Green Fluorescent Protein base Expression dépistage des protéines membranaires dans<em&gt; Escherichia coli</em

Résumé

Une approche rationalisée de dépistage de l'expression des protéines membranaires recombinantes dans Escherichia coli basée sur la fusion de la protéine fluorescente verte est présenté.

Résumé

La production de protéines membranaires recombinantes pour des études structurelles et fonctionnelles reste techniquement difficile en raison de faibles niveaux d'expression et l'instabilité inhérente de nombreuses protéines membranaires fois solubilisé dans les détergents. Un protocole est décrit qui combine le clonage indépendant de la ligature de protéines membranaires sous forme de fusions de GFP avec l'expression dans Escherichia coli détectées par fluorescence de la GFP. Cela permet à la construction et l'expression de dépistage de la protéine de membrane multiples / variantes pour identifier les candidats appropriés pour plus d'investissement de temps et d'efforts. Le rapporteur GFP est utilisé dans un criblage primaire de l'expression par la visualisation de la fluorescence de la GFP suivant gel de Polyacrylamide SDS (SDS-PAGE). Les protéines membranaires qui présentent à la fois un niveau d'expression élevé avec un minimum de dégradation, comme indiqué par l'absence de GFP libre, sont sélectionnés pour un criblage secondaire. Ces constructions sont mises à l'échelle et une fraction membranaire totale préparés et solubiliserd dans quatre détergents différents. Suite à une ultracentrifugation pour éliminer le matériau insoluble de détergent, des lysats sont analysés par chromatographie d'exclusion de taille de détection de fluorescence (FSEC). Le suivi du profil d'exclusion de taille par fluorescence de la GFP fournit des informations sur la mono-dispersité et l'intégrité des protéines membranaires dans des détergents différents. Protéines: combinaisons de détergents qui se éluent avec un pic symétrique avec peu ou pas de droits GFP et l'agrégation minimale sont des candidats pour une purification ultérieure. En utilisant la méthodologie ci-dessus, l'expression hétérologue dans E. coli du SED (forme, l'allongement, la division et la sporulation) protéines de 47 espèces différentes de bactéries a été analysée. Ces protéines ont typiquement dix domaines transmembranaires et sont essentiels pour la division cellulaire. Les résultats montrent que la production des SED orthologues chez E. coli était très variable en ce qui concerne les niveaux d'expression et l'intégrité des protéines de fusion GFP. L'expérience iindéterminés un sous-ensemble pour complément d'enquête.

Introduction

Il a été estimé que les protéines membranaires représentent environ 20 à 30% des gènes codés dans tous les génomes séquencés ^1, y compris le génome humain ^2. Compte tenu de leur rôle essentiel dans de nombreux processus biologiques, par exemple le transport des métabolites, la production d'énergie et comme cibles pour les médicaments, il ya un intérêt intense dans la détermination de leur structure tridimensionnelle. Toutefois, par rapport à des protéines solubles, des protéines membranaires sont très sous-représentées dans la Protein Data Bank. En fait, des 99 624 structures libérés dans l'APB ( http://www.rcsb.org/pdb/ ) seulement 471 ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) sont classés comme des protéines membranaires. Cela reflète les difficultés techniques de travail avec les protéines membranaires qui sont naturellement exprimés à des niveaux relativement bas; rhodopsine est l'un des quelques exceptions ^3,4. La surexpression de version recombinantes dans des cellules hétérologues se traduit souvent par mauvais repliement et mauvais ciblage à la membrane qui limite le niveau global de la production. Le choix du meilleur détergent pour l'extraction et la solubilisation d'une protéine de membrane, une fois exprimé rend difficile la purification subséquente et nécessite une optimisation minutieuse.

Escherichia coli reste hôte d'expression la plus couramment utilisée pour des protéines membranaires représentent 72% ( http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/ ) des structures résolu à ce jour qui sont presque exclusivement à partir de sources bactériennes. E. spécifique souches coli, C41 (DE3) et C43 (DE3), ont été isolés qui ne conduisent pas à la sur-expression de protéines membranaires et donc d'éviter les effets de la toxicité observé pour les autres souches BL21 ^5,6. Réglage du niveau d'expression recombinante de la protéine de membrane semble être critique pour optimiser le niveau de production ^{de 6,7.}

Dans de nombreux cas, la production réussie de protéines membranaires pour la détermination de la structure a nécessité l'évaluation de plusieurs versions dont deletions amino- et carboxy-terminales, de multiples orthologues d'exploitation de la variation de séquence naturelle et différentes protéines de fusion ^6-8. Par conséquent, un procédé pour le criblage d'expression de plusieurs protéines de la membrane en parallèle est essentielle. Une méthode couramment utilisée consiste à fusionner la protéine à la protéine fluorescente verte (GFP) expression permettant d'être suivis sans la nécessité de purifier la protéine. De cette façon, des informations sur le niveau d'expression, la stabilité et le comportement dans différents détergents peut être évaluée avec de petites quantités de matière non purifiée ^9-12.

Dans cet article, on décrit un protocole simplifié pour le clonage et l'expression criblage de protéines membranaires dans E. coli en utilisant la fusion à la GFP en tant que journaliste de la production et la caractérisation ultérieure de détergent: protéines compLexes (figure 1).

Protocole

1. Construction de vecteurs d'expression

1. Infusion de clonage PCR utilisation pour construire jusqu'à 96 plasmides d'expression en parallèle en utilisant les vecteurs popine-3C-GFP et POPIN-N-GFP qui ajoutent soit clivables fusions GFP-His6 C-terminales ou N-terminales à des séquences ¹³ respectivement.
   Remarque: Le choix du vecteur est dicté par la topologie de la protéine depuis la GFP doit être exprimée dans le cytosol, donc pour une protéine ayant une extrémité N-terminale extracellulaire et cytoplasmique C-terminale nous utiliserons POPIN-N-GFP et pour un N-terminale extracellulaire et cytosolique C-terminale de nous utiliseraient popine-3C-GFP. Lorsque les deux extrémités sont cytosolique nous utilisons popine-3C-GFP sauf se il ya raison fonctionnelle ne pas marquer l'extrémité C-terminale.
2. Amplifier les séquences d'ADN codant pour les protéines membranaires avec des amorces incorporant les extensions suivantes indiquées:
   popine-3C-GFP (de Amorce sens - AGGAGATATACCATG; amorce inverse - CAGAACTTCCAGTTT) et Popin-N-GFP (de Amorce sens - AAGTTCTGTTTCAGGGCCCG; amorce inverse - ATGGTCTAGAAAGCTTTA).
3. Analyser la réaction de PCR par électrophorèse sur gel d'agarose. Une fois les produits propres PCR ont été obtenus, ajouter 5 U Dpnl à chaque puits (maquillage dans 5 pi de tampon de réaction 1x Dpnl). On purifie les produits de PCR en utilisant des billes magnétiques dans un format à 96 puits.
   Remarque: Dpnl est ajouté pour éliminer le vecteur de modèle; cette étape ne est pas nécessaire si l'ADN génomique est utilisé comme matrice.
4. Ajouter 1 pi (100 ng) du vecteur linéarisé approprié à chaque puits d'une plaque PCR.
5. L'utilisation d'un add x multicanal pipette ul de PCR purifié insérer dans les puits appropriés de la plaque PCR. Veiller à ce que tous les produits sont de l'ordre de 10 à 250 ng.
6. Ajouter (9-x) pi d'eau au puits et transférer l'ensemble des 10 pi dans un tube contenant du sec-dans-fusion réactif. Laissez pendant 30 sec.
7. Mélanger le contenu brièvement par pipetage de haut en bas. Transfertles réactions de retour à la plaque originale PCR et le joint.
8. Incuber pendant 30 min à 42 ° C dans un thermocycleur.
9. Transférer immédiatement les réactions de glace dès que la réaction est terminée et ajouter 40 ul de TE (Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM).
10. Congeler à la fois ou se transformer en cellules compétentes. Pour la transformation, utilisez 3 pi de la réaction dilué par 50 pi aliquote de compétence élevée (> 5 x 10 ⁹ transformants / pg) E. compétente cellules de E. coli.
11. Ajouter 1 ml de gélose LB complétés avec 50 ug / ml de carbénicilline par puits d'une plaque de culture de tissu de 24 puits (pour le clonage, préparer puits pour 2 x nombre de constructions).
12. À la suite de l'excroissance, à la suite de plaque excroissance 25 ul et 25 ul d'une dilution 1 dans 5 de la culture sur la gélose contenant 24 puits des plaques de culture tissulaire.
13. Répartir les cellules en inclinant légèrement la plaque.
14. Sécher la plaque avec le couvercle pendant 10-15 min à 37 ° C ou dans un flow hotte à température ambiante.
15. Replacez le couvercle et tournez la plaque à l'envers et incuber une nuit à 37 ° C.
16. Choisissez deux colonies et mini-préparation des vecteurs.
17. PCR vérifier les constructions utilisant l'amorce spécifique de l'inversion de construction et une amorce sens spécifique de vecteur (par exemple pOPIN_FOR GAC CGA AAT TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG).

2. Transformation de E. Les souches de E coli Xpression

Remarque: Avant d'effectuer ce protocole, E. des cellules compétentes E. coli sont faites, aliquotés et conservés congelés à -80 ° C ¹³ comme décrit précédemment. expression de la protéine de membrane est un dépistage systématique chez deux souches, Lemo21 (DE3) et C41 (DE3) pLysS. Pour faciliter l'interprétation des résultats, il peut être utile d'inclure un contrôle positif, par exemple un plasmide exprimant la GFP ou une protéine de membrane fusionnée à la GFP connu à exprimer et à un contrôle vecteur vide négative.

1. Décongeler le aliquotted E. coli sur la glace. Ajouter 3 pi de mini-prepped plasmide d'expression à chaque aliquote de cellules compétentes.
2. Incuber le mélange sur de la glace pendant 30 min.
3. Choc thermique des cellules pendant 30 secondes à 42 ° C.
4. Laisser les cellules se rétablissent sur de la glace pendant 2 min, puis ajouter 300 ul de bouillon de puissance à chaque tube.
5. Incuber pendant 1 h dans un 37 ° C incubateur statique.
6. Préparer la gélose LB dans une plaque de culture tissulaire à 24 puits, supplémenté avec 50 pg / ml de carbénicilline et 35 ug / ml de chloramphenicol. Ajouter rhamnose à une concentration finale de 0,25 mM dans les puits contenant Lemo21 (DE3).
   Remarque: Si le produit est susceptible d'être toxique dans les puits contenant C41 (DE3) pLysS peut être complété avec 1% (p / v) de glucose.
7. Transfert 30 ul de cellules du mélange de transformation sur les plaques de gélose LB. Étendre et sécher la plaque comme décrit au 01/13 au 01/15.

3. Préparation de cultures de démarrage nuit

Note: Toujours préparer cultures de la nuit le jour après transformation jamais d'une vieille plaque de transformation.

1. Ajouter le bouillon de 0,7 ml de puissance à chaque puits d'une plaque de 96 puits en puits profond complété avec 50 ug / ml de carbénicilline et 35 ug / ml de chloramphenicol. Ajouter rhamnose dans les puits contenant Lemo21 (DE3) à une concentration finale de 0,25 mM. Eventuellement, compléter C41 (DE3) pLysS avec 1% (p / v) de glucose; voir ci-dessus (2,6 note).
2. Choisissez une colonie à partir des plaques de transformation de nuit dans chaque puits. Sceller le bloc avec un joint d'étanchéité perméable aux gaz.
3. Agiter le bloc à 250 tours par minute dans un incubateur avec un jet large (par exemple, une orbite de 25 mm) ou à 600 tpm dans un incubateur avec un petit jet (par exemple, une orbite de 4,3 mm) à 37 ° C pendant une nuit.

