Протокол Lentiviral трансдукции и вниз по течению анализа заболеваемости кишечными органоиды

Резюме

In this video protocol we give a step by step explanation of lentiviral transduction in organoids of primary intestinal epithelium and of processing and downstream analysis of these cultures by quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry.

Аннотация

Intestinal crypt-villus structures termed organoids, can be kept in sustained culture three dimensionally when supplemented with the appropriate growth factors. Since organoids are highly similar to the original tissue in terms of homeostatic stem cell differentiation, cell polarity and presence of all terminally differentiated cell types known to the adult intestinal epithelium, they serve as an essential resource in experimental research on the epithelium. The possibility to express transgenes or interfering RNA using lentiviral or retroviral vectors in organoids has increased opportunities for functional analysis of the intestinal epithelium and intestinal stem cells, surpassing traditional mouse transgenics in speed and cost. In the current video protocol we show how to utilize transduction of small intestinal organoids with lentiviral vectors illustrated by use of doxycylin inducible transgenes, or IPTG inducible short hairpin RNA for overexpression or gene knockdown. Furthermore, considering organoid culture yields minute cell counts that may even be reduced by experimental treatment, we explain how to process organoids for downstream analysis aimed at quantitative RT-PCR, RNA-microarray and immunohistochemistry. Techniques that enable transgene expression and gene knock down in intestinal organoids contribute to the research potential that these intestinal epithelial structures hold, establishing organoid culture as a new standard in cell culture.

Введение

Кишечного эпителия является одним из самых быстро размножающихся тканях организма, что вызвало это, чтобы привлечь широкий интерес со изучению рака и стволовых клеток. В 2009 методика была опубликована генерировать длительные культуры малочисленных кишечных крипт в матригеле, сохраняя в 3 трехмерную структуру ^1. Эти структуры, называемые кишечные органоиды, можно культивировать с использованием стандартных методик, с окружающей средой с добавлением нескольких определенных факторов роста, в том числе БМП-сигнализации ингибитора пути Noggin (Nog), Wnt-сигнального пути энхансер rspondin 1 (RSPO1) и эпидермальный фактор роста (EGF) всех найденных в целях повышения кишечной пролиферации ^2-4.

Органоиды превзойти традиционные линии раковых клеток в тех аспектах, что они немутированный, сохранили иерархию стволовых клеток, отображения нетронутыми сотовой поляризацию и выставочная дифференциации во всех линиях клеток, находящихся в зарождающейся небольшой Intestinal эпителий. Так как они могут быть трансдуцированных осуществлять трансгенов или РНК-интерференции создает ^5, они используются для изучения специфических генетических элементов, перевешивает эксперименты с использованием трансгенных мышей, в аспектах стоимости и скорости. Трансгенные выражение органоидам может быть выполнена с использованием либо мышиный ретровирусную или лентивирусов векторов ^6,7. Из-за ограничений мышиных ретровирусов, способных к трансдукции митотических клеток исключительно ^8, лентивирусов трансдукции чаще используется для клеток, которые трудно заразить, например, органоидам.

Виралли трансдуцированных и стабильно экспрессирующие трансгенные органоиды может быть использован для множества последующих анализов, в том числе количественный анализ РНК и иммуногистохимии. Взятые вместе, культура органоидов из первичных клеток эпителия кишечника превратилась в обычного метода, который легко реализовать без особых лабораторных требований, и стал роман стандарт CELL культура в исследованиях по кишечного эпителия.

Методы вирусного преобразования и последующей вниз по течению анализа в органоидов утомительны для выполнения и оказания помощи Органоид эксперименты мы получили это видео Протокола, с указанием методов лентивирусным трансдукции в культуре органоидов. Мы дополнительно показать, как корректная обработка органоидов может увеличить урожайность и, следовательно, повысить производительность ниже по течению анализа с использованием методов РНК или иммуногистохимии. В протоколе, органоиды, которые получены из небольших кишечных крипт были исключительно используются, хотя способы, описанные, могут быть применены к ободочной органоидам а.

протокол

1. Получение полиэтиленимина (PEI) в качестве реагента для трансфекции

1. Растворите приблизительно 150 мг PEI в 100 мл H ₂ O.
2. Отрегулируйте рН раствора до 7,4 добавлением HCl до тех пор, пока раствор не станет ясно, и размешать до полного растворения. Это может занять от 10 до 60 мин и добавить воду до конечного концентрации 1 мг / мл.
3. Когда ясно, профильтровать раствор PEI через стерильный фильтр 0,22 мкм и в магазине в -80 ° C морозильник в аликвоты по 5 мл.

2. Производство Lentiviral частиц

День 1:

1. Разделение HEK293T клетки на 60% -80% слияния в 162 см ² колбу или большой чашке Петри в клеточной линии культуральной среде (DMEM с добавлением 10% FCS, 1% пенициллина / стрептомицина и 2 мМ глутамина добавки).

День 2:

2. Подготовка ДНК для трансфекции раствора, содержащего 45 мкг тотальной ДНК плазмиды путем сложениялентивирусов упаковки векторы (7 мкг на pVSVg; 5 мкг ВКПП оборот; 13 мкг на pMDL) и 20 мкг лентивирусов плазмиды, кодирующей интересующий ген или shRNA интереса. Регулировка до объема 1 мл, используя DMEM.
3. Подготовка PEI трансфекции раствора добавлением 90 мкл 1 мг / мл PEI в 930 мкл DMEM и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
4. Добавить ДНК трансфекции решение к решению PEI. Вихревой или инвертировать несколько раз и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы получить раствор ДНК трансфекции.
5. Капельное 2 мл трансфекции ДНК раствор на HEK293T клеток и инкубируют в течение 4 часов в увлажненной инкубаторе для клеточных культур на 37 ° C.
6. После 4 ч, обновить культуральной среды, чтобы удалить PEI. Это не нужно мыть клетки перед добавлением новую среду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: пей цитотоксические и инкубации раз дольше, чем 4 часа может причинить вред HEK293T клеток.

День 4:

7. Замените Супеrnatant с новой культуральной среды. Держите супернатант (содержащие вирус); это будет использоваться на этапе 2,10.
8. Поместить супернатант в 15 мл колбу. Чтобы удалить отмершие клетки, центрифуги в течение 5 мин при 500 х г.
9. Нажмите супернатант через фильтр 0,45 мкм с помощью большого 60 мл шприц. Хранить в течение ночи при 4 ° С.

День 5:

10. Соберите вторую партию супернатанта; центрифуги и фильтр, как на этапах 2,8-2,9.
11. Бассейн Супернатанты из шагов 2,9 и 2,10 в Ультрацентрифуга труб и центрифуге при 50000 х г в ультрацентрифуге в течение 90 мин.
12. Выньте капсулы очень тщательно, содержащие ультрацентрифуга трубы и поставить в ламинарном потоке, вспоминая ориентацию трубы внутри центрифуги.
13. Открытый капсулы проведения ультрацентрифужную пробирку и тщательно декантируйте среду таким образом, что осадок на верхней стороне трубы. Поскольку вирусные гранулы могут быть трудно представить себе, помните о том, чтосторона трубки осадок будет сформирован. Возьмите микропипетку и удалить последнюю часть среды, заботясь, чтобы не волновать непрозрачный коричневый осадок, который виден на стороне нижней части ультрацентрифужную трубки.
14. Ресуспендируют этот осадок в 500 мкл культуральной среды Органоид с добавлением 10 мМ никотинамида, 10 мкМ Chir99021, 10 мкМ Y27632 и 8 мкг / мл полибрена. Ресуспендирование в этой среде очень важно, поскольку вируса с высоким титром используется для transduct органоиды непосредственно.
15. Дополнительно: заморозить вирус в этой среде аликвоты в двух пакетах по 250 мкл в -80 ° С.

3. Lentiviral Трансдукция органоиды

День 0:

1. Сплит полный 0,95 см ² колодец органоидов за два дня до трансдукции в новой скважины, с целью получения примерно 50 небольших органоиды. Разделение органоиды соответствии с ранее опубликованным протоколом ¹ (фиг 3а, б).
2. Дополнение Органоид культуральной среды с 10 мкМ Chir99021 и 10 мМ никотинамида, чтобы получить кистозный гипер-пролиферативных склепы (рис 3в).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кистозные склепы будут развиваться лучше, когда только что раскол органоиды выращивают в присутствии Chir99021.

День 2:

3. Урожай органоиды с помощью пипетки вверх и вниз по матригеле и среды, тем самым нарушая смеси с P1000 микропипеткой. Поместите смесь в 15 мл пробирку.
4. Лишить дальнейшего использования Пастера пипетки, в котором дистальное отверстие была снижена путем плавления. Центрифуга органоиды для осаждения в течение 5 мин при 100 х г.
   Примечание: В зависимости от размера центрифуги, использовать другую скорость центрифуги. Необходимо найти точное значение скорости, в котором нарушено органоиды отделены от смеси.
5. Удалить супернатант и добавить 500 мкл подогретого 1x трипсина (по аналогии с 0,25% трипсина). Ресуспендируют органоиды в трипсин и инкубировать3 мин на водяной бане 37 °.
6. Деактивировать трипсина путем добавления 3,5 мл клеточной линии культуральной среде (DMEM, дополненной 10% FCS, 1% пенициллина / стрептомицина и глутамина). Центрифуга в течение 5 мин при 500 х г.
7. Удалить супернатант, чтобы оставить осадок в приблизительно 20 мкл среды. Передача органоиды в этом последнем небольшом количестве среды в скважине на 48 скважин пластины.
8. Добавить высоком титре лентивирус в передаче среде, как описано в шаге 2,14, ресуспендируют и перейдите к шагу 3,10. При встрече низкую эффективность трансдукции, шаг 3,9 могут быть добавлены.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для эффективной трансдукции, как правило, добавить одну аликвоту 250 мкл с высоким титром лентивирусом в одну лунку органоидов. Это представляет 50% всех собранных лентивирусом от одного производства, как описано в шаге 2 этого протокола.
9. Дополнительно: для повышения трансдукции эффективность, выполните spinoculation, поставив 48-луночного планшета, содержащие органоиды в предварительно нагретой центрифуги на 326; С и ​​вращаются на 600 мкг в течение 1 часа.
10. Поместить Органоид вирусов смеси в культуральной инкубатора и инкубировать в течение 1 часа при 37 ° С в питательной инкубаторе, чтобы трансдукции.
11. Дополнительно: для дальнейшего повышения эффективности трансдукции, инкубировать органоиды еще 3 ч при 37 ° С в питательной инкубаторе.
12. Добавить 1 мл Органоид культуральной среде и ресуспендируют Органоид вирусов смесь, трансфер в микроцентрифужных трубки и центрифуги в микроцентрифуге 5 мин при 850 мкг для осаждения органоиды.
13. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 20 мкл охлажденного льдом Матригель. Так как материал затвердевает, когда он становится теплее, использовать наконечники пипеток, которые охлаждается с помощью пипетки вверх и вниз охлажденного льдом PBS в течение нескольких раз.
14. Поместите каплю в середине и в 48 скважин пластины и инкубировать в культуральной инкубаторе при 37 ° С в течение 15 мин, чтобы затвердеть.
15. Через 15 мин, осторожно добавить 250 мкл Органоид культуральной среде, содержащей10 мМ никотинамида, 10 мкМ Chir99021 и 10 мкМ Y27632. Небольшие разрушенные Органоид фрагменты формируются в небольших кистозных органоидов в течение 24 часов.

День 5:

16. Обновить средних и дополнить с выбором антибиотика (для пуромицином, используйте 4 мкг / мл).

День 7:

17. Замените среду для стандартного Органоид культуральной среде, дополненной выбора антибиотика.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Многообещающий будет завершена через 2-3 недели после Chir99021 вывода. После выбора, органоиды могут быть выращены без выбора антибиотика.

4. Органоид Получение РНК для количественного RT-PCR или Microarray

1. Для приготовления РНК, использования коммерческого набора в соответствии с протоколом производителя. Удалить среду из органоидов и добавить 350 мкл буфера RLT, дополняющие β-меркаптоэтанола прямо на куполе матригель, содержащий органоидов. Ресуспендируют материааль в RLT с помощью пипетки с помощью P1000 микропипетку.
2. Выполните дальнейшие РНК приготовительные в соответствии с протоколом производителя.
3. Дополнительно: увеличить РНК урожай на амплификации с использованием системы Ovation Pico WTA, требуя первоначальный вклад в 50 мкг общей РНК в соответствии с протоколом производителя.
4. Дополнительно: для контроля качества до РНК микрочипов, запускать образцы на 2100 Bioanalyzer, использующие эукариотов общей РНК нано чип, стремясь к номеру целостности РНК (РИН) 8,5 или более (рис 5) в соответствии с протоколом производителя.

5. Обработка органоиды для парафин и иммуногистохимии

1. До начала Органоид вложения предварительно нагреть алюминиевый блок с отверстиями подходящие 12 мм Диаметр стеклянных трубок в инкубаторе при 70 ° С, чтобы парафин жидкий.
2. Возьмите одну скважину Матерый органоидов и снимите среду, оставляя встроенные органоиды нетронутыми.
3. Добавить 1 мл4% параформальдегида в PBS прямо так и исправить при 4 ° С в пределах от 1 ч до в течение ночи.
4. Замените параформальдегида с 1 мл ледяного PBS.
   Дополнительно: сохранить фиксированные органоиды в PBS до 1 недели при 4 ° С после этого шага.
5. Ресуспендируют фиксированные органоиды в 1 мл PBS и поместить в стеклянную пробирку.
6. Пусть органоиды опускаются на дно в течение 1 мин, декантируют PBS и заменить 70% -ным этанолом, в котором пару капель раствора эозина растворенного чтобы позволить визуализацию органоидам в течение всего процесса погружения.
7. Оставьте органоиды в 70% -ном этаноле при комнатной температуре. Через 30 мин удалить 70% этанола, тщательно декантируют, будучи в состоянии визуализировать органоиды на глаз из-за незначительного розоватого цвета эозином. Заменить вложение раствор с 96% -ным этанолом.
8. Повторите шаг 5,7, каждый раз заменяя вложение решение со следующей. Проход через органоиды следующих растворов: впоследствии 70% -ным этанолом, 90% этанолом, 96% этанолом, 100% ETHAнол, 100% этанола, ксилол, ксилол.
9. Слейте последний ксилола мыть и залить парафином в трубку. Поместите трубку непосредственно в предварительно нагревают алюминиевым блоком при 70 ° С в течение 30 мин и заменить парафин с новой чистой парафина.
10. Налейте парафин с и пипетки органоиды в парафиновый блок форму, используя предварительно нагретой Пастера пипетки с большим отверстием. Держите Пастера пипетки теплым, используя горелку. Поместите все органоиды в парафиновый блок пресс-формы в небольшом слое жидкого парафина.
11. Насколько это возможно, пытаются манипулировать все органоиды в направлении центра парафинового блока пресс-формы с помощью нагретого рассечение иглу. Держите рассечение иглы тепло с помощью горелка Бунзена.
12. Когда локализация органоидов в форме удовлетворительное, кокиль слегка затвердеть слой парафина.
13. Закончите блок, подливая керосин сверху и добавить стандартную гистологическую вложение кассету.

Результаты

Органоид лентивирусный трансдукции

Техника Органоид трансдукции с использованием лентивирусные частицы зависит от правильного обращения с органоидов до и во время трансдукции. Органоидам (3А) культивировали и они были разрушены на отдельные крипт (ф...

Обсуждение

Протокол ток ролик описывает Lentiviral трансдукции органоидов из первичного кишечного эпителия и вниз по течению анализа этих органоидов, используя количественные методы РНК и иммуногистохимии.

Lentiviral трансдукция часто выполняется в прикрепленных или плавающих клеток в к...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyethylene imine	Polysciences	23966-2
DMEM medium	Lonza	BE12-614F
Fetal calf serum	Lonza	DE14-801F
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Glutamin	Invitrogen	25030-024
matrigel	BD	BD 356231
Advanced DMEM-F12	Gibco	12634-010
N2	Invitrogen	17502-048
B27	Invitrogen	17504-044
N-acetyl cysteine	Sigma	A9165-1G
mouse Egf	Invitrogen	PMG8045
Hepes 1 M	Invitrogen	15630-056
glutamax 100x	Invitrogen	35050-038
Chir 99021	Axon	1386
Y27632	Sigma	Y0503-5MG
polybrene	Sigma	107689
nicotinamide	Sigma	N0636
Trypsin	Lonza	BE02-007E
puromycin	Sigma	P 7255
Rneasy mini kit	Qiagen	74106
β-mercaptoethanol	Merck	8,057,400,250
Ovation Pico WTA system	NuGen	3300-12
paraformaldehyde	Sigma	252549-1L
glass vial conical 12 mm x 75 mm 5 ml	VWR	LSUKM12
Eosin Yellowish	VWR	1,159,350,025