Isolamento de Neural Stem / células progenitoras da Região Periventricular do rato adulto e Medula Espinhal Humano

Resumo

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Resumo

Rato adulto e medula espinhal células humanas neuronais estaminais / progenitoras (NSPCs) cultivadas em meio de crescimento enriquecido com fator permite a proliferação de multipotentes, e células-tronco neurais expansíveis auto-renovação. Em condições de soro, estes NSPCs multipotentes vai diferenciar, gerando neurônios, astrócitos e oligodendrócitos. O tecido colhido é enzimaticamente dissociada em uma solução de papaína-EDTA e depois dissociados mecanicamente e separado através de um gradiente de densidade descontínuo para produzir uma suspensão de célula única que é banhado em meio neurobasal suplementado com factor de crescimento epidérmico (EGF), factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF ), e heparina. Rato adulto NSPCs medula espinhal são cultivadas como neurospheres livre flutuação e adulto humanos NSPCs da medula espinhal são cultivadas como culturas aderentes. Sob estas condições, adultos NSPCs medulares proliferam, expressam marcadores de células precursoras, e pode ser continuamente aumentada passagem. Estas células pode be estudada in vitro em resposta a vários estímulos, e factores exógenos pode ser usada para promover a restrição de linhagem para examinar a diferenciação de células estaminais neurais. Multipotentes NSPCs ou sua progénie também podem ser transplantadas em vários modelos animais para avaliar a reparação regenerativa.

Introdução

NSPCs são células multipotentes comprometidos com a linhagem neural que podem se auto renovar e expandir rapidamente in vitro. Nós nos referimos a essas células como uma população mista de células estaminais / progenitoras neurais uma vez que eles exibem propriedades de células-tronco multipotentes auto-renovação e progenitores mais restritas. NSPCs são encontradas tanto no cérebro fetal e adulto e na medula espinal ^1,2. No adulto, NSPCs são normalmente quiescentes e residir dentro nichos específicas, incluindo a zona subventricular alinhando os ventrículos laterais ^{de 2-4,} e a região periventricular torno do canal central da medula espinal ^5,6.

Normalmente, NSPCs são cultivadas como neurospheres livre flutuação ou monocamadas como aderentes em meio isento de soro suplementado com EGF e bFGF, mitogens que selecionam para as populações de células estaminais / progenitoras. O ensaio neuroesfera originalmente desenvolvido por Reynolds e Weiss ^2, é mais vulgarmente utilizado para a cultura eexpandir as células-tronco neurais. NSPCs mostram multipotência quando eles são plaqueadas em crescimento isento de factor de meio contendo soro, diferenciar-se em neurónios, astrócitos e oligodendrócitos. Multipotentes, NSPCs auto-renovação podem ser isoladas e cultivadas a partir da medula espinal roedor adulto quando o tecido cultivado inclui regiões do canal central ^6,7. Uma vantagem potencial na utilização NSPCs gerados a partir da medula espinal adulta em oposição a geração de células a partir de outras regiões é que estas células de tecidos específicos mais se assemelham células na medula espinal que são perdidas ou danificadas após a lesão ou doença.

Trabalhos anteriores mostraram que neuroesferas derivadas da medula espinal adulto humano não podia ser propagada a longo prazo ou passadas para gerar números suficientes de células de ^8,9. No entanto, com modificações em condições de cultura, nós informamos a expansão e transplante de NSPCs derivadas de medula espinhal humanos adultos, o que demonstra que a auto-renovaçãoe NSPCs multipotentes podem ser isolados a partir da medula espinal humano adulto de ¹⁰ doadores de transplante de órgãos. Em primeiro lugar, a remoção da maior parte da matéria branca durante a dissecção e a cultura destas células em um substrato aderente em meio de crescimento enriquecido com factor seleccionado para a proliferação de adultos humanos NSPCs da medula espinal. Neste protocolo, descrevemos a colheita da medula espinhal de ratos adultos e de dadores humanos de transplante de órgãos, a dissecção do tecido periventricular, e o isolamento, e expansão da cultura NSPCs.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais são aprovados pelo Comitê Animal Care da University Health Network, Toronto ON Canadá, em conformidade com as políticas estabelecidas no Guia para o Cuidado e Uso de Animais Experimentais preparados pelo Canadian Council on Animal Care. Para a colheita de tecido da medula espinhal humana, a aprovação foi obtida a partir da Investigação Conselho de Ética University Health Network e do Trillium Gift of-Life Foundation, que supervisiona a doação de órgãos em Ontário, Canadá.

1. Preparação da dissecção Buffers e Meios de Cultura

1. Para o isolamento da medula espinal de rato, a preparação de 100 ml de tampão de dissecção (1x PBS + 0,6% de glucose + 2% de penicilina-estreptomicina) e refrigerar. Para medula espinhal humana preparar 100 ml de tampão de dissecção (1x HBSS + 0,6% de glicose + 2% de penicilina-estreptomicina) e leve à geladeira.
2. Preparação de 100 ml de meio isento de soro (SFM) e aquecer a 37 ° C. Para preparar SFM, adiciona-se 2 mM de L-glutamina, 100 ug / ml-penicilina estreptomicina, 2% B27, e 10% de mistura de hormona-Neurobasal Um meio. Para preparar a mistura de hormona, fazer uma diluição 1: meio / F12 1 DMEM contendo 0,6% de glucose, 3 mM de _NaHCO3, 5 mM de HEPES, 25 ng / ml de insulina, 100 ng / ml de apo-transf errina, putrescina 10 pM, 30 nM de selénio, e 20 nM de progesterona.
3. Prepara-se o enriquecida em factor de crescimento de EFH meios seletivos (SFM para adicionar 20 ng / ml de EGF, 20 ng / ml de bFGF, e 2 ug / ml de heparina) e aquecer a 37 ° C. Certifique-se de que EFH humano contém fatores de crescimento recombinantes humanos (ver Tabela de Materiais).

2. Colheita e dissecção de rato adulto Periventricular Spinal Cord Tissue

1. Esterilizar instrumentos de dissecação em etanol e lave em soro fisiológico estéril, ou instrumentos de autoclave com antecedência. Submeter rato (6-8 semanas de idade) de uma injecção letal de pentobarbital de sódio (1 cc a 65 mg / ml) ou sobredose de anestésico (ou seja, 4% de isofluorano) de acordo com um protocolo aprovado pela instituição animal. Douse a parte traseira do rato com etanol a 70% e remover a pele na superfície dorsal com grandes tesouras de dissecação.
2. Segurando a tesoura perpendiculares à superfície dorsal, transversalmente cortar a coluna vertebral acima dos membros posteriores. Use tesouras pequenas para cortar longitudinalmente o músculo dorsal que se sobrepõe à coluna vertebral em direcção rostral para expor os processos espinhosos.
3. Começando na extremidade caudal exposto, inserir fórceps ou um pequeno instrumento de corte de osso romba extradurally para o aspecto lateral do canal vertebral no espaço entre a medula espinal e da coluna vertebral. Faça pequenos cortes na lâmina (arcos ósseos esquerda e direita dos processos espinhosos de cada lado das vértebras) e cuidadosamente descascar a lâmina para expor a medula espinhal (Figura 1A-D). Assegurar o ângulo das pás é raso e paralelo ao cabo de modo a medula espinhal subjacente não é danificado.
4. Continue laminectomy na direção rostral para exposum e da medula espinhal torácica e cervical.
5. Gentilmente extirpar a medula espinhal da coluna vertebral com uma pinça sem corte e uso microtesoura para cortar cuidadosamente as raízes para liberar o cabo. Coloque a medula espinal excisada numa placa de Petri contendo tampão de 4 ° C dissecção estéril de rato (descrito acima no ponto 1.1). Lave o tecido em tampão C dissecação 4 ° preparados na hora e usando uma tesoura cortar a medula espinhal transversalmente em 1 centímetro segmentos (Figura 1E).
6. Para cada segmento de tecido, usar uma mão para segurar o tecido com uma pinça fina. Com a outra mão, usar cuidadosamente microtesouras para remover as meninges sobrejacente, matéria branca, e a maior parte da matéria cinzenta com o auxílio de um escopo de dissecação. Em alternativa, usar uma pinça fina (Dumont # 4) para descascar a maior parte da matéria cinzenta e branca, deixando apenas a região periventricular da medula espinal que inclui o ependyma e uma pequena quantidade de matéria cinzenta circundante (Figura 1F-H).
7. A piscina do tecido periventricular dissecado em um prato de 10 centímetros estéril Petri contendo tampão dissecção rato frio.

3. Colheita e Dissecção da Human Adulto Periventricular Spinal Cord Tissue

Nota: O tecido da medula espinal humano é colhido a partir de doadores de transplante de órgãos adultos (dadores variaram na idade de 2 a 60 anos de idade) após os outros órgãos foram removidos para o transplante de órgãos. O Trillium Gift of-Life Program obtém consentimento para a remoção de tecido para fins de pesquisa de familiares do paciente e notifica a nossa equipa de colheita em uma forma oportuna de tal modo que temos sido capazes de colher os cabos dentro de 2 horas de pinçamento aórtico. Doadores adultos masculinos e femininos com sorologia negativa e não há infecções são aceitos.

1. Tecido colheita de uma forma estéril na sala de operação através de uma abordagem anterior usando a mesma exposição anterior já dissecados para remoção de órgãos pelo órgão transpequipa de colheita lant.
2. Expor a coluna vertebral anterior através de retração com grandes propagadores de costela e grandes afastadores de remo dos restantes tecidos e órgãos, incluindo os grandes vasos sanguíneos.
3. Utilize uma serra de esterno montado com uma lâmina longa para cortar através dos discos intervertebrais nas extremidades rostral e caudal do comprimento desejado da coluna vertebral a ser ressecado. Ângulo da serra cerca de 45 ° medial para cortar uma calha triangular a partir da parte lateral dos corpos vertebrais apenas evitando o canal espinhal.
4. Retirar em bloco os aspectos medial dos corpos vertebrais dos segmentos desejados com o auxílio de oste�omos curvas e malho tendo o cuidado de evitar o corte através da dura-máter. Em seguida, levante suavemente a dura coberta medula espinal com pinças dentadas e agudamente inciso as extremidades rostrais e caudais do cabo. Use a tesoura e pinça para longas transecto bilateralmente as raízes individuais.
5. Colocar o segmento excisado da medula espinhal em 4 °; C tampão estéril (1x HBSS + 0,6% de glucose + 2% de penicilina-estreptomicina) num tubo de ensaio grande para o transporte para a sala de cultura do tecido.


6. Nota: Em geral, uma 3 - segmento de 6 cm de medula espinal do torácica superior e / ou no meio-para-baixo nível torácico é removido na sala de operações sob condições estéreis, assim que possível após a interrupção da circulação e colocados em tampão estéril frio . O tempo decorrido entre a cessação da circulação e remoção da medula espinhal varia com o tempo necessário para colher os órgãos visados ​​para doação e variou entre 45 minutos e 2 horas. Se o coração e pulmões também foram removidos, a dissecção pode ser feita muito rostral para a colheita de uma porção da medula cervical inferior bem.
7. Dissecar o tecido da medula espinal humana, logo que possível após a colheita, geralmente no prazo de 3 horas. Remover a dura-máter e meninges outros com uma pinça. Lavar o tecido da medula espinhal em tampão C dissecção 4 ° frescos ecortado transversalmente em segmentos de 1 centímetro.
8. Com o auxílio de um escopo de dissecação, excisar as meninges sobrejacente, matéria branca, e a maior parte da massa cinzenta usando uma pinça, uma pinça fina e microtesouras para cada segmento de tecido. A piscina do tecido periventricular dissecados, que inclui o ependyma e uma pequena quantidade de matéria cinzenta em redor, em um prato de 10 centímetros estéril Petri contendo tampão dissecação humana frio.

4. Isolamento e Cultura de rato adulto e NSPCs da Medula Espinal Humanos

1. Execute as seguintes etapas assepticamente numa câmara de fluxo laminar.
   1. Picar o rato dissecado ou tecido periventricular humana em um milímetro ³ peças com microtesoura.
   2. Enzimaticamente dissociar o tecido moído com enzimas proteolíticas, utilizando o kit de dissociação de papaína como indicado na tabela de materiais / reagentes. Nota: Os componentes de reagentes incluem 4 frascos; Frasco 1: Solução Salina Equilibrada de Earle (EBSS), Frasco 2: contend papaínag de L-cisteína e EDTA, Frasco 3: desoxirribonuclease I (ADNase), Frasco 4: inibidor de protease ovomucóide com albumina de soro bovino (BSA).
      Nota: Nota: A papaína é uma protease sulfidrilo que tem larga especificidade para substratos proteicos. A papaína aqui é derivado do látex da planta Carica papaya e degrada a maior parte dos substratos proteicos mais ampla do que as proteases pancreáticas. Durante o processo de dissociação há algum dano celular, causando ADN a ser libertado para o meio de dissociação que vai aumentar a viscosidade e tornar difícil a pipetagem. Assim, a DNase é incluída no procedimento de isolamento de células para digerir o DNA, sem danificar as células intactas. Ovomucoids glicoproteína são inibidores da protease utilizados para inibir a actividade da papaína, após o passo de dissociação.
2. Na primeira utilização, reconstituir a mistura de inibidor de albumina de ovomucóide (4 frasco) com 32 mL de EBSS (frasco 1), e, em seguida, armazenar a 4 ° C e usado para isolamentos subsequentes.Nota: Isto produz uma solução a uma concentração eficaz de 10 mg de inibidor de ovomucóide e 10 mg de albumina por ml.
3. Adiciona-se 5 mL de EBSS (frasco 1) para um frasco de papaína (frasco 2), obtendo-se uma solução a 20 unidades de papaina / ml em 1 mM de L-cisteína com EDTA 0,5 mM. Verificar que a solução de papaína aparece clara, após dissolução completa, de outra forma colocar o frasco num banho de água a 37 ° C durante 10 minutos até que a papaína esteja completamente dissolvido para assegurar a actividade total da enzima.
4. Adicionar 500 mL de EBSS (frasco 1) para um frasco de ADNase (frasco 3) e misturar delicadamente como ADNase cisalhamento é sensível à desnaturação. Adicionar 250 ul da solução de ADNase para o frasco contendo a papaína, resultando numa concentração final de aproximadamente 20 unidades / mL de papaína e 0,005% de DNase. Guardar o equilíbrio do frasco ADNase para usar mais tarde.
5. Colocar o rato picada ou tecido humano na solução de papaína como foi preparada na etapa 4.4 acima. Para o isolamento de tecido humano, o tecido dividido igualmente entre dois picadafrascos de papaína (cerca de 0,2 g / frasco).
6. Incubar a 37 ° C com agitação constante sobre uma plataforma basculante para dissociar o tecido em solução de papaína activada. Incubar tecido de rato durante 45 min a 1 h, e os tecidos humanos durante 1 a 2 horas, dependendo da quantidade de tecido moído, cerca de 0,2-0,4 g, respectivamente.
7. Tritura-se a mistura com uma pipeta de 10 ml a dissociar quaisquer pedaços de tecido restantes para se obter uma suspensão de células turva. Transferir a suspensão de célula (não incluem quaisquer pedaços de tecido não dissociado) em um tubo de 15 ml estéril e centrifugar a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
8. Ressuspender as células peletizadas em meio contendo ovomucóide, um inibidor da papaína.
   1. Preparar a solução de ovomucóide por mistura de 2,7 mL de EBSS (1 frasco) com 300 ul da solução de inibidor de albumina-ovomucóide reconstituído (frasco 4) em um tubo de 15 ml. Adicione 150 ml de solução de ADNase (frasco 3) guardados no passo 4.4 acima.
   2. Descartar o sobrenadante a partir deas células sedimentadas e imediatamente ressuspender o sedimento de células na mistura albumina-inibidor ADNase diluída.
9. Células intactas a partir de membranas celulares separadas por centrifugação através de um único passo de gradiente de densidade descontínuo.
   1. Prepara-se o gradiente de densidade descontínuo, adicionando 5 ml de solução de albumina-inibidor (vial 4) para um tubo de 15 ml, e usando uma pipeta de 5 ml, e suavemente camada lentamente a suspensão de células (preparado como descrito acima no passo 4.8) na parte superior de a solução de albumina-inibidor.
   2. Centrifugar a 70 xg durante 6 minutos à temperatura ambiente.
   3. Nota: A interface entre as duas camadas do gradiente deverá ser claramente visível, embora mistura mínima neste limite não afecta o resultado. Fragmentos de membrana permanecem na interface e células dissociadas sedimentar no fundo do tubo.
10. Para as células de rato, descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 1 ml de meio de rato EFH (pré-aquecido a 37 ° C).Contagem de densidade de células vivas com um hemocitómetro e as células em placa num frasco de cultura T25, a uma densidade de 10 células / ul em EFH. O rendimento típico de células a partir de tecido de rato é cerca de 2 x 10 ⁶ células, com cerca de 80% viability.If culturas clonais são desejadas células de sementes, com uma densidade de menos de 10 células / ul. Incubar os frascos a 37 ° C em 5% de CO ₂ e permitir que as culturas a crescer em repouso durante uma semana para evitar a agregação das esferas.
11. Para células humanas, descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 10 ml de meio de EFH humano (pré-aquecido a 37 ° C). Filtra-se a suspensão de células através de um coador de células de 40 um seguido de nylon com 30 ml de EFH para remover fragmentos de mielina e células de membrana. Centrifuga-se a 300 xg durante 5 minutos e ressuspender o sedimento de células em 1 ml de meio de EFH.
12. Contagem de densidade de células vivas com um hemocitómetro e as células humanas placa em placas de cultura de 6 poços a uma densidade de 10 ⁵ células / poço num volume totalde 5 ml de EFH / poço. O rendimento típico de células a partir de tecido humano é de cerca de 1 x 10 ⁶ células, com cerca de 70% de viabilidade. Poços do pré-revestimento com um substrato aderente tal como Matrigel (ver nota abaixo). Dilui-se a uma razão de 40 ul de Matrigel: 1 ml de SFM.
13. Nota: Em alternativa, podem ser utilizados outros substratos aderentes, tais como poli-D-lisina / laminina, fibronectina, ou colagénio.
14. Incubar as placas a 37 ° C em 5% de CO ₂ e permitir que as culturas a crescer em repouso durante uma semana.

5. Passaging de rato adulto e NSPCs medula espinhal humanos

1. Rato NSPCs irá formar pequenas neuroesferas cerca de 70 um de diâmetro dentro de 1 semana de sementeira inicial; NSPCs passagem de rato semanais por recolha da suspensão de células, centrifugação a 300 xg durante 5 min, e triturando mecanicamente a pelete de células a dissociar as neuroesferas.
2. Semente as células dissociadas em frascos T25 contendo rato fresco meio EFH. Alternativamente,usar 50% de meio condicionado para rato passaging. O rendimento típico de NSPCs rato no passaging é de cerca de 5 x 10 ⁶ células, o que aumenta exponencialmente com o número de passagens.
3. Para as culturas humanas, uma semana após o plaqueamento inicial, substituir metade do meio de cultura fresco com EFH duas vezes por semana para permitir que as células aderem ao substrato. Geralmente, 1-2 semanas mais tarde, uma vez que as células tenham anexado ao substrato, substituir todo o volume do meio de cultura duas vezes por semana com EFH fresco.
4. Células subcultura antes de atingir confluência entre 4-8 semanas.
   1. Subcultura de células destacando as células a partir do substrato enzimaticamente (ver Tabela de Materiais) com 2 ml de enzima por poço incubado durante cerca de 10 min a 37 ° C. Recolhe suspensão de células, centrifugar a 300 xg durante 5 min, e ressuspender cuidadosamente a pelete de células em 1 ml de meio de EFH acabado de fazer.
   2. Contagem de células vivas com um hemocitómetro e as células placa em placas de cultura de 6 poços (pré-co-ATED como acima no passo 4.12) a uma densidade de 10 ⁵ células / poço num volume total de 5 ml de EFH / poço. O rendimento típico de NSPCs humanos no passaging é de cerca de 2 x 10 ⁶ células e, geralmente, isso vai dobrar com passagem. Geralmente, manter culturas com 50% de meio condicionado de EFH 2 - 3 vezes por semana entre passaging.

Resultados

Rato adulto células da medula espinhal crescidas em cultura em suspensão em meio EFH irá formar pequenas neurospheres (colônias de células indiferenciadas) dentro de uma semana de plaqueamento inicial. Em culturas primárias, a maioria das células plaqueadas morrerão de crescimento e factor de células estaminais que respondem irão proliferar e são seleccionados de EFH no meio. Por passagem 3, não haverá numerosas neuroesferas livre flutuação de cerca de 100 um de diâmetro (Figura 2A). As ...

Discussão

Durante a dissecção da medula espinal do tecido cuidados devem ser tomados para não danificar a medula espinhal durante a realização da laminectomia. É mais fácil isolar o tecido periventricular quando os segmentos da medula espinal estão intactos. Os segmentos de tecido deve ser totalmente imersa em tampão de dissecação e as meninges que recobrem e substância branca pode ser cortada como tiras longitudinais com microtesoura. Alternativamente, uma pinça fina pode ser usada para descascar a substância branc...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Life Technologies	#10010023	Dissection buffer
1x HBSS	Life Technologies	#14175095	Dissection buffer
D-glucose	Sigma	# G-6152	Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	#15140-148	Dissection buffer and culture medium
Neurobasal-A	Life Technologies	#10888-022	Culture medium
L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	#25030-081	Culture medium
B27	Life Technologies	#12587010	Culture medium
DMEM	Life Technologies	#11885084	Hormone mix
F12	Life Technologies	#21700-075	Hormone mix
NaHCO3	Sigma	# S-5761	Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix
HEPES	Sigma	#H9136	Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix
Insulin	Sigma	#I-5500	Hormone mix
Apo-transferrin	Sigma	#T-2252	Hormone mix
Putrescine	Sigma	# P7505	Hormone mix
Selenium	Sigma	#S-9133	Hormone mix
Progesterone	Sigma	#P-6149	Hormone mix
EGF, mouse	Sigma	#E4127	Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
EGF, human recombinant	Sigma	#E9644	Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
bFGF, human recombinant	Sigma	#F0291	Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
Heparin, 10,000 U	Sigma	#H3149	Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium
Papain dissociation kit	Worthington Biochemicals	#LK003150	Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA
Sodium Pentobarbital	Bimeda – MTC Animal Health Inc	DIN 00141704
Tissue Forceps: Addisons	Fine Science Tools	#11006-12	Serrated standard tip; micro-tip also available
Fine Forceps: Dumont #4	Fine Science Tools	#11241-30
Microscissors	Fine Science Tools	#15024-10	Round-handled Vannas
Rongeurs	Bausch & Lomb	N1430
10 mm Petri dishes	Nunc	1501
T25 Culture flasks	Nunc	156367
40 μm nylon cell strainer	VWR	CA21008-949
6 well plates	Nunc	CA73520-906
Matrigel, growth factor reduced (100x)	Corning	354230	Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM