Um Protocolo de Transdução Lentivirus e Análise de Downstream da Intestinal Organóides

Resumo

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Resumo

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

Introdução

O epitélio intestinal é um dos tecidos corporais mais proliferam rapidamente, o que fez com que ele atrair grande interesse da pesquisa sobre as células cancerosas e tronco. Em 2009, uma técnica foi publicado para gerar culturas de longa duração de pequenas criptas intestinais em matrigel, conservando uma estrutura dimensional 3 ^1. Estas estruturas, denominado Organóides intestinal, pode ser cultivado usando técnicas convencionais, com áreas meio suplementado com um número de factores de crescimento definidas, incluindo a BMP-inibidor da via de sinalização noggin (nog), o intensificador de via de sinalização Wnt-1 rspondin (RSPO1) e factor de crescimento epidérmico (EGF) todos encontrados para aumentar a proliferação intestinal ^2-4.

Organóides superar tradicionais linhas celulares de cancro nos aspectos que são não mutado, mantiveram hierarquia de células-tronco, exibir polarização celular intacto e diferenciação exposição em todas as linhagens de células encontradas na nascente pequeno intepitélio estinal. Uma vez que podem ser transduzidas para transportar transgenes ou interferência de ARN constrói ^5, eles são utilizados para estudar os elementos genéticos específicos, compensando experiências utilizando ratinhos transgénicos em facetas de custo e de velocidade. A expressão transgénica em Organóides pode ser realizada utilizando retrovírus murino ou vectores lentivirais ^6,7. Devido às limitações de retrovírus murino, capazes de transdução de células mitóticas exclusivamente ^8, transdução lentiviral é mais frequentemente usado para células que são difíceis de infectar, como Organóides.

Viralmente e transduzidas que expressam estavelmente Organóides transgénicas podem ser usadas para uma multiplicidade de análises a jusante, incluindo ARN análises quantitativa e imuno-histoquímica. Tomados em conjunto, a cultura de Organóides de células epiteliais do intestino primárias evoluiu para uma técnica de rotina que é fácil de implementar, sem requisitos laboratoriais específicos, e tornou-se o novo padrão em cecultura ll em pesquisas sobre o epitélio intestinal.

Técnicas de transdução viral e análise jusante subsequente em Organóides são entediantes para executar e para ajudar experimentos organóide geramos este protocolo de vídeo, mostrando métodos para a transdução de lentivírus de Organóides cultivadas. Nós, adicionalmente, mostrar como correto processamento de Organóides pode aumentar o rendimento e, portanto, melhorar o desempenho da análise a jusante, utilizando técnicas de RNA ou imuno-histoquímica. No protocolo, Organóides que são derivados a partir de pequenas criptas intestinais foram utilizados exclusivamente, embora as técnicas descritas podem ser aplicadas a Organóides do cólon, bem.

Protocolo

1. Preparação de polietilenimina (PEI) como Reagente de Transfecção

1. Dissolve-se cerca de 150 mg de PEI em 100 ml de H ₂ O.
2. Ajuste a solução para pH 7,4 pela adição de HCl até que a solução torna-se clara e mexa até dissolver completamente. Isto pode levar entre 10 e 60 min e adicionar água a uma concentração final de 1 mg / ml.
3. Quando clara, filtrar a solução PEI através estéril filtro de 0,22 um e armazenar em um freezer -80 ° C em alíquotas de 5 ml.

2. Produção de Lentivirus Particles

Dia 1:

1. Células HEK293T Dividir a 60% -80% de confluência em 162 ^cm2 de frasco ou placa de petri grande em linha de células de meio de cultura (DMEM suplementado com 10% de FCS, 1% de penicilina / estreptomicina e glutamina 2 mM).

Dia 2:

2. Preparar a solução de transfecção de DNA contendo 45? G de DNA total do plasmídeo adicionando juntosvectores lentivirais de embalagem (7 ug de pVSVg; 5 ug de pRSV rev; 13 ug de pMDL) e 20 ug de plasmídeo de lentivírus que codificam o gene de interesse ou shRNA de interesse. Ajustar para um volume de 1 ml, utilizando meio DMEM.
3. Preparar a solução de transfecção PEI por adição de 90 ul de 1 mg / ml de PEI a 930 ul de DMEM e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
4. Adicionar solução de transfecção de ADN a uma solução de PEI. Vortex ou inverter um número de vezes e incubar durante 5 min à temperatura ambiente para se obter a solução de transfecção de ADN.
5. Gotejamento 2 ml da solução de transfecção de ADN para as células HEK293T e incubar durante 4 horas numa incubadora de cultura de células em humidificada a 37 ° C.
6. Após 4 horas, atualize o meio de cultura para remover PEI. Não é necessário lavar as células antes da adição de meio novo.
   NOTA: PEI é citotóxico e incubação vezes mais do que 4 horas pode causar danos às células HEK293T.

Dia 4:

7. Substitua supernatant com o novo meio de cultura. Manter sobrenadante (contendo vírus); este vai ser utilizado no passo 2.10.
8. Coloque sobrenadante em 15 ml frasco. Para remover as células mortas, centrifugar durante 5 minutos a 500 x g.
9. Empurrar sobrenadante através de 0,45 um filtro usando um grande seringa de 60 mL. Armazenar durante a noite a 4 ° C.

Dia 5:

10. Recolhe-se o segundo lote do sobrenadante; centrifugar e filtrar tal como nos passos 2,8-2,9.
11. Reúnem-se os sobrenadantes dos passos 2.9 e 2.10 em tubos de ultracentrífuga e centrifugar a 50000 xg numa ultracentrífuga durante 90 min.
12. Retire cápsulas contendo os tubos de ultracentrífuga muito cuidadosamente e colocados numa câmara de fluxo laminar, lembrando-se a orientação do tubo para dentro da centrífuga.
13. Abrir de retenção da cápsula e tubo de ultracentrífuga meio decantar cuidadosamente, de tal forma que o pelete é no lado superior do tubo. Desde pelotas virais podem ser difíceis de visualizar, para o que se lembrarlado do tubo, um sedimento terá formado. Tomar uma micropipeta e remover último bit de meio, tendo cuidado para não agitar o sedimento castanha opaca que é visível do lado da parte inferior do tubo de ultracentrífuga.
14. Ressuspender este sedimento em 500 ul de meio de cultura organ�de suplementadas com 10 mM de nicotinamida, 10 uM Chir99021, 10 uM Y27632 e 8 ug / mL de polibreno. A ressuspensão neste meio é importante já que o vírus de título elevado é usado para transduct Organóides directamente.
15. Opcionalmente: congelar o vírus neste meio aliquotadas em dois lotes de 250 ul em -80 ° C.

3. Transdução Lentivirus de Organóides

Dia 0:

1. Dividir uma completa 0,95 centímetros ² poço de Organóides dois dias antes transdução em um novo poço, com o objetivo de obter cerca de 50 pequenas Organóides. Dividir Organóides acordo com o protocolo previamente publicado ¹ (Figura 3A, B).
2. Suplemento organ�de meio de cultura com 10 uM Chir99021 e 10 mM de nicotinamida para obter hiper cística criptas proliferativas (Figura 3C).
   NOTA: criptas cística irá desenvolver melhor quando Organóides recém divididas são cultivadas na presença de Chir99021.

Dia 2:

3. Organóides colheita por pipetagem cima e para baixo do matrigel e médio, interrompendo assim a mistura com uma micropipeta P1000. Coloque a mistura em um tubo de 15 ml.
4. Perturbar ainda mais usando pipeta Pasteur em que a abertura distal foi diminuído por fusão. Organóides Centrifugar para sedimentar durante 5 min a 100 x g.
   NOTA: Dependendo do tamanho da centrífuga, centrífuga de usar uma velocidade diferente. É necessário encontrar a velocidade exacta em que interrompeu Organóides são separadas da mistura.
5. Remover o sobrenadante e adicionar 500 ul de tripsina (semelhante à tripsina 0,25%) pré-aquecida 1x. Ressuspender Organóides em tripsina e incubar3 min num banho de água a 37 ° C.
6. Inactivar a tripsina por adição de 3,5 ml de meio de cultura de linha celular (DMEM suplementado com 10% de FCS, 1% de penicilina / estreptomicina e glutamina). Centrifugar durante 5 minutos a 500 x g.
7. Remover o sobrenadante para deixar o granulado em cerca de 20 ul de meio. Transferir os Organóides neste último pequena quantidade de meio para um poço numa placa de 48-poços.
8. Adicionar alta lentivírus título na forma de transdução, tal como descrito no passo 2.14, ressuspender e continuar para o passo 3.10. Ao encontrar baixa eficácia de transdução, passo 3.9 podem ser adicionados.
   NOTA: Para a transdução eficiente, tipicamente adicionar uma alíquota de 250 ul de elevado título de lentivírus para um poço de Organóides. Isso representa 50% de todo o lentivírus colhidas a partir de uma única unidade de produção, tal como descrito no passo 2 deste protocolo.
9. Opcionalmente: para aumentar a eficácia de transdução, execute spinoculation colocando os 48 poços contendo Organóides em uma pré-aquecido centrífuga em 326; C e gire a 600 g durante 1 hora.
10. Coloque a mistura organ�de-vírus em cultura incubadora e incubar durante 1 hora a 37 ° C numa incubadora de cultura para permitir a transdução.
11. Opcionalmente, para melhorar ainda mais a eficácia de transdução, Organóides incubar durante 3 horas adicionais a 37 ° C numa incubadora de cultura.
12. Adicionar 1 ml de meio de cultura organ�de e ressuspender a mistura organ�de-vírus, transferir para um tubo de microcentrifugação e centrifuga-se numa microcentrífuga durante 5 min a 850 xg para sedimentar Organóides.
13. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 20 mL de matrigel arrefecido com gelo. Uma vez que o material solidifica quando se torna mais quente, usar as pontas de pipeta que são refrigerados por pipetagem para cima e para baixo PBS gelado para um número de vezes.
14. Coloque a gota no meio de um poço numa placa de 48 poços e incuba-se a cultura numa estufa a 37 ° C durante 15 minutos para solidificar.
15. Após 15 min, adicionar cuidadosamente 250 ul de meio de cultura suplementado com organ�de10 mM de nicotinamida, 10 uM e 10 uM Chir99021 Y27632. Pequenos fragmentos organ�de rompidas vai formar em pequenas Organóides císticas dentro de 24 horas.

Dia 5:

16. Actualizar médio e completar com um antibiótico de selecção (por puromicina, utilizar 4 ug / ml).

Dia 7:

17. Substituir médio por meio de cultura organóide standard, complementada com a seleção do antibiótico.
    NOTA: brotamento será completa de 2-3 semanas após a suspensão Chir99021. Após selecção, Organóides podem ser cultivadas sem selecção de antibiótico.

4. organ�de Preparação do RNA para RT-PCR quantitativo ou Microarray

1. Para a preparação de ARN, utilizar um kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante. Retirar o meio de Organóides e adicionar 350 mL de tampão RLT, suplementadas com β-mercaptoetanol em frente a cúpula da matrigel contendo Organóides. Volte a suspender as materiai em RLT pipetando usando p1000 micropipeta.
2. Realize mais prep RNA de acordo com o protocolo do fabricante.
3. Opcionalmente: aumentar a produção de RNA por amplificação utilizando o sistema Ovation Pico WTA, exigindo a entrada inicial de 50 mg de RNA total de acordo com o protocolo do fabricante.
4. Opcionalmente: para controle de qualidade antes de RNA microarray, as amostras são executados em um Bioanalyzer 2100 usando um chip nano RNA eukaryote totais, apontando para um número de integridade do RNA (RIN) de 8,5 ou mais (Figura 5), de acordo com o protocolo do fabricante.

5. O tratamento Organóides para inclusão em parafina e imuno-histoquímica

1. Antes do início da organ�de incorporação pré-aquecer um bloco de alumínio com furos de ajuste 12 milímetros tubos de vidro de diâmetro em estufa a 70 ° C para manter a parafina líquida.
2. Tome um único bem com Organóides adultas e remover o meio, deixando as Organóides embutidos intacta.
3. Adicionar 1 mlde 4% de paraformaldeído em PBS e linear para fixar bem a 4 ° C em qualquer lugar a partir de 1 hora até durante a noite.
4. Substituir paraformaldeído com 1 ml de PBS gelado.
   Opcionalmente: Organóides manter fixos em PBS até 1 semana a 4 ° C, após este passo.
5. Ressuspender Organóides fixos em 1 ml de PBS e colocar em frascos de vidro.
6. Deixe Organóides afundar para baixo durante 1 min, decanta-se PBS e substituir com etanol a 70%, em que um par de gotas de solução de eosina são dissolvidos para permitir a visualização de Organóides todo o processo de incorporação.
7. Deixar Organóides em etanol a 70% à temperatura ambiente. Após 30 min, remover o etanol 70% por decantação com cuidado, ser capaz de visualizar os Organóides por olho por causa de cor ligeiramente rosada eosina. Substituir a incorporação de solução com 96% de etanol.
8. Repetir o passo 5.7, substituindo cada vez que a incorporação da solução com o seguinte. Organóides passar através das seguintes soluções: posteriormente, etanol a 70%, etanol 90%, etanol 96%, 100% ethanol, etanol a 100%, xileno, xileno.
9. Decantar a última lavagem xileno e despeje parafina para dentro do tubo. Colocar imediatamente o tubo no bloco de alumínio pré aquecido a 70 ° C durante 30 min e substituir com parafina nova limpeza da parafina.
10. Despeje parafina off e pipeta Organóides no molde bloco de parafina usando um pré-aquecido pipeta Pasteur com grande abertura. Mantenha Pasteur pipeta morna usando um bico de Bunsen. Coloque todos os Organóides no molde de bloco de parafina em uma pequena camada de parafina líquida.
11. Tanto quanto possível, tentar manipular todas Organóides para o centro do molde de bloco de parafina, utilizando uma agulha de dissecção aquecido. Mantenha dissecção agulha quente usando bico de Bunsen.
12. Quando localização de Organóides no molde é satisfatória, molde a chill ligeiramente para solidificar a camada de parafina.
13. Termine o bloco derramando mais de parafina na parte superior e adicione uma cassete incorporação histológica convencional.

Resultados

Transdução lentiviral organóide

A técnica de transdução organóide utilizando partículas de lentivírus depende manipulação correta de Organóides antes e durante a transdução. Organóides (Figura 3A) foram cultivadas e foram interrompidas em criptas individuais (Figura 3B). Como relatado anteriormente, estes criptas individuais, quando cultivadas na presença do inibidor de GSK3 Chir99021 tornou criptas císticas ⁹ (Fi...

Discussão

O protocolo de vídeo actual descreve transdução lentiviral de Organóides de epitélio intestinal primária e análise a jusante destas Organóides RNA utilizando técnicas quantitativas e imuno-histoquímica.

Transdução de lentivírus é freqüentemente realizada em células aderentes ou flutuantes em placas de cultura. Uma vez que a estrutura tridimensional de Organóides torna difícil de penetrar por partículas virais, um número de métodos para aumentar a eficácia são utilizado...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyethylene imine	Polysciences	23966-2
DMEM medium	Lonza	BE12-614F
Fetal calf serum	Lonza	DE14-801F
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Glutamin	Invitrogen	25030-024
matrigel	BD	BD 356231
Advanced DMEM-F12	Gibco	12634-010
N2	Invitrogen	17502-048
B27	Invitrogen	17504-044
N-acetyl cysteine	Sigma	A9165-1G
mouse Egf	Invitrogen	PMG8045
Hepes 1 M	Invitrogen	15630-056
glutamax 100x	Invitrogen	35050-038
Chir 99021	Axon	1386
Y27632	Sigma	Y0503-5MG
polybrene	Sigma	107689
nicotinamide	Sigma	N0636
Trypsin	Lonza	BE02-007E
puromycin	Sigma	P 7255
Rneasy mini kit	Qiagen	74106
β-mercaptoethanol	Merck	8,057,400,250
Ovation Pico WTA system	NuGen	3300-12
paraformaldehyde	Sigma	252549-1L
glass vial conical 12 mm x 75 mm 5 ml	VWR	LSUKM12
Eosin Yellowish	VWR	1,159,350,025