Выделение стволовых нервных / клеток-предшественников из Перивентрикулярные региона взрослых крыс и человека спинного мозга

Резюме

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Аннотация

Взрослой крысы и человека спинного мозга нервные клетки стволовые / предшественники (NSPCs), культивируемые в фактор роста обогащенного среды позволяет распространением мультипотентных, самообновлению, и расширяемые нервные стволовые клетки. В сыворотке крови условий, эти мультипотентные NSPCs будет отличать, генерировать нейроны, астроциты, олигодендроциты и. Собирают ткань ферментативно диссоциируют в растворе папаина-ЭДТА, а затем механически диссоциируют и отделены через градиент плотности прерывистой с образованием суспензии отдельных клеток, которые высевают в Neurobasal среде с добавлением фактора роста эпидермиса (EGF), основной фактор роста фибробластов (оФРФ ), и гепарин. Взрослых крыс спинного мозга NSPCs культивируют в свободном обращении нейросфер и взрослых спинного мозга человека NSPCs выращивают прикрепленных культур. В этих условиях, взрослые спинного мозга NSPCs пролиферируют, экспресс-маркеры клеток-предшественников, и может быть постоянно расширяется при прохождении. Эти клетки можно бе учился в пробирке в ответ на различные стимулы, и экзогенные факторы могут быть использованы для содействия ограничение клонов изучить нейронную дифференциацию стволовых клеток. МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ NSPCs или их потомство также могут быть пересажены в различных животных моделях для оценки восстановительный ремонт.

Введение

NSPCs мультипотентны клетки, совершенные в нервной линии, что может самостоятельно возобновить и расширить легко в пробирке. Мы называем эти клетки в виде смешанного населения нейронных стволовых клеток / клеток-предшественников, поскольку они отображают свойства самообновляющихся мультипотентными стволовых клеток и клеток-предшественников более ограниченных. NSPCs найдены как в плода и взрослого головного и спинного мозга ^1,2. У взрослого, как правило, NSPCs покоя и находиться в пределах конкретных ниш в том числе субвентрикулярной зоны накладки боковых желудочков ^2-4 и перивентрикулярном области, окружающей центральный канал спинного мозга ^5,6.

Как правило, NSPCs культивируют в свободно плавающих нейросферах или в адгезивных монослоев в бессывороточной среде с добавлением EGF и оФРФ, митогены, которые отбирают для клеточных популяций стволовых / клеток-предшественников. Нейросфера анализ первоначально разработан Рейнольдса и Вайса ^2, наиболее часто используется для культуры ирасширить нервные стволовые клетки. NSPCs показать мультипотентность, когда они высевают в фактор-Free роста среде, содержащей сыворотку, дифференцируя в нейроны, астроциты и олигодендроциты,. Мультипотентных, самообновлению NSPCs могут быть выделены и культивированы с взрослого грызуна спинного мозга при культивировании тканей включает области центрального канала ^6,7. Потенциальное преимущество в использовании NSPCs, полученные от взрослого спинного мозга, в отличие от генерации клеток из других областей, что эти ткане-специфические клетки наиболее близко клеток в спинном мозге, которые утрачены или повреждены после травмы или болезни.

Предыдущая работа показала, что нейросферы полученные от взрослого человека спинного мозга не может распространяться долгосрочные или пассировать генерировать достаточное количество клеток ^8,9. Тем не менее, с изменениями в условиях культивирования, мы сообщили о расширении и трансплантации взрослых спинного мозга NSPCs полученных человека, демонстрируя, что самообновлениюи мультипотентные NSPCs может быть изолирован от взрослого человека спинного мозга трансплантации органов доноров ^10. В первую очередь, удаление большей части белого вещества при вскрытии и культивирование этих клеток на клейкого субстрата фактора роста в обогащенной среде выбраны для пролиферирующих взрослых спинного мозга NSPCs человека. В этом протоколе мы опишем сбор спинного мозга от взрослых крыс и человека от трансплантации органов доноров, рассечения перивентрикулярном ткани и выделения, культуры и расширение NSPCs.

протокол

Все процедуры на животных утверждаются Care комитета животных Сети здравоохранения университета, Торонто Канады, в соответствии с политикой, установленной в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных, подготовленных Канадского совета по уходу за животными. Для уборки ткани спинного мозга человека, утверждение было получено от Совета Сетевого университета медицинских исследований по этике и от Trillium-подарок Фонда жизни, который курирует донорства в Онтарио, Канада.

1. Подготовка вскрытия буферов и медиакультуры

1. Для выделения из спинного мозга крысы, подготовить 100 мл рассечение буфера (1X PBS + 0,6% глюкозы + 2% пенициллина-стрептомицина) и в холодильник. Для спинного мозга человека подготовить 100 мл рассечение буфера (1x HBSS + 0,6% глюкоза + 2% пенициллина стрептомицин) и поставить в холодильник.
2. Приготовьте 100 мл бессывороточной среды (SFM) и в тепле при 37 ° С. Для подготовки SFM, добавить 2 мМ L-глутамина, 100 мкг / мл пенициллина-стрептомицина, 2% B27, и 10% смесь гормон Neurobasal-средой. Чтобы приготовить смесь гормона, сделать 1: / F12 среду DMEM, содержащую 1% глюкозы 0,6, 3 мМ NaHCO _3, 5 мМ HEPES, 25 мкг / мл инсулина, 100 мкг / мл апо-трансферрина, 10 мкМ путресцина, 30 нМ селена, и 20 нМ прогестерона.
3. Подготовьте роста ОМР фактор обогащенного осажденный носитель (с УЛП добавить 20 нг / мл EGF, 20 нг / мл оФРФ и 2 мкг / мл гепарина) и теплую при 37 ° С. Убедитесь, что человек ОМР содержит человеческий рекомбинантный фактор роста (см Таблицу материалов).

2. Сбор и Препарирование взрослых крыс Перивентрикулярные ткани спинного мозга

1. Стерилизовать рассекает инструменты в этаноле и промыть в стерильном физиологическом растворе или в автоклаве инструментов заранее. Дайте крысу (6 - 8 недель) смертельная инъекция из фенобарбитала натрия (1 см на 65 мг / мл) или передозировки анестетика (например, 4% изофлуораном) в соответствии со своей института одобрил протокол животных. DУз спину крысы с 70% этанола и снимите кожу на поверхности спинного с большими ножницами рассечение.
2. Проведение ножницы перпендикулярно к поверхности спинного поперек разрезать позвоночник выше задних конечностей. Используйте ножницы, чтобы меньше в продольном направлении сократить спинной мышцы вышележащих позвоночный столб в ростральной направлении, чтобы разоблачить остистые отростки.
3. Начиная с открытой хвостового конца, вставьте кусачек или небольшой тупой кости режущего инструмента экстрадурально в латеральной части позвоночного канала в пространстве между спинного мозга и позвоночника. Сделайте небольшие порезы в пластинки (костные арки слева и справа от остистых отростков по бокам позвонков) и тщательно удаляйте пластинку, чтобы разоблачить спинного мозга (1А-D). Обеспечить угол лопастей мелкое и параллельно шнура так, основной спинной мозг не был поврежден.
4. Продолжить ламинэктомию в ростральной направлении выставкахе грудной и шейного отдела спинного мозга.
5. Аккуратно вырезать спинной мозг от позвоночного столба с тупыми щипцами ткани и использования microscissors тщательно разорвать корни, чтобы освободить кабель. Поместите вырезали спинного мозга в чашку Петри, содержащую 4 ° С стерильной крыс буфер рассечение (описанный выше в 1.1). Промойте ткань в свежеприготовленный 4 ° С рассекает буфера и с помощью ножниц вырезать спинной мозг в поперечном направлении в 1 см сегментов (рис 1E).
6. Для каждого сегмента ткани, одной рукой держать ткань с тонким пинцетом. С другой стороны, использовать microscissors тщательно удалить вышележащие мозговые оболочки, белое вещество, и большинство из серого вещества с помощью рассекает области. Кроме того, использование тонких щипцов Дюмон (4 #), чтобы очистить от самых серого и белого вещества, оставляя только перивентрикулярные область спинного мозга, который включает эпендимы и небольшое количество окружающих серое вещество (рис 1F-H).
7. Бассейн расчлененный перивентрикулярная ткани в 10 см стерильную чашку Петри, содержащую холодный крысиный буфер рассечение.

3. Заготовка и Препарирование взрослых человека Перивентрикулярные ткани спинного мозга

Примечание: Human ткани спинного мозга собирают из взрослых трансплантации органов доноров (доноры были в возрасте от 2 до 60 лет), после другие органы были удалены для трансплантации органов. Триллиум-Дар программе Life получает согласие на изъятие тканей для исследовательских целей от семьи пациента и уведомляет нашу команду уборки своевременно, так что мы смогли собрать шнуры в течение 2 часов в пережатия аорты. Мужские и женские взрослые доноры с отрицательным серологических и никаких инфекций не принимаются.

1. Урожай ткани в стерильной моды в операционной комнате через передний подхода, используя тот же передний экспозицию уже вскрывали для извлечения органов по органной транспLant команда сбор.
2. Expose передней позвоночник через втягивание с большими ребрами удобрений и крупных гребных преднатяжителями остальных тканей и органов, включая крупных кровеносных сосудов.
3. Используйте пилу грудины, установленный с длинным лезвием, чтобы прорваться через межпозвоночных дисков в ростральных и каудального концов нужной длины позвоночного столба, чтобы быть резекция. Угол пила около 45 ° медиально сократить корыто треугольную из боковой части тел позвонков остановки чуть меньше позвоночного канала.
4. Удалить целиком медиальной стороны тел позвонков желаемых сегментов с помощью изогнутых остеотомов и молотком стараясь избежать сокращения через твердую мозговую оболочку. Затем осторожно поднимите твердой мозговой спинной мозг покрыты с зубчатыми щипцами и резко надрезать ростральные и хвостовой концы шнура. Используйте длинные ножницы и пинцет, чтобы на двусторонней основе секут отдельные корни.
5. Поместите вырезали сегмент спинного мозга в 4 °С стерильной буфера (1x HBSS + 0,6% глюкозы + 2% пенициллина-стрептомицина) в большой пробирке для транспортировки к комнатной культуре ткани.


6. Примечание: Как правило, 3 - 6 см сегмент спинного мозга из верхнего грудного и / или средне-низком уровне грудной удаляется в операционной в стерильных условиях, как можно скорее после прекращения циркуляции и помещают в холодный стерильный буфер , Время, прошедшее между прекращением циркуляции и удаления спинного мозга зависит от времени, необходимого для сбора целевых органы для донорства и колебалась от 45 мин до 2 часов. Если сердце и легкие были также удалены, рассечение могут быть приняты далеко рострально собрать часть нижней шейки мозга, а также.
7. Проанализируйте спинного мозга ткани человеческого как можно скорее после сбора урожая, как правило, в течение 3 часов. Удалить твердую мозговую оболочку и другие мозговые оболочки щипцами. Промойте ткань спинного мозга в свежеприготовленный 4 ° С рассечение буфера исократить в поперечном направлении в 1 см сегментов.
8. С помощью рассекает сферу, вырезать вышележащие мозговые оболочки, белое вещество, и большинство из серого вещества, используя ткани щипцы, тонкий пинцет и microscissors для каждого участка ткани. Бассейн расчлененный перивентрикулярная ткани, которая включает в себя эпендимы и небольшое количество серого вещества, окружающего, в 10 см стерильную чашку Петри, содержащую холодный человека буфер рассечение.

4. Выделение и Культивирование взрослых крыс и человека позвоночника NSPCs шнура

1. Выполните следующие шаги в асептических условиях в ламинарном боксе.
   1. Фарш расчлененный крысу или человека перивентрикулярная ткани в 1 мм ³ штук с microscissors.
   2. Ферментативно отделить измельченной ткани с использованием протеолитических ферментов папаин комплект диссоциации, как указано в таблице материалов / реагентов. Примечание: Реагент компоненты включают в себя 4 флаконов; Флакон 1: Эрла сбалансированный солевой раствор (EBSS), флакон 2: папаин containinг L-цистеина и ЭДТА, колба 3: Дезоксирибонуклеаза I (ДНКазы), флакон 4: Овомукоид ингибитор протеазы с бычьим сывороточным альбумином (БСА).
      Примечание: Примечание: Папаин сульфгидрильная протеазы, который имеет широкий специфичность для белковых субстратов. Папаин в данном документе является производным от латекса из папайи Carica завода и ухудшает большинство белковых субстратов более широко, чем панкреатические протеазы. В процессе диссоциации есть повреждения клеток в результате чего ДНК, будет выпущен в среде диссоциации что приведет к увеличению вязкости и сделать пипетки трудно. Таким образом, ДНКазы входит в процедуре выделения клеток усваивать ДНК без повреждения интактных клеток. Ovomucoids которые гликопротеина ингибиторы протеазы, используемые для ингибирования активности папаина после стадии диссоциации.
2. При первом использовании, воссоздать ингибитор альбумина овомукоид смесь (пробирка 4) с 32 мл EBSS (пробирка 1), а затем хранят при температуре 4 ° С и используют в последующих выделений.Примечание: Это дает решение в эффективной концентрации 10 мг овомукоид ингибитора и 10 мг альбумина на миллилитр.
3. Добавляют 5 мл EBSS (пробирка 1) к папаина флакона (флакона 2), с получением раствора на 20 единиц папаина / мл в 1 мМ L-цистеина с 0,5 мМ ЭДТА. Убедитесь, что папаин решение появляется ясно, когда полностью не растворится, иначе поместите флакон в водяную баню при 37 ° в течение десяти минут, пока, папаин полностью не растворится, чтобы обеспечить полную активность фермента.
4. Добавить 500 мкл EBSS (пробирка 1) к ДНКазы флакон (флакон 3) и осторожно перемешать в ДНКазы чувствителен к сдвигу денатурации. Добавить 250 мкл раствора ДНКазы в пробирку, содержащую папаин, полученный в конечной концентрации приблизительно 20 единиц / мл папаин и 0,005% ДНКазы. Сохранить баланс ДНКазы флакон, чтобы использовать позже.
5. Поместите фарш крысу или тканей человека в папаин решения, подготовленный в шаге 4.4 выше. Для выделения тканей человека, разделить фарш ткани поровну между двумяпапаин флаконы (примерно 0,2 г / флакон).
6. Инкубируют при 37 ° С при постоянном перемешивании на качалке платформы для диссоциации ткани в раствор активированного папаина. Инкубируйте ткани крыс в течение 45 мин до 1 ч, и человеческой ткани в течение 1 2 часов в зависимости от количества измельченной ткани, около 0,2 - 0,4 г соответственно.
7. Растирают в смеси с 10 мл пипетки, чтобы отделить все оставшиеся кусочки ткани с образованием мутной суспензии клеток. Передача клеточной суспензии (не включают каких-либо кусков ткани недиссоциированной) в стерильный 15 мл коническую пробирку и центрифугируют при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
8. Ресуспендируют гранулированных клеток в среде, содержащей Овомукоид, ингибитор папаин.
   1. Подготовка овомукоид решение путем смешивания 2,7 мл EBSS (флакон 1) 300 мкл восстановленного альбумин-овомукоид раствора ингибитора (пробирка 4) в 15 мл коническую пробирку. Добавить 150 мкл раствора (флакон 3) ДНКазы, сохраненные на шаге 4.4 выше.
   2. Удалите супернатант изосажденные клетки и сразу ресуспендируют осадок клеток в разбавленных ДНКазы альбумина ингибитор смеси.
9. Отдельные неповрежденные клетки клеточных мембран центрифугированием через один шаг прерывистого градиента плотности.
   1. Подготовка градиент разрывной плотностью добавлением 5 мл альбумина раствора ингибитора (флакон 4) в 15 мл пробирку, и с помощью 5 мл пипетки, осторожно и медленно слой клеточной суспензии (полученного, как описано выше в шаге 4.8) на вершине альбумин раствора ингибитора.
   2. Центрифуга при 70 мкг в течение 6 мин при комнатной температуре.
   3. Примечание: Интерфейс между двумя слоями градиента должны быть четко видны, хотя минимальное перемешивание на этой границе не влияет на результат. Мембранные фрагменты остаются на границе раздела и диссоциированные клетки осаждения на дно пробирки.
10. Для крыс клетки, отбросить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл среды крыс EFH (предварительно нагретого до 37 ° С).Количество живой клеточной плотности с помощью гемоцитометра и пластины клеток в культуральной колбы Т25 при плотности 10 клеток / мкл в EFH. Типичный выход клеток из ткани крысы составляет около 2 × 10 ⁶ клеток с 80% viability.If клональных культур желательно, семенных клеток при плотности менее 10 клеток / мкл. Инкубируйте колбы при 37 ° С в 5% СО ₂ и позволить расти культуры в покое на 1 неделю, чтобы избежать агрегации сфер.
11. Для клеток человека, отбросить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 10 мл среды человеческого EFH (предварительно нагретого до 37 ° С). Фильтр клеточной суспензии через сито нейлона клеток 40 мкм с последующим 30 мл EFH удалить миелина и клеточные мембранные фрагменты. Центрифуга при 300 мкг в течение 5 минут и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл EFH среды.
12. Количество живой клеточной плотности с помощью гемоцитометра и пластины клетки человека в культуральных планшетах 6-луночные при плотности 10 ⁵ клеток / лунку в общем объеме5 мл ОМР / хорошо. Типичный выход клеток из тканей человека составляет около 1 × 10 ⁶ клеток с 70% жизнеспособностью. Предварительно пальто скважины со приверженцем подложки, такие как Matrigel (см примечание ниже). Развести в соотношении 40 мкл Matrigel: 1 мл SFM.
13. Примечание: В качестве альтернативы, можно использовать другие адгезивные субстраты, такие как поли-D-лизином / ламинин, фибронектин, или коллагена.
14. Инкубируйте пластин при 37 ° С в 5% СО ₂ и позволить расти культуры в покое на 1 неделю.

5. пассажи из взрослых крыс и спинного мозга человека NSPCs

1. Крыса NSPCs образуют небольшие нейросферы примерно 70 мкм в диаметре в течение 1 недели первоначального посева; Переход крыс NSPCs еженедельно путем сбора клеточной суспензии, центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин, и механически растиранием осадок клеток для диссоциации нейросферы.
2. Семенной диссоциированных клеток в Т25 колбы, содержащие свежие крыс EFh среду. В качестве альтернативы,использовать 50% кондиционного крыс среду для пересева. Типичный выход из крысиных NSPCs на пассажей около 5 х 10 ⁶ клеток, которые экспоненциально возрастает с числом пассажей.
3. Для человеческих культур, через неделю после первоначального посева, заменить половину культуральной среде со свежей EFH два раза в неделю, чтобы позволить клеткам прилипать к подложке. Как правило, 1 - 2 недели после того, как клетки прикреплены к субстрату, замените весь объем культуральной среды два раза в неделю со свежей EFH.
4. Субкультура клетки до достижения слияния между 4 - 8 недель.
   1. Субкультура клеток путем отсоединения клеток от субстрата ферментативной (табл материалов) с 2 мл фермента на лунку инкубировали в течение приблизительно 10 мин при 37 ° С. Собирают суспензию клеток, центрифугируют при 300 х г в течение 5 мин, и осторожно ресуспендируют осадок клеток в 1 мл свежеприготовленного EFH среды.
   2. Количество живых клеток с помощью гемоцитометра и пластины клеток в культуральных планшетах 6-луночные (предварительно совместноованные, как указано выше в пункте 4.12) при плотности 10 ⁵ клеток / лунку в общем объеме 5 мл EFH / а. Типичный выход человека в NSPCs пассажей около 2 х 10 ⁶ клеток и, как правило это удвоит с прохода. Как правило, поддерживать культуру с 50% условного EFH среды 2 - 3 раза в неделю между пассажами.

Результаты

Взрослый клетки крысы спинного мозга, выращенные в суспензионной культуре в среде EFH образуют небольшие нейросферы (колонии недифференцированных клеток) в течение 1 недели первоначального посева. В первичных культурах, большинство клеток высевали умрет и фактор роста реагирующих ств?...

Обсуждение

Во время вскрытия крыс спинного мозга помощи ткани должны быть приняты, чтобы не повредить спинной мозг при выполнении ламинэктомию. Это легче изолировать перивентрикулярные ткани, когда сегментов спинного мозга не повреждены. Сегменты ткани должны быть полностью погружены в рассече...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Life Technologies	#10010023	Dissection buffer
1x HBSS	Life Technologies	#14175095	Dissection buffer
D-glucose	Sigma	# G-6152	Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	#15140-148	Dissection buffer and culture medium
Neurobasal-A	Life Technologies	#10888-022	Culture medium
L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	#25030-081	Culture medium
B27	Life Technologies	#12587010	Culture medium
DMEM	Life Technologies	#11885084	Hormone mix
F12	Life Technologies	#21700-075	Hormone mix
NaHCO3	Sigma	# S-5761	Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix
HEPES	Sigma	#H9136	Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix
Insulin	Sigma	#I-5500	Hormone mix
Apo-transferrin	Sigma	#T-2252	Hormone mix
Putrescine	Sigma	# P7505	Hormone mix
Selenium	Sigma	#S-9133	Hormone mix
Progesterone	Sigma	#P-6149	Hormone mix
EGF, mouse	Sigma	#E4127	Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
EGF, human recombinant	Sigma	#E9644	Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
bFGF, human recombinant	Sigma	#F0291	Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
Heparin, 10,000 U	Sigma	#H3149	Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium
Papain dissociation kit	Worthington Biochemicals	#LK003150	Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA
Sodium Pentobarbital	Bimeda – MTC Animal Health Inc	DIN 00141704
Tissue Forceps: Addisons	Fine Science Tools	#11006-12	Serrated standard tip; micro-tip also available
Fine Forceps: Dumont #4	Fine Science Tools	#11241-30
Microscissors	Fine Science Tools	#15024-10	Round-handled Vannas
Rongeurs	Bausch & Lomb	N1430
10 mm Petri dishes	Nunc	1501
T25 Culture flasks	Nunc	156367
40 μm nylon cell strainer	VWR	CA21008-949
6 well plates	Nunc	CA73520-906
Matrigel, growth factor reduced (100x)	Corning	354230	Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM