Ein Protokoll für Lentivirale Transduktion und Downstream-Analyse der Darm Organoide

Zusammenfassung

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Zusammenfassung

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

Einleitung

Das Darmepithel ist eine der am schnellsten vermehren Körpergewebe, die verursacht hat es großes Interesse aus der Forschung über Krebs und Stammzellen zu gewinnen. Im Jahr 2009 wurde eine Technik veröffentlicht, um lang anhaltende Kulturen von Klein Darmkrypten in Matrigel erzeugen, Erhaltung eine 3-dimensionale Struktur ^1. Diese Strukturen, sogenannte Darm Organoiden, kann unter Verwendung von Standardtechniken gezüchtet werden, mit Umgebungsmedium mit einer Anzahl von definierten Wachstumsfaktoren, einschließlich BMP-Signalweg-Inhibitors Noggin (nOgh) ergänzt, die Wnt-Signalwegs Enhancer rspondin 1 (Rspo1) und epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) alle eine Darm Proliferation ^2-4 verbessern.

Organoide übertreffen traditionelle Krebszelllinien in den Aspekten, dass sie nicht-mutierten sind, haben Stammzellen Hierarchie beibehalten, zeigen intakten Zellpolarisation und Ausstellungs Differenzierung in allen Zelllinien in der im Entstehen begriffenen kleine int gefundenestinal Epithel. Da sie transduziert Transgene tragen oder RNA-Interferenz-Konstrukte ^5, werden sie verwendet, um spezifische genetische Elemente zu untersuchen, überwiegt Experimenten mit transgenen Mäusen in Facetten Kosten und Geschwindigkeit. Transgene Expression in Organoiden kann unter Verwendung von entweder murine retroviralen oder lentiviralen Vektoren ^6,7 werden. Aufgrund der Einschränkungen der murine Retroviren, in der Lage zu transduzieren mitotischen Zellen ausschließlich ⁸ wird lentiviralen Transduktion häufiger für Zellen, die nur schwer zu infizieren, wie Organoiden verwendet.

Viral transduziert und stabil exprimierenden transgenen Organoiden kann für eine Vielzahl von Downstream-Analysen verwendet werden, einschließlich quantitative RNA-Analysen und Immunhistochemie. Zusammengenommen hat Kultur Organoide von primären intestinalen Epithelzellen in eine Routine-Technik, die einfach und ohne spezielle Laboranforderungen umzusetzen ist entwickelt, und hat sich die neue Norm in cell Kultur in Forschung auf das Darmepithel.

Techniken der virale Transduktion und nachfolgende Downstream-Analyse in Organoide sind mühsam durchzuführen und um organoide Experimente helfen wir generiert dieses Video-Protokoll und zeigt Methoden zur lentivirale Transduktion der kultivierten Organoide. Wir zeigen außerdem, wie die korrekte Verarbeitung Organoide kann die Ausbeute zu erhöhen und damit die Leistung zu verbessern nachgeschalteter Analyse mittels RNA-Techniken oder die Immunhistochemie. In dem Protokoll wurden Organoiden, die von kleinen Darmkrypten abgeleitet werden ausschließlich verwendet, obwohl die beschriebenen Techniken können zum Kolon Organoide als auch angewendet werden.

Protokoll

1. Herstellung von Polyethylenimin (PEI) als Transfektionsreagenz

1. Man löst etwa 150 mg von PEI in 100 ml H ₂ O.
2. Einstellen auf pH 7,4 durch Zugabe von HCl, bis die Lösung klar wird und rühre bis zur vollständigen Auflösung. Dieser kann zwischen 10 und 60 Minuten dauern und Wasser bis zu einer Endkonzentration von 1 mg / ml.
3. Wenn klar ist, filtern das PEI-Lösung durch ein steriles 0,22 um Filter und Speicher in einem -80 ° C Gefrierschrank in Aliquots von 5 ml.

2. Herstellung von Lentivirale Partikel

Tag 1:

1. Split HEK293T-Zellen zu 60% bis 80% Konfluenz in 162 cm ^{2 -Kolben} oder große Petrischale in Zellinie Kulturmedium (DMEM mit 10% FCS, 1% Penicillin / Streptomycin und 2 mM Glutamin ergänzt Ergänzung).

Tag 2:

2. Bereiten DNA Transfektion Lösung mit 45 ug Gesamt-Plasmid-DNA durch Additionlentiviralen Verpackungsvektoren (7 ug pVSVg; 5 ug pRSV rev; 13 ug pMDL) und 20 ug lentiviralen Plasmid, der das Gen von Interesse oder shRNA von Interesse kodiert. Einzustellen, um ein Volumen von 1 ml mit DMEM.
3. Bereiten PEI Transfektion Lösung durch Zugabe von 90 ul 1 mg / ml PEI 930 ul DMEM und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur.
4. In DNA-Transfektion Lösung PEI-Lösung. Vortex oder Invertzucker mehrfach und Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur, um DNA-Transfektion Lösung zu erhalten.
5. Tropft 2 ml des DNA-Transfektions-Lösung auf die HEK293T Zellen und Inkubation für 4 Stunden in einem befeuchteten Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C.
6. Nach 4 Stunden, aktualisieren Sie die Kulturmediums auf PEI zu entfernen. Es ist nicht notwendig, Zellen zu waschen, bevor neues Medium.
   HINWEIS: PEI ist zytotoxischen und Inkubationszeiten länger als 4 Stunden kann zu Schädigungen der HEK293T-Zellen führen.

Tag 4:

7. Supe ersetzenrnatant mit neuen Kulturmedium. Halten Stand (Virus enthalten); Dies wird in Schritt 2.10 verwendet werden.
8. Legen Überstand in 15 ml-Kolben. Um tote Zellen, Zentrifuge für 5 Minuten bei 500 x g zu entfernen.
9. Schieben Stand durch ein 0,45 um-Filter unter Verwendung einer großen Spritze 60 ml. Speichern Nacht bei 4 ° C.

Tag 5:

10. Sammeln Sie die zweite Charge von Überstand; Zentrifuge und Filter, wie in den Schritten 2,8-2,9.
11. Pool der Überstände aus den Schritten 2.9 und 2.10 in Ultrazentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 50.000 xg in einer Ultrazentrifuge für 90 min.
12. Nehmen Sie die Kapseln Ultrazentrifugenröhrchen, die sehr sorgfältig und in eine Sterilbank, die Erinnerung an die Ausrichtung des Rohres in der Zentrifuge.
13. Offene Kapselhalteultrazentrifugenröhrchen dekantiert Medium sorgfältig in einer solchen Weise, daß das Pellet an der Oberseite des Rohrs. Da virale Pellets kann schwierig sein, zu visualisieren, zu erinnern, wasSeite des Rohrs ein Pellet gebildet haben. Werfen Sie einen Mikropipette und entfernen letzte bisschen Medium während kümmert sich nicht um die undurchsichtigen braunen Pellets, die auf der Seite der Unterseite des Ultrazentrifugenröhrchen sichtbar zu agitieren.
14. Resuspendieren dieses Pellet in 500 ul organoiden Kultur-Medium mit 10 mM Nicotinamid, 10 uM Chir99021, 10 uM Y27632 und 8 ug / ml Polybren ergänzt. Resuspension in diesem Medium ist wichtig, da mit hohem Titer-Virus wird verwendet, um Organoide direkt transduzieren.
15. Optional: einfrieren, das Virus in diesem Medium in zwei Chargen von 250 ul in -80 ° C aliquotiert.

3. Lentivirale Transduktion Organoide

Tag 0:

1. Split eine vollständige 0,95 cm ² und der Organoide zwei Tage vor dem in eine neue und Weiterleitung mit dem Ziel, rund 50 kleine Organoide erhalten. Aufgeteilt Organoiden nach früher veröffentlichten Protokoll ¹ (3A, B).
2. Ergänzen organoide Kulturmedium mit 10 & mgr; Chir99021 und 10 mM Nicotinamid zystische Hyperproliferations Krypten (3C) zu erhalten.
   HINWEIS: Cystic Krypten am besten entwickeln, wenn frisch gespalten Organoide werden in Gegenwart von Chir99021 gewachsen.

Tag 2:

3. Ernte Organoide durch Auf- und Abpipettieren der Matrigel und mittlere, wodurch das Gemisch mit einer Mikropipette p1000 zu stören. Legen Sie die Mischung in einem 15-ml-Tube.
4. Weiter stören mit Pasteur-Pipette, in dem sich die distale Öffnung hat, durch Schmelzen verringert. Zentrifuge Organoiden für 5 min bei 100 x g pelletieren.
   HINWEIS: Abhängig von der Größe der Zentrifuge, verwenden Sie ein anderes Zentrifugendrehzahl. Es ist notwendig, die genaue Geschwindigkeit, mit der gestörten Organoide werden aus dem Gemisch abgetrennt finden.
5. Entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 500 ul vorgewärmtes 1x Trypsin (ähnlich wie 0,25% Trypsin). Resuspendieren Organoide in Trypsin und Inkubation3 min in einem 37 ° C Wasserbad.
6. Inaktivierung von Trypsin durch Zugabe von 3,5 ml Zelllinie Kulturmedium (DMEM, ergänzt mit 10% FCS, 1% Penicillin / Streptomycin und Glutamin). Zentrifuge 5 min bei 500 x g.
7. Entfernen Sie den Überstand in Pellet in etwa 20 ul Medium zu verlassen. Übertragen Sie die Organoide in diesem letzten kleinen Menge des Mediums in einen Brunnen auf einem 48-Mulden Platte.
8. In hohem Titer Lentivirus in Übertragungsmedium, wie in Schritt 2.14, resuspendieren beschrieben und fahren Sie mit Schritt 3.10. In der Begegnung mit niedrigen Übertragungswirksamkeit, Schritt 3.9 hinzugefügt werden.
   HINWEIS: Für eine effiziente Weiterleitung, in der Regel fügen Sie ein Aliquot von 250 ul mit hohem Titer Lentivirus um eine Vertiefung Organoide. Dies entspricht 50% der gesamten Ernte Lentivirus aus einer Produktion wie in Schritt 2 dieses Protokolls beschrieben.
9. Optional: zu Übertragungswirksamkeit zu verbessern, führen spinoculation, indem Sie die 48 Well-Platte mit Organoide in einem vorgewärmten Zentrifuge auf 326; C und rotieren bei 600 × g für 1 Std.
10. Setzen organoide-Virus-Mischung in Kulturbrutschrank und Inkubation für 1 h bei 37 ° C in einem Brutschrank zum Übertragung ermöglichen.
11. Optional: zur weiteren Verbesserung der Wirksamkeit der Transduktion inkubieren Organoiden weitere 3 h bei 37 ° C in einem Brutschrank.
12. 1 ml der organoiden Kulturmedium und resuspendieren organoide-Virus-Mischung, Transfer in ein Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge in einer Mikrozentrifuge für 5 Minuten bei 850 xg pelletiert Organoide.
13. Überstand verwerfen und das Pellet in 20 ul eiskaltem Matrigel. Da das Material verfestigt, wenn es wärmer wird, verwenden Sie die Pipettenspitzen, die durch Auf- und Abpipettieren eiskaltem PBS für eine Reihe von mal gekühlt werden.
14. Setzen des Tröpfchens in der Mitte einer Vertiefung in einer 48 Vertiefungen Inkubieren in Kulturbrutschrank bei 37 ° C für 15 min zu verfestigen.
15. Nach 15 Minuten vorsichtig mit 250 ul organoide Kulturmedium, ergänzt10 mM Nicotinamid, 10 uM und 10 uM Chir99021 Y27632. Kleine gestört organoide Fragmente werden in kleine zystische Organoide innerhalb von 24 Stunden zu bilden.

Tag 5:

16. Aktualisieren Medium und zu ergänzen, mit einer Auswahl Antibiotikum (für Puromycin, verwenden Sie 4 ug / ml).

7. Tag:

17. Ersetzen Medium für Standard organoide Kulturmedium, mit Auswahl Antibiotikum ergänzt.
    HINWEIS: Angehende wird komplett 2-3 Wochen nach Chir99021 Rückzug sein. Nach der Auswahl können Organoide ohne Selektionsantibiotikum angebaut werden.

4. Organoide RNA Vorbereitung Quantitative RT-PCR oder Microarray-

1. Zur RNA-Präparation, mit einem kommerziellen Kit nach Herstellerprotokoll. Entfernen Sie das Medium aus Organoide und fügen Sie 350 ul Puffer RLT, mit β-Mercaptoethanol ergänzt gerade auf der Kuppel des Matrigel enthält Organoide. Resuspendieren der Material in RLT durch Pipettieren mit p1000 Mikropipette.
2. Der weitere RNA prep nach dem Protokoll des Herstellers.
3. Optional: RNA-Ausbeute zu erhöhen durch Amplifikation mit Ovation Pico WTA Systems und schreibt erste Eingabe von 50 ug Gesamt-RNA nach Herstellerprotokoll.
4. Optional: für die Qualitätskontrolle vor der RNA-Microarray, laufen Proben auf einem 2100 Bioanalyzer mit einem Eukaryoten Gesamt-RNA Nano-Chip, mit dem Ziel für eine RNA Integrity Number (RIN) von 8,5 oder mehr (5) nach dem Protokoll des Herstellers.

5. Die Verarbeitung Organoide für Paraffinausgießstation und Immunhistochemie

1. Vor Beginn der organoiden Einbindung vorwärmen ein Aluminiumblock mit Bohrungen passend Durchmesser 12 mm Glasröhrchen im Brutschrank bei 70 ° C bis Paraffin flüssig zu halten.
2. Werfen Sie einen einzigen gut mit ausgewachsenen Organoide und entfernen Sie das Medium, so dass die eingebetteten Organoide intakt.
3. 1 mlvon 4% Paraformaldehyd in PBS direkt zu gut und zu beheben bei 4 ° C überall von 1 Stunde über Nacht.
4. Para Ersetzen mit 1 ml eiskaltem PBS.
   Optional: halten fest Organoide in PBS bis zu 1 Woche bei 4 ° C nach diesem Schritt.
5. Resuspendieren Fest Organoide in 1 ml PBS aufnehmen und in Glasfläschchen.
6. Lassen Organoiden sinken nach unten für 1 min, zu dekantieren und zu ersetzen PBS mit 70% Ethanol in dem ein paar Tropfen von Eosin-Lösung gelöst, um die Visualisierung von Organoiden gesamten Einbettungsprozesses zu ermöglichen.
7. Verlassen Organoiden in 70% Ethanol bei Raumtemperatur. Nach 30 Minuten, entfernen Sie 70% Ethanol durch vorsichtiges Dekantieren, die Möglichkeit, die Organoide von Auge, weil der leichte rosa Farbe Eosin sichtbar zu machen. Ersetzen Sie die Einbettung Lösung mit 96% Ethanol.
8. Wiederholen Sie Schritt 5.7 wird jedes Mal, Austausch der Einbettung Lösung mit dem nächsten. Pass Organoide durch die folgenden Lösungen anschließend: 70% Ethanol, 90% Ethanol, 96% Ethanol, 100% ethanol, 100% Ethanol, Xylol, Xylol.
9. Dekantiert man die letzten Xylol Wasch und gießen Paraffin in die Röhre. Das Glas sofort in der Pre erwärmt Aluminiumblock bei 70 ° C für 30 min und ersetzen Paraffin mit neuen sauberen Paraffin.
10. Gießen Paraffin aus und Pipetten Organoide in den Paraffinblock Form unter Verwendung einer vorgewärmten Pasteur-Pipette mit großer Öffnung. Halten Pasteur-Pipette warmen mit einem Bunsenbrenner. Legen Sie alle Organoide im Paraffinblockform in einer kleinen Schicht von flüssigem Paraffin.
11. So viel wie möglich, versuchen Sie, alle Organoide in Richtung der Mitte des Paraffinblocks Form unter Verwendung einer erwärmten Dissektion Nadel manipulieren. Halten Sie Dissektion Nadel warmen mit Bunsenbrenner.
12. Wenn Lokalisierung Organoide in der Form ist zufriedenstellend, Kokille leicht auf die Paraffinschicht verfestigt.
13. Beenden Sie den Block durch Gießen mehr Paraffin auf und fügen Sie ein Standard-histologische Einbettung Kassette.

Ergebnisse

Organoide lentivirale Transduktion

Die Technik der organoiden Transduktion unter Verwendung lentivirale Partikel hängt von richtigen Umgang mit Organoide vor und während der Weiterleitung. Organoide (3A) wurden kultiviert und sie in einzelne Krypten (3B) gestört wurden. Wie bereits berichtet, diese einzelnen Krypten, wenn sie in Gegenwart der GSK3-Inhibitor Chir99021 kultiviert wurde zystische Krypten ⁹ (3C). Anschlie?...

Diskussion

Das aktuelle Video-Protokoll beschreibt lentivirale Transduktion Organoide von der Grund Darmepithel und nachgelagerten Analyse dieser Organoide mittels quantitativer RNA-Techniken und Immunhistochemie.

Lentivirale Transduktion wird oft in anhaftenden oder schwimmende Zellen in Kulturplatten durchgeführt. Da die dreidimensionale Struktur von Organoiden macht sie schwierig durch virale Partikel eindringen, sind eine Reihe von Verfahren, um die Wirksamkeit zu erhöhen. Eine Vorbehandlung der ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyethylene imine	Polysciences	23966-2
DMEM medium	Lonza	BE12-614F
Fetal calf serum	Lonza	DE14-801F
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Glutamin	Invitrogen	25030-024
matrigel	BD	BD 356231
Advanced DMEM-F12	Gibco	12634-010
N2	Invitrogen	17502-048
B27	Invitrogen	17504-044
N-acetyl cysteine	Sigma	A9165-1G
mouse Egf	Invitrogen	PMG8045
Hepes 1 M	Invitrogen	15630-056
glutamax 100x	Invitrogen	35050-038
Chir 99021	Axon	1386
Y27632	Sigma	Y0503-5MG
polybrene	Sigma	107689
nicotinamide	Sigma	N0636
Trypsin	Lonza	BE02-007E
puromycin	Sigma	P 7255
Rneasy mini kit	Qiagen	74106
β-mercaptoethanol	Merck	8,057,400,250
Ovation Pico WTA system	NuGen	3300-12
paraformaldehyde	Sigma	252549-1L
glass vial conical 12 mm x 75 mm 5 ml	VWR	LSUKM12
Eosin Yellowish	VWR	1,159,350,025