Isolierung von Neural Stamm- / Vorläuferzellen aus dem Periventrikuläre Region der erwachsenen Ratte und Human Spinal Cord

Zusammenfassung

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Zusammenfassung

Erwachsenen Ratte und menschlichen Rückenmarks neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen (NSPC) in Wachstumsfaktor-angereicherten Medium kultiviert ermöglicht die Proliferation von multipotenten, selbst erneuernden und erweiterbar neuralen Stammzellen. Im Serum Bedingungen wird diese multi NSPC unterscheiden, Erzeugen Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Das geerntete Gewebe wird enzymatisch in einer Papain-EDTA-Lösung dissoziiert und dann mechanisch dissoziiert und in einem diskontinuierlichen Dichtegradienten getrennt, um eine Einzelzellsuspension, die in Neurobasalmedium mit dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) ergänzt, basischen Fibroblastenwachstumsfaktor plattierende Ausbeute (bFGF ) und Heparin. Erwachsenen Ratte Rückenmark NSPC sind als freischwebende Neurosphären und menschlichen Rückenmark NSPC Erwachsenen kultiviert werden als adhärente Kulturen angebaut. Unter diesen Bedingungen Erwachsenen Rückenmarks NSPC proliferieren express Marker von Vorläuferzellen, und kann kontinuierlich beim Durchgang ausgedehnt werden. Diese Zellen können be suchten in vitro als Reaktion auf verschiedene Reize, und exogene Faktoren können verwendet werden, um Linienbeschränkung zu fördern, um neuronale Stammzelldifferenzierung zu untersuchen. Multi NSPC oder deren Nachkommen können auch in verschiedenen Tiermodellen transplantiert werden, um Wiederaufbaureparatur zu bewerten.

Einleitung

NSPC sind multipotente Zellen in das neuronale Abstammungslinie, die sich selbst erneuern kann und leicht in vitro auszuweiten. Wir bezeichnen diese Zellen als eine gemischte Population von neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen, da sie Eigenschaften von sich selbst erneuernden multipotenten Stammzellen und Vorläuferzellen beschränkt anzuzeigen. NSPC sowohl in der fötalen und adulten Gehirn und Rückenmark ^1,2 gefunden. Beim Erwachsenen sind NSPC normale ruhende und aufzuhalten, in bestimmten Nischen einschließlich der Subventrikularzone entlang der Seitenventrikel ^2-4, und der periventrikulären Region um den Zentralkanal des Rückenmarks ^5,6.

Typischerweise werden NSPC als freischwebende Neurosphären oder als adhärente Monolagen in serumfreien Medium mit EGF und bFGF supplementiert, Mitogene, die für die Stammzellen / Vorläuferzellpopulationen durch kultiviert. Neurosphäre Assay ursprünglich von Reynolds und Weiss ² entwickelt, wird am häufigsten verwendet, und die KulturErweitern neuralen Stammzellen. NSPC zeigen Multipotenz, wenn sie in Wachstumsfaktor-haltigen serumfreien Medium ausplattiert, sich in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Multi kann selbst erneuernden NSPC isoliert und kultiviert werden vom erwachsenen Nager Rückenmarks, wenn das gezüchtete Gewebe umfasst Regionen des Zentralkanals ^6,7. Ein potentieller Vorteil der Verwendung NSPC des Erwachsenen Rückenmark und nicht zur Erstellung Zellen aus anderen Regionen erzeugt ist, dass diese gewebespezifischen Zellen am ähnlichsten Zellen im Rückenmark, die verloren gehen oder beschädigt werden, nach einer Verletzung oder Krankheit.

Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Neurosphären aus adulten menschlichen Rückenmark abgeleiteten nicht langfristig vermehrt oder passagiert, um eine ausreichende Anzahl von Zellen ^8,9 erzeugen. Jedoch mit Modifikationen in Kultivierungsbedingungen berichteten wir über die Ausdehnung und die Transplantation von adulten menschlichen Rückenmark stamm NSPC, was zeigt, dass selbst erneuerndenund multi NSPC aus erwachsenen menschlichen Rückenmark von Organtransplantation Spender ¹⁰ isoliert werden. In erster Linie die Entfernung des größten Teils der weißen Substanz bei der Präparation und Kultivierung dieser Zellen auf einem haftenden Substrat in Wachstumsfaktor-angereicherten Medium für proliferierende menschliche Wirbelsäule NSPC Erwachsenen gewählt. In diesem Protokoll beschreiben wir die Ernte des Rückenmarks von erwachsenen Ratte und aus menschlichen Organtransplantation Spender, Dissektion der periventrikuläre Gewebe und der Isolierung, der Kultur und den Ausbau der NSPC.

Protokoll

Alle Tierverfahren werden von der Animal Care Committee der Universität Health Network, Toronto ON Kanada zugelassen, in Übereinstimmung mit den Richtlinien im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durch die Canadian Council on Animal Care vorbereitet etabliert. Für die Ernte der menschlichen Rückenmarksgewebe, wurde die Genehmigung der University Health Network Research Ethics Verwaltungsrat und von der Trillium-Gift of Life Foundation, die Organspende in Ontario, Kanada beaufsichtigt erhalten.

1. Herstellung von Dissection Puffer und Kultur Medien

1. Für die Isolierung von Rattenrückenmark, bereiten 100 ml Dissektion Puffer (1x PBS + 0,6% Glucose + 2% Penicillin-Streptomycin) und im Kühlschrank lagern. Für den menschlichen Rückenmark vorbereiten 100 ml Dissektion Puffer (1x HBSS + 0,6% Glucose + 2% Penicillin-Streptomycin) und im Kühlschrank lagern.
2. Vorbereitung 100 ml serumfreies Medium (SFM) und warm bei 37 ° C. Um SFM vorzubereiten, fügen Sie 2 mM L-Glutamin, 100 ug / ml Penicillin-Streptomycin, 2% B27 und 10% Hormon Mix Neurobasal-A-Medium. Hormon-Mix anzusetzen, stellen eine 1: 1 DMEM / F12-Medium, das 0,6% Glucose, 3 mM NaHCO _3, 5 mM HEPES, 25 ug / ml Insulin, 100 ug / ml Apo-Transferrin, 10 & mgr; M Putrescin, 30 nM Selen, und 20 nM Progesteron.
3. Bereiten Sie die EFH Wachstumsfaktor-angereicherten Plattenmedien (zum SFM mit 20 ng / ml EGF, 20 ng / ml bFGF und 2 ug / ml Heparin) und warm bei 37 ° C. Stellen Sie sicher, dass die menschliche EFH enthält humanen rekombinanten Wachstumsfaktoren (siehe Tabelle der Materialien).

2. Holzernte und Dissektion der erwachsenen Ratte Periventrikuläre Rückenmarksgewebe

1. Sterilisieren Sezieren Instrumente in Ethanol und spülen in steriler Kochsalzlösung oder Autoklav Instrumente im Voraus. Geben rat (6-8 Wochen alt) eine tödliche Injektion von Natriumpentobarbital (1 cc bei 65 mg / ml) oder Überdosierung von Narkose (dh 4% Isofluran) nach einem Institut des genehmigten Tier Protokoll. DOuse die Rückseite der Ratte mit 70% Ethanol und entfernen Sie die Haut an der dorsalen Oberfläche mit großen Dissektion Schere.
2. Halten der Schere senkrecht zur dorsalen Fläche quer geschnitten die Wirbelsäule über die Hinterbeine. Verwenden Sie kleinere Schere längs geschnitten die Rückenmuskel über der Wirbelsäule in einem rostral Richtung, um die Dornfortsätze aus.
3. Beginnend an der exponierten kaudalen Ende, legen Sie Rongeure oder eine kleine stumpfe Knochenschneidinstrument extradural in der lateralen Seite des Spinalkanals in den Raum zwischen dem Rückenmark und Wirbelsäule. Machen Sie kleine Schnitte in die Lamina (knöcherne Bogen nach links und rechts von den Dornfortsätzen auf jeder Seite der Wirbel) und vorsichtig abziehen der Lamina des Rückenmarks (1A-D) aus. Stellen Sie sicher, der Winkel der Flügel flach ist und parallel zu der Schnur so die zugrunde liegende Rückenmark nicht beschädigt wird.
4. Weiter Laminektomie im rostralen Richtung Ausstellungene die Brust- und Halsmark.
5. Auszuschneiden vorsichtig das Rückenmark von der Wirbelsäule mit stumpfen Pinzette Gewebe und Nutzung Mikroschere, sorgfältig zu trennen, die Wurzeln, um das Kabel zu lösen. Legen Sie die ausgeschnittenen Rückenmark in eine Petrischale mit 4 ° C sterile Ratten Dissektion Puffer (oben in 1.1 beschrieben). Spülen Sie das Gewebe in frisch zubereiteten 4 ° C Sezieren Puffer und mit einer Schere schneiden das Rückenmark in Querrichtung in 1 cm Segmente (1E).
6. Für jedes Segment des Gewebes, mit einer Hand, um das Gewebe mit einer feinen Pinzette zu halten. Mit der anderen Hand, verwenden Mikroschere, um vorsichtig die darüberliegenden Hirnhäute, weiße Substanz, und die meisten von der grauen Substanz mit Hilfe einer Binokular. Alternativ können Sie feinen Pinzette (Dumont # 4), die meisten der grauen und weißen Substanz abziehen, so dass nur die periventrikuläre Region des Rückenmarks, die das Ependym und eine kleine Menge des umgebenden grauen Substanz (1F-H) umfasst.
7. Pool Der seziert periventrikuläre Gewebe in eine 10 cm sterile Petrischale mit kaltem Ratte Dissektion Puffer.

3. Ernte und Dissektion der erwachsenen Menschen Periventrikuläre Rückenmarksgewebe

Hinweis: Human Rückenmarksgewebe von erwachsenen Organtransplantation Spender geerntet (Spender waren im Alter von 2 bis 60 Jahre), nachdem die anderen Organe für Organtransplantation entfernt. Das Trillium-Gift of Life Programm erhält Zustimmung für die Entfernung von Gewebe für Forschungszwecke aus der Familie des Patienten und teilt unsere Ernteteam rechtzeitig, so dass wir in der Lage, um die Kabel innerhalb von 2 Stunden nach der Aorta Querspann ernten. Männlichen und weiblichen erwachsenen Spendern mit negativer Serologie und keine Infektionen werden akzeptiert.

1. Ernte-Gewebe steril in den OP-Saal durch einen ventralen Zugang unter Verwendung der gleichen vorderen Exposition bereits für Organentnahme von der Orgel transp seziertlant Ernteteam.
2. Setzen die vordere Wirbelsäule durch Abfahren mit großen Rippenverteiler und große Paddel Retraktoren der übrigen Gewebe und Organe, einschließlich der großen Blutgefäße.
3. Verwenden eine Brustbeinsäge mit einer langen Klinge, um durch die Bandscheiben in den rostralen und kaudalen Enden der gewünschten Länge der Wirbelsäule geschnitten zu resezierenden montiert. Angle die Säge etwa 45 ° nach medial um eine dreieckige Trog von der Seitenteil der Wirbelkörper bis kurz vor den Wirbelkanal zu schneiden.
4. Entfernen Sie en bloc die medialen Aspekte der Wirbelkörper der gewünschten Segmente mit Hilfe von gekrümmten Osteotome und Hammer wobei darauf zu vermeiden, schneiden durch die Dura. Heben Sie dann vorsichtig die Dura gedeckt Rückenmark mit Zahnzange und scharf einzuschneiden rostralen und kaudalen Enden der Schnur. Verwenden Sie lange Schere und Pinzette auf bilateraler Ebene durchschneiden die einzelnen Wurzeln.
5. Legen Sie das ausgeschnittene Segment des Rückenmarks in 4 °; C sterile Puffer (1x HBSS + 0,6% Glucose + 2% Penicillin-Streptomycin) in einem großen Teströhrchen für den Transport zum Zellkulturraum.


6. Hinweis: Im Allgemeinen wird eine 3-6 cm Segment des Rückenmarks von der oberen Brust- und / oder mittleren bis niedrigen Niveau des Brustraums wird im Operationssaal unter sterilen Bedingungen entfernt so schnell wie möglich nach Beendigung der Durchblutung und in kalten sterilen Puffer abgelegt . Die Zeit zwischen der Einstellung der Zirkulation und Entfernung des Rückenmarks verstrichenen Zeit variiert mit der Zeit, die erforderlich, um die gezielte Spenderorgane ernten und ist von 45 Minuten bis 2 Stunden reicht. Wenn das Herz und die Lungen wurden ebenfalls entfernt wurde, kann die Dissektion weit rostral genommen, um einen Teil des unteren Halsmark sowie zu ernten.
7. Sezieren des menschlichen Rückenmarksgewebe so bald wie möglich nach der Ernte in der Regel innerhalb von 3 Std. Entfernen Sie die Dura und andere Hirnhäute mit einer Pinzette. Spülen Sie die Rückenmarksgewebe in frisch zubereiteten 4 ° C Dissektion Puffer undSchnitt quer in 1 cm Segmente.
8. Mit Hilfe eines Binokular, Verbrauchs der darüberliegenden Hirnhäute, weiße Substanz, und die meisten von der grauen Substanz unter Verwendung von Gewebezange, feinen Pinzette und Mikroschere für jede Gewebesegment. Pool Der seziert periventrikuläre Gewebe, das Ependym und eine kleine Menge von umliegenden grauen Substanz, in eine sterile 10 cm Petrischale mit kaltem menschlichen Dissektion Puffer enthält.

4. Isolierung und Kultivierung von adulten Ratten und Human Spinal Cord NSPC

1. Führen Sie folgende Schritte unter aseptischen Bedingungen in einer Steril.
   1. Blatt vor den seziert Ratte oder des Menschen periventrikuläre Gewebe in 1 mm ³ Stück mit Mikroschere.
   2. Enzymatisch dissoziiert des zerkleinerten Gewebes mit proteolytischen Enzymen unter Verwendung des Papain-Dissoziierung Kit wie in der Tabelle von Materialien / Reagenzien angegeben. Hinweis: Reagenz Komponenten umfassen 4 Durchstechflaschen; Vial 1: Earles Balanced Salt Solution (EBSS), Vial 2: Papain mit deg L-Cystein und EDTA, Vial 3: Deoxyribonuclease I (DNase), Vial 4: Ovomucoid Proteaseinhibitor mit Rinderserumalbumin (BSA).
      Hinweis: Hinweis: Papain ist ein Sulfhydryl-Protease, die breite Spezifität für Proteinsubstrate hat. Die Papain hier wird aus dem Latex aus der Carica papaya Pflanze gewonnen und verschlechtert die meisten Proteinsubstraten umfangreicher als Pankreas-Proteasen. Während der Dissoziation Prozess gibt es einige Zellschäden verursachen DNA in die Dissoziation Medium, Viskosität zu erhöhen und machen Pipettieren schwierig erscheinen. Somit wird DNase in der Zellisolierungsverfahren eingeschlossen, um die DNA, ohne die intakten Zellen zu verdauen. Ovomucoide sind Glykoprotein-Protease-Inhibitoren verwendet, um die Papain-Aktivität nach der Dissoziation Schritt hemmen.
2. Beim ersten Gebrauch rekonstituieren das Albumin Ovomucoid Inhibitormischung (Fläschchen 4) mit 32 ml EBSS (Flasche 1), und dann bei 4 ° C und verwenden Sie für die anschließende Isolierungen.Anmerkung: Dies ergibt eine Lösung mit einer wirksamen Konzentration von 10 mg Ovomucoid-Inhibitor und 10 mg Albumin pro ml.
3. 5 ml EBSS (Gefäß 1) zu einer Papain Fläschchen (Ampulle 2), wodurch man eine Lösung mit 20 Einheiten Papain / ml in 1 mM L-Cystein mit 0,5 mM EDTA. Prüfen, ob der Papain-Lösung klar erscheint, wenn vollständig gelöst ist, da sonst die Küvette in einem 37 ° C Wasserbad für 10 Minuten, bis das Papain vollständig gelöst ist, um volle Aktivität des Enzyms zu gewährleisten.
4. Fügen Sie 500 ul EBSS (Flasche 1) zu einer DNase Fläschchen (Fläschchen 3) und vorsichtig mischen, wie DNase ist empfindlich gegenüber Denaturierung zu scheren. Man 250 ul der DNase-Lösung in das Fläschchen, das die Papain, was zu einer Endkonzentration von etwa 20 Einheiten / ml Papain und 0,005% DNase. Speichern Sie die Balance des DNase Fläschchen für die spätere Verwendung.
5. Legen Sie die gehackte Ratte oder menschlichen Gewebe in der Papain-Lösung, wie in Schritt 4.4 oben hergestellt. Für das menschliche Gewebe Isolierung, teilen Sie die zerkleinerte Gewebe gleichmäßig zwischen zweiPapain Fläschchen (etwa 0,2 g / Fläschchen).
6. Inkubieren bei 37 ° C unter konstantem Rühren auf einer Schüttelplattform, um das Gewebe in der aktivierten Papainlösung dissoziieren. Inkubieren Rattengewebe für 45 min bis 1 h und menschlichem Gewebe für 1 bis 2 Stunden in Abhängigkeit von der Menge an zerkleinertem Gewebe, etwa 0,2 bis 0,4 g.
7. Verreiben des Gemisches mit einer 10 ml-Pipette, um alle verbleibenden Gewebestücke zu trennen, um eine trübe Zellsuspension zu ergeben. Übertragen der Zellsuspension (keine Stücke undissoziierten Tissues) in einen sterilen 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugiert bei 300 g für 5 min bei RT.
8. Resuspendieren der pelletierten Zellen in Medium, das Ovomucoid, eine Papain-Inhibitor.
   1. Vorbereiten des Ovomucoids durch Mischen von 2,7 ml EBSS (Gefäß 1) mit 300 ul des rekonstituierten Albumin-Ovomucoid-Inhibitor (Fläschchen 4) in einem 15 ml konischen Röhrchen. Fügen Sie 150 ul DNase-Lösung (Fläschchen 3) in Schritt 4.4 oben gespeichert.
   2. Überstand verwerfen ausDie pelletierten Zellen und unmittelbar Zellpellet im verdünnten DNase albuminInhibitorGemisch.
9. Separate intakten Zellen aus Zellmembranen durch Zentrifugation durch einen einzigen Schritt diskontinuierlichen Dichtegradienten.
   1. Vorbereitung der diskontinuierliche Dichtegradient durch Zugabe von 5 ml Albumin-Inhibitorlösung (Flasche 4) in ein 15 ml-Röhrchen und unter Verwendung einer 5 ml-Pipette vorsichtig und langsam Schicht der Zellsuspension (hergestellt wie oben in Stufe 4.8 beschrieben) auf der Oberseite das Albumin-Inhibitorlösung.
   2. Zentrifugieren bei 70 × g für 6 Minuten bei Raumtemperatur.
   3. Anmerkung: Die Grenzfläche zwischen den beiden Schichten des Gradienten leicht sichtbar zu sein, aber nur minimale Vermischung an dieser Grenze wirkt sich nicht auf das Ergebnis. Membranfragmente verbleiben an der Grenzfläche und dissoziierte Zellen Pellet am Boden des Röhrchens.
10. Für Rattenzellen, den Überstand verwerfen und Zellpellet in 1 ml Ratten EFH Medium (bei 37 ° C vorgewärmt).Graf Lebendzelldichte mit einem Hämozytometer und Platte die Zellen in einen T25 Kulturflaschen in einer Dichte von 10 Zellen / ul in EFH. Die typische Ausbeute an Zellen von Rattengewebe ist ungefähr 2 × 10 ⁶ Zellen mit etwa 80% viability.If klonalen Kulturen erwünscht, Samenzellen in einer Dichte von weniger als 10 Zellen / ul. Die Kolben werden bei 37 ° C in 5% CO ₂ und damit die Kulturen wachsen ungestört für 1 Woche, um die Aggregation von Kügelchen zu vermeiden.
11. Für menschliche Zellen, den Überstand verwerfen und Zellpellet in 10 ml menschlichen EFH Medium (bei 37 ° C vorgewärmt). Filtern der Zellsuspension durch ein 40 um Nylon Zellsieb anschließend mit 30 ml EFH Myelin und Zellmembranfragmente zu entfernen. Zentrifuge bei 300 × g für 5 Minuten und Resuspendieren des Zellpellets in 1 ml EFH Medium.
12. Graf Lebendzelldichte mit einem Hämozytometer und Platte die menschlichen Zellen in 6-Well-Kulturplatten in einer Dichte von 10 ⁵ Zellen / Vertiefung in einem Gesamtvolumenvon 5 ml EFH / well. Die typische Ausbeute von Zellen, die aus menschlichem Gewebe beträgt ungefähr 1 × 10 ⁶ Zellen mit ca. 70% Lebensfähigkeit. Vorstrich Vertiefungen mit einer haftenden Substrat, wie Matrigel (siehe Anmerkung unten). Verdünne in einem Verhältnis von 40 ul Matrigel: 1 ml SFM.
13. Anmerkung: Alternativ können andere adhärente Substrate, wie Poly-D-Lysin / Laminin, Fibronectin oder Kollagen verwendet werden.
14. Die Inkubation erfolgt bei 37 ° C in 5% CO ₂ und damit die Kulturen für 1 Woche ungestört wachsen.

5. Passagieren von Adult Ratte und Mensch Rückenmark NSPC

1. Rat NSPC werden kleine Neurosphären etwa 70 & mgr; m im Durchmesser innerhalb 1 Woche nach anfänglichen Aussaat zu bilden; Passage Ratte NSPC wöchentlich durch das Sammeln der Zellsuspension, Zentrifugieren bei 300 xg für 5 min, und mechanisch Verreiben des Zellpellet, um die Neurosphären dissoziieren.
2. Samen der dissoziierten Zellen in T25-Kolben mit frischem Ratten EFH Medium. Alternativverwenden 50% konditioniert Ratte Medium für Passagieren. Die typische Ausbeute aus Ratten NSPC bei Passagierung etwa 5 x 10 ⁶ Zellen, die exponentiell mit der Durchlaufhäufigkeit steigt.
3. Für die menschlichen Kulturen, eine Woche nach der ersten Beschichtung, ersetzen die Hälfte des Kulturmediums mit frischen EFH zweimal wöchentlich, um damit die Zellen an dem Substrat haften. Im Allgemeinen 1-2 Wochen später, wenn die Zellen an dem Substrat befestigt, ersetzen Sie das gesamte Volumen des Kulturmediums zweimal pro Woche mit frischen EFH.
4. Subculture Zellen vor Erreichen der Konfluenz zwischen 4 - 8 Wochen.
   1. Subkultur-Zellen durch Ablösen Zellen aus dem Substrat enzymatisch (siehe Tabelle der Materialien) mit 2 ml Enzym pro Well für ca. 10 min bei 37 ° C inkubiert. Sammeln Zellsuspension, Zentrifuge bei 300 xg für 5 min, und sanft Zellpellet in 1 ml frisch zubereitete EFH Medium.
   2. Graf lebende Zellen mit einem Hämozytometer und Platte die Zellen in 6-Well-Kulturplatten (pre-coATED wie oben in Schritt 4.12) in einer Dichte von 10 ⁵ Zellen / Well in einem Gesamtvolumen von 5 ml EFH / Vertiefung. Die typische Ausbeute an Human NSPC bei Passagierung etwa 2 x 10 ⁶ Zellen und in der Regel wird dies mit dem Durchgang zu verdoppeln. Im Allgemeinen halten die Kulturen mit 50% konditioniertem Medium EFH 2-3 mal pro Woche zwischen Passagieren.

Ergebnisse

Erwachsenen Ratte Rückenmark-Zellen in Suspensionskultur in EFH Medium gezüchtet werden kleine Neurosphären (Kolonien von undifferenzierten Zellen) innerhalb 1 Woche nach anfänglichen Plattierung zu bilden. In Primärkulturen, die meisten Zellen ausplattiert sterben und Wachstumsfaktor-responsive Stammzellen proliferieren und werden in der EFH Medium ausgewählt. Durch den Durchgang 3, wird es zahlreiche frei schwebenden Neurosphären etwa 100 & mgr; m im Durchmesser (2A) sein. Neurospheres sind...

Diskussion

Während der Präparation des Rattenrückenmarksgewebe sollte darauf geachtet nicht zu beschädigen das Rückenmark während der Durchführung der Laminektomie werden. Es ist einfacher, die periventricular Gewebe zu isolieren, wenn die Rückenmarksegmente intakt sind. Die Gewebesegmente sollten in Dissektion Puffer vollständig eingetaucht werden, und die darüberliegenden Hirnhaut und weißen Substanz weg als Längsstreifen mit Mikroschere geschnitten werden. Alternativ können feine Gewebe-Zange benutzt, um die weiße...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Life Technologies	#10010023	Dissection buffer
1x HBSS	Life Technologies	#14175095	Dissection buffer
D-glucose	Sigma	# G-6152	Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	#15140-148	Dissection buffer and culture medium
Neurobasal-A	Life Technologies	#10888-022	Culture medium
L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	#25030-081	Culture medium
B27	Life Technologies	#12587010	Culture medium
DMEM	Life Technologies	#11885084	Hormone mix
F12	Life Technologies	#21700-075	Hormone mix
NaHCO3	Sigma	# S-5761	Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix
HEPES	Sigma	#H9136	Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix
Insulin	Sigma	#I-5500	Hormone mix
Apo-transferrin	Sigma	#T-2252	Hormone mix
Putrescine	Sigma	# P7505	Hormone mix
Selenium	Sigma	#S-9133	Hormone mix
Progesterone	Sigma	#P-6149	Hormone mix
EGF, mouse	Sigma	#E4127	Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
EGF, human recombinant	Sigma	#E9644	Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
bFGF, human recombinant	Sigma	#F0291	Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
Heparin, 10,000 U	Sigma	#H3149	Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium
Papain dissociation kit	Worthington Biochemicals	#LK003150	Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA
Sodium Pentobarbital	Bimeda – MTC Animal Health Inc	DIN 00141704
Tissue Forceps: Addisons	Fine Science Tools	#11006-12	Serrated standard tip; micro-tip also available
Fine Forceps: Dumont #4	Fine Science Tools	#11241-30
Microscissors	Fine Science Tools	#15024-10	Round-handled Vannas
Rongeurs	Bausch & Lomb	N1430
10 mm Petri dishes	Nunc	1501
T25 Culture flasks	Nunc	156367
40 μm nylon cell strainer	VWR	CA21008-949
6 well plates	Nunc	CA73520-906
Matrigel, growth factor reduced (100x)	Corning	354230	Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM