Gleichzeitige PET / MRT-Bildgebung während Maus zerebrale Hypoxie-Ischämie

Zusammenfassung

Das hier vorgestellte Verfahren verwendet die gleichzeitige Positronenemissionstomographie und Magnetresonanztomographie. In der zerebrale Hypoxie-Ischämie-Modell, dynamischen Veränderungen in Verbreitung und Glukosestoffwechsel während und nach der Verletzungsgefahr. Die sich entwickelnde und reproduzierbaren Schäden in diesem Modell erfordert simultane Erfassung, wenn sinnvolle multimodaler Bildgebungsdaten erworben werden sollen.

Zusammenfassung

Dynamische Veränderungen in der Gewebewasserdiffusion und Glukosestoffwechsel während und nach der Hypoxie in zerebrale Hypoxie-Ischämie was eine bioenergetische Störung betroffenen Zellen vorkommen. Diffusionsgewichtete Magnetresonanztomographie (MRI) identifiziert Bereiche, die beschädigt sind, möglicherweise irreversibel durch Hypoxie-Ischämie. Veränderungen der Glucoseverwertung in das betroffene Gewebe durch Positronenemissionstomographie (PET) von 2-Deoxy-2- ⁽¹⁸ F) Fluor ᴅ-glucose ^([18 F] FDG) -Aufnahme erkennbar sein. Aufgrund des schnellen und variablen Natur der Verletzung in diesem Tiermodell muß Nahme der beiden Modi gleichzeitig Daten um PET und MRI-Daten zu korrelieren Bedeutung durchgeführt werden. Zusätzlich zur Variabilität der Tiere in der hypoxischischämischer Verletzungen durch Gefäß Unterschiede begrenzt die Fähigkeit, multimodale Daten zu analysieren und Veränderungen zu beobachten, um eine gruppenweise Ansatz, wenn die Daten nicht gleichzeitig in einzelnen Fächern erworben. Die Methode pübel hier erlaubt es, sowohl diffusionsgewichtete MRT und ^[18 F] FDG-Aufnahme Daten in der gleichen Tier vor zu erwerben, während und nach der hypoxischen Herausforderung, um unmittelbare physiologische Veränderungen zu verhören.

Einleitung

Weltweit ist Schlaganfall die zweithäufigste Todesursache und eine der Hauptursachen von Behinderung ^1. Die Kaskade von biochemischen und physiologischen Ereignisse, die während auftreten und akut nach einem Schlaganfall-Ereignis tritt schnell und mit Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit des Gewebes und letztlich Ergebnis ^2. Zerebrale Hypoxie-Ischämie (HALLO), die hypoxischischämischer Enzephalopathie (HIE) führt, wird geschätzt, dass bis zu 0,3% und 4% des Vollzeit-und Frühgeburten, die jeweils ^3,4 beeinflussen. Die Sterblichkeit bei Säuglingen mit HIE ist ca. 15% bis 20%. In 25% der HIE Lebenden, ergeben dauerhafte Komplikationen als Folge der Verletzung, einschließlich geistige Retardierung, motorische Defizite, Zerebralparese und Epilepsie ^3,4. Historische therapeutische Interventionen haben nicht würdig Annahme als Standard der Versorgung bewährt und Konsens noch nicht erreicht werden, dass die modernsten Methoden, basierend auf Hypothermie, sind eine effektive Senkung der Morbidität ^3,5. Weitere Themen of Behauptung gehören der Anwendung der Hypothermie und Patientenauswahl ^6. Daher sind Strategien für die Neuroprotektion und neurorestoration noch ein fruchtbares Gebiet für die Forschung ^7.

Rattenmodellen der zerebralen HALLO Verfügung standen seit den 1960er Jahren, und in der Folge wurden Mäusen ^8,9 angepasst. Aufgrund der Art des Modells und dem Ort der Ligation wurde es inhärente Variabilität in den Ergebnissen aufgrund der Differenz in Kollateralfunktion zwischen Tieren ^10. Als Ergebnis neigen diese Modelle zu mehr variable Vergleich zu ähnlichen Modellen wie mittleren Zerebralarterie (MCAo). Echtzeitmessung der physiologischen Veränderungen mit Laser-Doppler-Flußmessung sowie diffusionsgewichtete MRI ¹¹ gezeigt. Die beobachtete intra Variabilität der Tiere in der zerebralen Blutflusses während und unmittelbar nach der Hypoxie sowie bei akuten Ergebnisse wie Infarktvolumen und neurologischenDefizit, legen nahe, dass die gleichzeitige Erfassung und Korrelation der multimodalen Daten von Vorteil wäre.

Jüngste Fortschritte in der simultane Positronenemissionstomographie (PET) und Magnetresonanztomographie (MRI) haben neue Möglichkeiten in der präklinischen Bildgebung ^12-14 erlaubt. Die potenziellen Vorteile dieser Hybrid, kombinierte Systeme für präklinische Anwendungen sind in der Literatur beschrieben worden ^15,16. Zum Beispiel, wenn jede Instanz eines Ereignisses wie Schlaganfall zeigt sich eindeutig, mit sich schnell entwickelnden Pathophysiologie - - Während viele präklinischen Fragen können durch eine individuelle Tier sequentiellen Bildgebung oder durch Abbildung getrennten Tiergruppen, bestimmte Situationen zu richten machen es wünschenswert und sogar notwendig zur gleichzeitigen Messung zu verwenden. Funktionelle Bildgebung stellt ein solches Beispiel, bei gleichzeitiger 2-deoxy-2- ⁽¹⁸ F) Fluor ᴅ-glucose ^([18 F] FDG) PET und blood-Sauerstoff-Niveau abhängige (BOLD) MRI hat vor kurzem in der Ratte Whisker Stimulation nachgewiesen sucht ^14.

Hier zeigen wir, gleichzeitige PET / MRT-Bildgebung bei Ausbruch einer hypoxisch-ischämischen Schlaganfall, in dem Gehirnphysiologie ist nicht in einem stabilen Zustand, sondern wird schnell und irreversibel zu ändern während der hypoxischen Herausforderung. Veränderungen der Wasserdiffusion, wie durch MRI gemessen und von der scheinbaren Diffusionskoeffizienten (ADC) von diffusionsgewichteten Bildgebung (DWI) abgeleitet quantifiziert, ist gut für einen Schlaganfall in der klinischen und präklinischen Daten ^17,18 gekennzeichnet. In Tiermodellen, wie MCAo, Diffusion von Wasser in den betroffenen Hirngewebe schnell abfällt aufgrund der bioenergetischen Kaskade, die zu zytotoxischen Ödem ^18. Diese akuten Veränderungen der ADC sind auch in Nagetiermodellen der zerebralen Hypoxie-Ischämie ^11,19 beobachtet. ^[18 F] FDG-PET-Bildgebung wurde bei Schlaganfallpatienten verwendet worden, um Änderungen in der lokalen gl bewertenucose Metabolismus ^{20 und eine} kleine Anzahl von in vivo-Tierstudien wurden ebenfalls verwendet ^[18 F] FDG ^21, auch im cerebralen Hypoxie-Ischämie-Modell ^22. Im Allgemeinen zeigen diese Studien verringerte Glukoseverwertung in ischämischen Regionen, obwohl eine Studie mit einem Modell mit Reperfusion fand keine Korrelation dieser Stoffwechselveränderungen mit späteren Infarktentwicklung ^23. Dies steht im Gegensatz zu Diffusions Veränderungen, die mit der irreversibel geschädigten ^Kerns 21 in Verbindung gebracht wurden. Somit ist es wichtig, dass die komplementäre Information von ^[18 F] FDG PET und DWI in einer simultanen Art und Weise während der Entwicklung des Hubes ermittelt zu erhalten, da dies wahrscheinlich um aussagekräftige Informationen über das Fortschreiten der Schädigung und den Auswirkungen ergeben therapeutische Interventionen. Die Methode, die wir hier beschreiben, ist leicht zugänglich, um mit einer Vielzahl von PET-Tracern und MRT-Sequenzen zu verwenden. Zum Beispiel ^[15 O] H _{2 O} PETBildgebung mit DWI und Perfusions-Wichtung (PWI) von MRI verwendet werden, um weiter zu erforschen die Entwicklung der ischämischen Penumbra und Validierung aktuellen Techniken innerhalb des Hubes Abbildungsfeldes werden.

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Protokoll

Alle Tier Handhabung und Verfahren hierin beschrieben, und nach dem Tierversuch: Berichterstattung in vivo Experimente (kommen) Richtlinien, wurden in Übereinstimmung mit Protokollen, die von der Vereinigung zur Bewertung der Akkreditierung von Laboratory Animal Care genehmigt durchgeführt (AAALAC) International akkreditiert Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der University of California, Davis. Korrekte Operation sollte nicht bei Anzeichen von Schmerzen oder Beschwerden im Tier führen, aber richtigen Schritte zu ergreifen, wenn diese Zeichen beobachtet, einschließlich Verabreichung von Analgetika oder in einigen Fällen, Euthanasie werden. Die rechte Seite der Tiere wurde willkürlich für die beschriebene einseitige Verfahren ausgewählt.

1. Einseitige Arteria carotis communis (CCA) Ligation

1. Bereiten Sie sterile Feld mit sterilisierten chirurgischen Werkzeugen und Materialien bietet eine optimale Lage. Sicherzustellen Heizkissen auf 37 ° C mit Temperaturfühler sicher auf der Unterlage platziert erwärmt. & #160; Achten Sie darauf, einen sterilen Tuch verwenden, um die Operationsstelle zu decken.
2. Anesthetize Tier (Isofluran, 1-3% in Luft bei 0,5 bis 1 l / min), und legen Tier in Rückenlage mit der Schwanz abgewandt. Überprüfen Betäubung durch Kneifen die Zehe - dies sollte keine Reaktion hervorzurufen, wenn das Tier richtig betäubt wird. Gelten Augensalbe für die Augen.
3. Bewerben Enthaarungscreme niedriger Hals bis oberen Brustbereich mit 1-2 Wattestäbchen. Warten Sie 1-3 Minuten, und entfernen Sie Haare und Creme mit nassen Gaze oder Alkoholtupfer. Swab Schnittbereich mit Betadine kreisförmig von innen nach außen und dann in sterile Handschuhe zu ändern.
4. Verwendung chirurgische Schere, einen Einschnitt von ca. 1 cm entlang der Mittellinie der unteren Hals. Außenhaut sorgfältig getrennt von umgebenden Faszie mit chirurgische Scheren.
5. Mit Hilfe von zwei Mikro McPherson Iris Nahtzange, trennen Sie die rechte Arteria carotis communis von Faszien, wobei darauf zu schädlichen Venen oder Stö vermeidenbing den Vagusnerv.
6. Verwendung der Zange auf der rechten exteriorisieren das Recht CCA in einer stabilen Position. Mehrere Tropfen Kochsalzlösung, um ein Austrocknen zu verhindern. Übergeben Sie eine geeignete Länge (2-3 cm) von 6-0 Seidennaht unter der rechten CCA und Ligat mit einem Doppel Kreuzknoten. Optional ligieren erneut mit einer zweiten Länge von 6-0 Seidennaht.
7. Positionieren rechten CCA und reinigen Sie die überschüssige Flüssigkeit zu öffnen mit einem sterilen Schwamm aus Tupfer. Schließen Sie den Schnitt mit 6-0 Seidennaht. Gelten Lidocain topisch bis 7 mg / kg.
8. Lassen Sie das Tier sich von der Anästhesie bis ambulanten (ca. 30 min) zu erholen und führen postoperative Überwachung, bis Tier ist bereit für die Bildgebung.

2. Vorbereitung Imaging: System- und Hardware-Checks

1. Richten Sie Hardware und Software für die MRT und PET-Systeme und prüfen deren Funktionalität wie folgt. Sicherstellen, dass alle physischen Verbindungen sind sicher und Software-Einstellungen entsprechend gewählt.
   1. Sicherstellen das PET-System ist bei der vorgeschriebenen Arbeitstemperatur von 5 ° C unter Verwendung der Luftkühlung.
   2. Berg PET-System innerhalb des MRI-Bohrung, Ausrichten des Sichtfeld (FOV) Zentren mit bekannten Achsversätzen PET und MRT. Montieren Sie die MRI Spule im Inneren der Bohrung des PET-Systems und in der Mitte der Spule mit dem PET-System und MRI-Magneten Zentren.
   3. Schalten Sie PET-Elektronik für Power und Vorspannung (Hinweis: Schritte werden nach Instrument variieren). Führen Sie eine schnelle (5 min) Scan mit einem ^{68 Ge} Zylinders und überprüfen Sie die resultierende Sinogramm, um sicherzustellen, alle Melder betriebsbereit sind.
   4. Optional zu erwerben Daten für eine PET / MRT-Transformationsmatrix für die Co-Registrierungszwecke verwendet werden: Füllen Sie eine dreidimensionale Phantom (zB drei gefüllte Kugeln) mit 200 & mgr; Ci ^{18 F} wässrigen Lösung und erwerben für 15 min mit PET. Erwerben anatomischen MRT-Daten: In der Scan-Steuerungsfenster, wählen Sie den Multi-Slice-Multi-Echo (KKMU) Sequenz (siehe Tabelle 1 ). Wiederholen Sie dies für alle drei Hauptausrichtungen: axial, sagittal und koronal.
2. Überprüfen Sie die Infusionspumpeneinstellungen und Bedienung. Die Pumpe auf 4,44 & mgr; l pro Minute, die in 45 min mit konstanter Infusion liefert ein Gesamtvolumen von 200 ul, die typische empfohlene Grenze für iv-Injektion in einer 20 g Tier.
3. Überprüfen Sie den Heizungsbetrieb und bestätigen, dass der Temperaturausgang ist ausreichend, um das Tier zu warm (37 ° C) zu halten. Überprüfen Sie, dass die Temperatur und die Atmungsüberwachung in Betrieb ist in Vorbereitung für Tier Platzierung auf der Tierbett.
4. Überprüfen Sie die Funktion der O _{2 und N 2} Durchflussmessern (0,5 l / min: _O 2 bei 57,2 mg / min und _N 2 bei 0,575 g / min) durch Einschalten sowohl mit der Druckluftquelle aus und O _{2 und N 2} Quellen auf. Um die Gefahr einer Beschädigung der Durchflussmesser zu vermeiden, schalten Sie sie auf ohne ausreichenden Eingangsdruck.
5. Stellen Sie sicher, dass Isofluran vaporizer ausreichend gefüllt ist. Vor der Bilderzeugung beginnen Isoflurananästhesie Strom bei 1-2% und 0,5 bis 1 l / min.
6. Bereiten Tierbett, indem sichergestellt wird, dass die Anästhesie, Atem Pad und Heizungssysteme sicher und funktionell positioniert. Zusätzliche PET / MRI Coausrichtung Genauigkeit Bezugsmarkierungen (beispielsweise Kapillarröhren mit Radiotracer bei einer ähnlichen Konzentration wie für die Bildgebung injiziert gefüllt) kann dem Tier Betts innerhalb des Sichtfelds angehängt werden.

3. Imaging-Workflow

Nachdem alle notwendigen Geräte Kontrollen abgeschlossen sind, um Bildgebung wie folgt vorgehen:

1. Betäuben die Tiere mit Isofluran und legen Schwanzvenenkatheter (28 G-Nadel, PE-10-Schlauch weniger als 5 cm) mit heparinisierter Kochsalzlösung gefüllt ist (0,5 ml Heparin, 1.000 USP / ml, in 10 ml Kochsalzlösung). Erwärmen des Tieres und / oder Schwanz kann Kathetereinführung Genauigkeit zu verbessern. Gegebenenfalls einen Tropfen Cyanacrylatkleber an der Insertionsstelleum die IV-Leitung zu sichern.
2. Übertragen Sie das Tier auf die vorbereitete Tierbett. Stellen Sie sicher, dass der Kopf des Tieres ist sicher, mit oberen Schneidezähne durch die Zahnstange und Ohr Bars gesichert an Ort und Stelle, wenn verwendet.
3. Bewerben Augensalbe die Augen, um ein Austrocknen zu verhindern. Legen Rektalsonde Thermometer. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur und Atmung Lesungen sind funktional.
4. Ca. 3 m für PE-10 Schläuche und einem Volumen von 200 ul - Erstellung der Radiotracer-Dosis (etwa 600 & mgr; Ci in 200 & mgr; l) in heparinisierten PE-Schlauch 10 von geeigneter Länge gespritzt werden. Verbinden Sie ein Ende des Schlauchs in die Infusionspumpe Spritzen, und die andere in die Schwanzvene Katheterleitung, kümmert sich nicht um Punktionen in der Rohrleitung zu schaffen.
5. Schieben Sie den Tierbett nach vorne in die Bohrung des Magneten, was sicher nicht, um die Positionierung des MRI-Spule und keine Leitungen oder Kabel, insbesondere die Betäubung Schläuche stören. Sicherzustellen, dass die Mitte des Gehirns mit den Zentren der M ausgerichtetRI Spule, PET-System, und MRI-Magneten.
6. Führen Tuning und Matching des MRI-Spule durch Drehen der Einstellknöpfe an der Spule, die Minimierung Impedanz (Check Spulendaten) und Frequenz (300 MHz ^für 1 h bei 7 Tesla) Fehlanpassungen durch Beobachtung der Anzeige der hohen Leistung Vorverstärker.
7. (MRI) Nach Tuning und Matching, erwerben eine Erkundungsbild: Wählen Sie ein RARE TriPilot Sequenz und führen Sie die Sequenz aus dem Scan-Steuerungsfenster. Überprüfen Positionieren des Tieres, das Wiederholen der Schritte 3.5 und 3.6 nach Bedarf. Unterlegscheiben zurücksetzen Nullwert.
8. (MRI) Erwerben Sie eine lokalisierte, zeigen aufgelöste spektroskopische Abtastung (PRESS) in einem Volumen innerhalb des Gehirns: Führen Sie einen PRESS-Sequenz (siehe Tabelle 1) in einem rechteckigen Volumen mit den Abmessungen 3,9 mm x 6 mm x 9 mm. Prüfen Wasserlinienbreite unter Verwendung der Makrobefehl CalcLineWidth. Wenn die volle Breite bei halbem Maximum (FWHM) Wert akzeptabel ist (zB 0,2 ppm), weiter zu Schritt 3.10. Wenn nicht, fahren Sie mit Schritt 3.9.
9. (MRI) Erwerben Sie ein Feld Karte: Führen Sie einen FieldMap Folge (siehe Tabelle 1). Verwenden Sie die resultierenden Daten für eine Mehrfachwinkel-Projektions Shim (MAPSHIM), indem Sie den Makrobefehl MAPSHIM und Auswahl von linearen und zweiter Ordnung ^(z 2) lokale Anpassungen. Wiederholen Sie Schritt 3.8.
10. (MRI) Positionieren Sie den Slice-Plan für die DWI-Scan (siehe Tabelle 1): mit der Geometrie-Editor, stellen Sie sicher, dass der Erwerb FOV positioniert ist, um die gewünschte Lautstärke von Interesse innerhalb des Gehirns zu erwerben. Wenn die resultierende Schichtplan wird wie gewünscht ausgerichtet ist, kopieren Sie diese Scheibe Plan im Scan-Steuerungsfenster für alle nachfolgenden DWI-Scans. Beginnen Erwerb.
11. (PET) mit dem PET-Akquisition vorbereitet und bereit zu beginnen, starten Sie den Infusionspumpe. Nach der vorgegebenen Verzögerung, in der Kochsalzlösung aus dem Katheter injiziert worden ist, beginnt die PET-Akquisition (siehe Tabelle 1), um das Eindringen von Radiotracer zu erfassen. Überwachen Sie die Impulsrate und nach schrittweise Erhöhungin Zählungen bezeichnend für eine erfolgreiche Injektion.
12. Nach 10-15 min, initiieren die hypoxische Herausforderung gleichzeitig mit Schritt 3.12. Zu initiieren hypoxischen Herausforderung, schalten Sie medizinische Luftstrom und sofort einschalten O _{2 und N 2} Durchflussmesser mit den vorgegebenen Einstellungen zu 8% Sauerstoff und 92% Stickstoff zu liefern, und Isofluran zu reduzieren, um 0,8%. Nicht ein- Durchflussmesser ohne Eingangsdruck.
13. (MRI) Zur gleichen Zeit wie Schritt 3.12, beginnen DWI Nahme in Schritt 3.10 vorbereitet (Scan "H1").
14. (MRI) Start DWI Erfassung (Scannen "H2"), die in Schritt 3.10 bereit, sofort nach dem Scan-H1 ist abgeschlossen. End hypoxischen Herausforderung durch Ausschalten Durchflussmessern, die Wiederherstellung der medizinischen Luftstrom, und die Rückkehr Isofluran-Konzentration auf einen geeigneten Wert, basierend auf physiologischen Überwachungs.
15. (MRI) Erwerben Sie ein Post-Hypoxie DWI-Scan in Schritt 3.10 vorbereitet. Schalten Sie die Infusionspumpe nach diesem Scan abgeschlossen.
16. (MRI) Acquire anatomical Bilder in axialer und sagittaler Ebene. In der Scan-Steuerungsfenster - wählen Sie das KKMU-Sequenz (siehe Tabelle 1). Verwendung des Geometrie Editor, stellen Sie sicher, dass der Erwerb FOV umfasst das Gehirn.
17. Entfernen Tier, kehren Sie zu Käfig, wenn die ambulante und Überwachung auf Anzeichen von Morbidität, euthanizing ggf. mit der Verabreichung von _CO 2 durch Genickbruch folgte als Sekundärverfahren.

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Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt das Ergebnis eines korrekten Ligation der Arteria carotis communis, vor dem Schließen der Wunde mit 6-0 Seidennaht.

Bei diesem Verfahren werden Daten von Abbildungs ​​erhaltenen stark abhängig von der zeitlichen Anordnung des Versuchs, der wiederum bestimmt, und wird auch durch experimentelle Grenzen einschließlich Bilderfassungssysteme und Geräteanordnung diktiert. Diese und andere Aspekte werden in der Diskussion Abschnitt erforscht. Mit dem hier ...

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Diskussion

Gleichzeitige anatomischen MRT und dynamische DWI-MRT und ^[18 F] FDG-PET-Daten wurden erfolgreich von Versuchstieren während der hypoxischen Herausforderung folgenden Arteria carotis communis Ligation erworben. Dies stellt eine leistungsfähige experimentelle Paradigma für die multimodale Bildgebung des sich schnell entwickelnden Pathophysiologie mit ischämischer Beleidigungen im Gehirn und könnte ohne weiteres auf andere PET-Radiotracer (zB Marker Neuroinflammation) und MRT-Sequenzen, sowie die Auswirkun...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgery
Surgical scissors	Roboz	RS-5852
Forceps	Roboz	RS-5237
Hartman mosquito forceps	Miltex	7-26
2x McPherson suturing forceps, 8.5 cm	Accurate Surgical & Scientific Instruments	4473	It is useful to reduce the opening width with a band on the forceps used to hold the carotid artery
6-0 silicone coated braided silk suture with 3/8 C-1 needle	Covidien Sofsilk	S-1172
Homeothermic blanket system	Harvard Apparatus	507220F
Super glue	(Generic)
Hypoxia
Flowmeter for O2	Alicat Scientific	MC-500SCCM-D
Flometer for N2	Alicat Scientific	MC-5SLPM-D
O2 meter	MSA	Altair Pro
Imaging
7.05 Tesla MRI System	Bruker	BioSpec	20 cm inner bore diameter with gradient set. Paravision 5.1 software.
Volume Tx/Rx 1H Coil, 35 mm ID	Bruker	T8100
PET system	(In-house)		4x24 LSO-PSAPD detectors, 10x10 LSO array per detector, 1.2 mm crystal pitch and 14 mm depth. 14 x 14 mm PSAPD. FOV: 60x35 mm. 350-650 keV energy window. 16 nsec timing window.
Vessel cannulation Dumont forceps	Roboz	RS-4991
PE-10 polyethylene tubing	BD Intramedic	427401
Infusion pump	Braintree Scientific	BS-300
Animal monitoring & gating equipment	Small Animal Instruments Inc.	Model 1025	Only respiration monitoring used
Animal bed with temperature regulation	(In-house)