membrana a ser avaliada rapidamente em termos de expressão e detergente de solubilização e priorizados para análise mais profunda.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
pOPIN-N-GFP	addgene (www.addgene.org)
pOPINE-3C-GFP	addgene (www.addgene.org)
C41(DE3)pLysS	Lucigen (http://lucigen.com/)	60444-1
LEMO21(DE3)	New England Biolabs	C2528H
In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns	Clontech/Takara	639688
Power broth	Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/)	MD12-106-1
Protease Inhibitor tablets	Roche	11697498001
cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836170001
L-Rhamnose monohydrate	Sigma-Aldrich	83650
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	P8849
DNAse 1	Sigma-Aldrich	DN25
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L7651
Cholesterol hemisuccinate	Sigma-Aldrich	C6512
CYMAL-6 (6-Cyclohexyl-1-Hexyl-β-D-Maltoside)	Anatrace	C326
DDM (n-Dodecyl β-maltoside)	Generon	D97002
DM (n-Decyl β-maltoside)	Generon	D99003
LDAO (N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide)	Generon	D71111
E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 µl	Thermo Scientific	4672030
Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1,200 µl LTS Spacer	Anachem	LA6-300XLS
Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20 µl LTS	Anachem	L8-20XLSPLUS
Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1,200 µl LTS Tip	Anachem	L8-1200XLS
24 well V bottom deep well blocks	Porvair sciences	360115
BenchMark Fluorescent Protein Standard	Life Technologies	LC5928
NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well	Life Technologies	WG1203BOX
XCell4 SureLock Midi-Cell	Life Technologies	WR0100
Vibramax 100	Heidolph	544-21200-00
Tension rollers attachment	Heidolph	549-81000-00
ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor	Beckman Coulter	393253
Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor	Beckman Coulter	393315
Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors	Beckman Coulter	B14535
Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector	Shimadzu
Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column	GE Healthcare	17-5172-01
SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 rpm	Shel Lab	SSI5R-HS
Innova44R incubator	New Brunswick /Eppendorf	Innova44R
TS Series 0.75 kW Disrupter 230 V 50 Hz 1 PH (40 kpsi)	Constant systems	PL083016
L-Rhamnose monohydrate	Sigma	83650