4. Croissance et induction des cultures

1. Ajouter 3 ml de bouillon de puissance additionné de 50 pg / ml de carbénicilline et 35 ug / ml de chloramphenicol à chaque waune de 24 puits plaque puits profond. Ajouter L-rhamnose (et glucose) tel que décrit à la section 3.1. Utiliser 3 ml de culture pour permettre la récolte, en double exemplaire et pour permettre une certaine évaporation de l'eau à travers le joint perméable au gaz.
2. Mettre en place les cultures d'expression en ajoutant 150 ul de Lemo21 (DE3) ou C41 (DE3) pLysS cultures d'une nuit à chaque puits des blocs à 24 puits à puits profonds.
3. Agiter les blocs à 37 ° C jusqu'à ce que la DO moyenne à 595 nm est d'environ 0,5 à travers la plaque.
4. Induire l'expression par addition d'IPTG à la culture à une concentration finale de 1,0 mM d'IPTG.
5. Développer les cultures pendant la nuit (18-20 h) avec agitation à 20 ° C.

5. Analyse d'expression par In-gel Fluorescence

1. Récolte en double exemplaire. Transférer 1 ml de la culture de chaque puits dans un puits carré, fond conique, de 96 puits bloc puits profond.
   Remarque: Harvest en double exemplaire en cas de rupture du bloc ou pour permettre l'essai d'un alternative détergent si désiré.
2. Sceller les blocs et récolter les cellules par centrifugation à 6000 xg pendant 10 min.
3. Inversez le bloc et décanter les médias. Appuyez sur le bloc doucement sur une serviette en papier pour drainer les médias restants.
4. Sceller les plaques et conserver à -80 ° C pendant un minimum de 20 min. Éventuellement, laissez l'expérience à ce point et le bloc traité au moment opportun.
5. De-gel des pastilles pendant 20 min à température ambiante.
6. Utiliser une pipette multicanaux ou un agitateur orbital (1000 rpm pendant 10 min) à 4 ° C pour remettre en suspension les cellules complètement dans 200 ul de tampon de lyse (50 mM de NaH ₂ PO _4, NaCl 300 mM mM d'imidazole 10 1% v / v de Tween 20, ajuster le pH à 8,0 en utilisant du NaOH).
7. Ajouter 20 ul de la solution de DLPI (20 ul DNase I (4000 unités / ml), 20 mg de lysozyme, et l'inhibiteur de protease 20 ul de cocktail dans un volume final de 2 ml d'eau). Incuber pendant 10 min avec agitation par secousses (~ 1000 tpm) à 4 ° C.
8. Ajouter 25 ul de 10% n-dodécyle β-D-maltoside (DDM).
9. Incuber pendant 60 min avec agitation par secousses (~ 1000 tpm) à 4 ° C.
10. Centrifugeuse le bloc puits profond à 6000 g pendant 30 min à 4 ° C.
11. Transfert 10 ul du lysat clarifié à une plaque de microtitrage et ajouter 10 ul de SDS tampon de gel de PAGE de chargement (Tris 100 mM, pH 6,8, 4% p / v de SDS, 0,2% p / v de bleu de bromophénol, 10% v / v β mercaptoéthanol, et 20% v / v de glycérol). ATTENTION! NE PAS FAIRE BOUILLIR l'échantillon.
12. Charge 10 pi d'échantillon de l'étape 5.11 / puits sur un gel de SDS-PAGE (s) et fonctionnent à 100-120 V (tension constante) dans une chambre froide jusqu'à ce que le front de colorant atteigne le fond (2 à 2,5 h).
13. Placer le gel sur un imageur (par exemple avec un filtre la lumière bleue pour détecter les protéines de fusion GFP). Le temps d'exposition est choisi de sorte que les bandes lumineuses ne sont pas saturés.

6. L'intensification des cultures cellulaires

1. Transformer une aliquote de compétente E. coli comme décrit dans l'article 2.
2. Choisissez une colonie dans 10 ml de bouillon de puissance (complété comme décrit dans la section 3) et pousser une nuit à 37 ° C.
3. Diluer 5 ml de la culture d'une nuit dans 500 ml de bouillon de puissance.
4. Grandissez avec agitation à 250 tours par minute à 37 ° C jusqu'à ce que la DO à 595 nm est ~ 0,5.
5. Induire l'expression par addition d'IPTG à une concentration finale de 1,0 mM.
6. Cultivez la nuit sous agitation à 250 tours par minute à 20 ° C.
7. Récolte des cellules par centrifugation à 5000 g pendant 15 min.
8. Surnageant défausse. Les culots cellulaires peuvent être conservés à -80 ° C.

7. Préparation des membranes

1. Décongeler les cellules (si nécessaire) à la température ambiante et remettre en suspension dans 1 x PBS, pH 7,5 à un volume de 5 ml par gramme de culot cellulaire; Augmenter le volume que nécessaire jusqu'à ce que la viscosité se réduit à une consistance liquide. Ajouter MgCl ₂ à une concentration finale de 1 mM, ADNase I à une concentration finale de 10 ug / ml et unepréemballée protease comprimé d'inhibiteur par 20 g de culot de cellules. Casser cellules ouvertes en utilisant un perturbateur cellulaire réfrigérés à une pression de 30 kpsi.
2. Pellet les cellules non rompues et les débris à 30000 g pendant 15 min à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un tube ultra-centrifugation.
3. Recueillir la fraction totale de la membrane vers le bas en faisant tourner le surnageant à une ultra-centrifugation à 200 000 xg pendant 1 heure à 4 ° C.
4. Jeter le surnageant.
5. Remettre en suspension le culot de membrane en glacées 10 ml de PBS pH 7,5 en utilisant un homogénéisateur de cellule. 1 ml membranes remises en suspension sont nécessaires pour chaque détergent. Eventuellement, à ce stade, flash geler la suspension de la membrane dans de l'azote liquide et conserver à -80 ° C.

8. solubilisation et l'analyse de la fraction membranaire

1. Fraction membranaire dégel (si nécessaire), et pour chaque détergent à utiliser pour la solubilisation, aliquotes de 900 ul de la suspension de membrane 1,5 ml dans un micro-centrifu polyallomèreTube ge.
2. Ajouter 100 ul de chaque détergent fraîchement préparé (10% p / v des solutions de DDM, cymal, DM-6 et AOTA) à une concentration finale de 1% pour le tube de 1,5 ml spécifié. Par solubilisation de protéines de la membrane eucaryote hémisuccinate de cholestérol (0,2% en concentration finale) peuvent être ajoutés aux détergents.
3. Incuber les mélanges à 4 ° C pendant 1 heure avec agitation douce.
4. Pellet la fraction insoluble de détergent avec une paillasse ultra-centrifugeuse, tubes assurant sont au moins à moitié plein, à 150 000 g à 4 ° C pendant 45 min et conserver surnageant.
   Remarque: L'efficacité de solubilisation avec un détergent peut être estimée en utilisant un lecteur de plaque à fluorescence par mesure de la fluorescence de la GFP des membranes solubilisées avec la fraction insoluble de détergent remise en suspension dans le même volume de PBS.
5. Analyser le mono-dispersité du détergent différent: des complexes de protéines membranaires en utilisant la chromatographie par fluorescence détectée exclusion de taille (FSEC).
6. Pour l'analyse FSEC, équilibrer une colonne d'exclusion de taille avec une large gamme de fractionnement, par exemple 5000 à 5.000.000 en poids moléculaire, avec un tampon (20 mM Tris pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,03% DDM) fonctionnant à un débit de 0,3 ml / min . Utilisez ce tampon pour tous les échantillons, ce est à dire qu'il ne est pas modifié pour chaque détergent testé.
7. Injecter 100 ul de membranes solubilisées sur la colonne à un débit de 0,3 ml / min de débit. Surveiller profil d'élution en utilisant l'optique de fluorescence (excitation à 488 nm et émission à 512 nm). Si un moniteur de fluorescence en ligne ne est pas disponible, la collecte des fractions et lire la fluorescence dans un lecteur de plaque.
8. volume d'élution d'importation et les données d'intensité de fluorescence dans un programme de feuille de calcul pour l'affichage graphique.
9. Analyser la matière restante de la membrane solubilisée par fluorescence en gel comme décrit dans la section 5.

Résultats

La famille de protéines SEDS (forme, allongement, division, et la sporulation) est essentiel pour la division cellulaire bactérienne. Ces protéines intégrales ont typiquement dix domaines transmembranaires avec deux terminaisons amino et carboxy à l'intérieur de la cellule. Pour illustrer le protocole décrit ci-dessus, 47 SED orthologues ont été clones dans le vecteur popine-3C-eGFP. Un petit écran d'expression à l'échelle des constructions a été effectuée en deux souches .coli E, Lemo21 (DE3) cultivées en présence de 0,25 mM rhamnose pour bloquer l'expression fuit et C41 (DE3) pLysS, qui sont couramment utilisés pour l'expression de la membrane ^8.5 protéines.

Détergent solubilisé lysats de cultures induites ont été analysés par électrophorèse SDS-polyacrylamide. Utilisation de la fluorescence in-gel pour visualiser les protéines de fusion GFP exprimées ont montré que, entre les deux souches 38 des 47 SED constructions ont été produites. Fait intéressant, il y avait des différences entre les deux souches d'expression. Sur les 38 exprimé constructions, seulement 18 ont été produites dans les deux souches, 14 seulement exprimée dans Lemo21 (DE3) et 6 seulement en C41 (DE3) pLysS. Dans l'ensemble, il y avait un taux de réussite plus élevé pour le Lemo21 (DE3) par rapport à la pLysS C41 (DE3) (38 vs 24). Cependant l'observation que certaines protéines semblent être souche spécifique signifie que le dépistage est à la fois utile.

Les données représentatives pour 24 des 47 SED constructions sont représentées à la figure 1. L'intensité des bandes donne une indication sur le niveau d'expression, par exemple la protéine de fusion en C4 et sur ​​la figure 1A et 1B est bien exprimé dans les deux souches, mais le supplément bandes de plus bas poids moléculaires suggèrent que la protéine est partiellement dégradé. Dans de nombreuses voies, il est un groupe qui correspond en taille à la GFP seule. Une évaluation qualitative de l'intégrité de la protéine peut être effectuée en examinant l'intensité de la protéine de fusion GFP par rapport à la connexion;par exemple G4 et H4 sont complètement décomposés à la GFP libre dans C41 (DE3) pLysS (figure 1B) alors que dans le Lemo21 (DE3) il ya une certaine protéine intacte (figure 1A). Pour 14 des protéines exprimées 38 l'intensité de la bande de GFP libre est similaire à celle de la protéine de fusion, par 21 l'intensité de la bande de GFP libre est supérieure à celle de la protéine de fusion et une minorité des protéines de fusion (3 / 38 exprimée) par exemple F6 et G6 à la figure 1A avoir relativement peu de GFP libre par rapport à la protéine de fusion.

Deux des constructions qui expriment bien dans les B5 écran primaire (bandes à haute intensité pour la GFP libre et des protéines de fusion) et G6 (peu libre GFP) ont été exprimées et une fraction membranaire totale préparée à partir de 500 ml de culture cellulaire. Les membranes remises en suspension ont été répartis en portions aliquotes et analysés par chromatographie d'exclusion de taille fluorescence détectée (FSEC). Les profils sont présentés dans FSEC Figure 2A et 2B, respectivement, et montrent que les deux protéines de SED se comportent différemment dans les quatre détergents testés. Dans un cas (Figure 2A: échantillon B5) la protéine seulement donné un pic symétrique avec peu agrégation dans DDM qui serait donc le détergent de choix pour purification ultérieure. Par contre l'autre protéine de fusion (Figure 2B: échantillon G6) a un profil similaire dans tous les détergents testés.

Figure 1: Schéma de flux de travail pour le dépistage membrane expression de la protéine dans E. coli en utilisant un rapporteur GFP.

Figure 2: écran principal de l'expression de la protéine de membrane en utilisant la fluorescence in-gel. lysats de détergent de E. cellules de E. coli ont été analysés par SDS-PAGE et gels imagées par Epi Bleu éclairage et un filtre 530/28. Les résultats sont présentés pour 24 constructions (étiquetés A4-H6 fonction de leur position dans une plaque de 96 puits). Les positions des bandes pour GFP libre et des protéines de fusion GFP sont indiqués. (A) les protéines exprimées dans Lemo21 (DE3). (B) Les protéines exprimées dans C41 (DE3) pLysS.

Figure 3:. Écran secondaire de membrane expression de la protéine en utilisant une Chromatographie d'exclusion de taille de la fluorescence détectée (FSEC) Total des fractions membranaires ont été extraites dans quatre détergents différents et les protéines membranaires solubilisées analysé par chromatographie d'exclusion stérique en utilisant un système FPLC couplée à un détecteur de fluorescence. FSEC de profils (A) de B5 protéine de la membrane et (B) protéine membranaire G6. La position des pics correspondant à des protéines agrégées, solubilisé la protéine de fusion GFP GFP et libre sont indiqués. Les détergents testés sont indiqués ci-dessous les profils.

Discussion

Dans le protocole décrit dans cet article, la ligature indépendante clonage dans un vecteur rapporteur GFP est combiné à détection de fluorescence pour cribler rapidement l'expression relative de plusieurs protéines membranaires en E. coli. Vecteurs peuvent être faites dans les quatre jours ouvrables avec le dépistage d'expression primaire de prendre une semaine supplémentaire. En-gel fluorescence de lysats détergentes de cellules entières est utilisé pour classer expression frappe pour une analyse ultérieure dans un écran secondaire. L'écran d'expression tel que présenté primaire ne nécessite pas d'équipement spécialisé en dehors d'un incubateur agitateur approprié pour la croissance des cellules dans des blocs de puits profonds. Toute autre manipulation impliquant liquide à 96 puits des plaques SBS peut être effectuée en utilisant des pipettes multicanaux. Le protocole peut être facilement modifié pour inclure d'autres souches de E. coli cultivées dans différentes conditions d'expression (par exemple de température basse). Dans le cas de la LEMO21 (DE3) en titrant le niveau de rhamnose (de 0 à 2,0 mM)ajouter à moduler le taux de transcription peut augmenter le niveau d'expression de certaines protéines de la membrane ^7. Détergents autres que DDM pourraient être utilisés pour l'extraction dans l'écran principal si détergents plus sévères peuvent solubiliser les protéines des corps d'inclusion et donc donner des faux positifs. De toute évidence, la plus élaborée l'écran initial devient, le plus de temps l'expérience.

L'écran secondaire consiste à préparer une fraction membranaire totale des résultats d'expression identifiés dans l'écran principal. Ce est une étape critique car il confirmera la localisation des protéines de fusion à la membrane du E. cellules de E. coli. Extraction ultérieure de la protéine de fusion GFP dans différents détergents est suivie par chromatographie d'exclusion de taille de la fluorescence détectée de matériau solubilisé pour évaluer la mono-dispersité des complexes détergent-protéine. Ce est une autre étape cruciale car elle identifie le détergent le plus approprié poursolubilisation de la protéine de membrane pour le traitement ultérieur en aval. Toutefois, l'expérience montre que l'optimisation du choix de la lessive (s) peut encore être nécessaire pendant la purification et la cristallisation. Preuve d'un comportement uniforme dans différents détergents, y compris celles qui ont une taille relativement petite de micelles (par exemple LDAO) semble être un bon indicateur de la propension à former ainsi diffracter cristaux au moins pour des protéines membranaires procaryotes ^14. En ce qui concerne le profil indiqué pour la protéine de membrane sur la figure 2B semble très favorable.

Le principal avantage d'utiliser un rapporteur GFP est qu'il donne une lecture rapide de l'expression dans des échantillons de l'ONU-purifié. Un inconvénient est que la protéine de fusion GFP doit être éliminé au cours de la purification de la protéine pour la cristallisation. Dans le cas de vecteurs utilisés ici, un site de protease 3C du rhinovirus permet le clivage de la GFP. En variante, il est facilede re-clone protéines candidates, identifiés dans l'écran, dans des vecteurs qui ne ajoutent une polyhistidine ou autre marqueur d'affinité pour la purification ultérieure. Cela suppose que la fusion de GFP ne est pas nécessaire pour l'expression. La principale alternative à l'utilisation fusion à la GFP pour la détection de l'expression de protéine de la membrane et la solubilisation est d'ajouter seulement un marqueur d'histidine. Toutefois, cette approche nécessite en général à partir d'une fraction de membrane ¹⁵ qui, pour l'évaluation de nombreux variants deviendrait beaucoup de temps.

En résumé, l'objectif principal du protocole décrit dans cet article est de permettre à un grand nombre de séquence de la protéine de la membrane variantes être évalués rapidement en termes d'expression et de solubilisation avec un détergent et de priorités pour une analyse plus approfondie.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
pOPIN-N-GFP	addgene (www.addgene.org)
pOPINE-3C-GFP	addgene (www.addgene.org)
C41(DE3)pLysS	Lucigen (http://lucigen.com/)	60444-1
LEMO21(DE3)	New England Biolabs	C2528H
In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns	Clontech/Takara	639688
Power broth	Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/)	MD12-106-1
Protease Inhibitor tablets	Roche	11697498001
cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11836170001
L-Rhamnose monohydrate	Sigma-Aldrich	83650
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma-Aldrich	P8849
DNAse 1	Sigma-Aldrich	DN25
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L7651
Cholesterol hemisuccinate	Sigma-Aldrich	C6512
CYMAL-6 (6-Cyclohexyl-1-Hexyl-β-D-Maltoside)	Anatrace	C326
DDM (n-Dodecyl β-maltoside)	Generon	D97002
DM (n-Decyl β-maltoside)	Generon	D99003
LDAO (N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide)	Generon	D71111
E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 µl	Thermo Scientific	4672030
Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1,200 µl LTS Spacer	Anachem	LA6-300XLS
Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20 µl LTS	Anachem	L8-20XLSPLUS
Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1,200 µl LTS Tip	Anachem	L8-1200XLS
24 well V bottom deep well blocks	Porvair sciences	360115
BenchMark Fluorescent Protein Standard	Life Technologies	LC5928
NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well	Life Technologies	WG1203BOX
XCell4 SureLock Midi-Cell	Life Technologies	WR0100
Vibramax 100	Heidolph	544-21200-00
Tension rollers attachment	Heidolph	549-81000-00
ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor	Beckman Coulter	393253
Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor	Beckman Coulter	393315
Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors	Beckman Coulter	B14535
Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector	Shimadzu
Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column	GE Healthcare	17-5172-01
SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 rpm	Shel Lab	SSI5R-HS
Innova44R incubator	New Brunswick /Eppendorf	Innova44R
TS Series 0.75 kW Disrupter 230 V 50 Hz 1 PH (40 kpsi)	Constant systems	PL083016
L-Rhamnose monohydrate	Sigma	83650