Photostrukturierungs Proteinen und Zellen in wässriger Umgebung Mit TiO<sub&gt; 2</sub&gt; Photokatalyse

Zusammenfassung

We describe a protocol for modifying cell affinity of a scaffold surface in aqueous environment. The method takes advantage of titanium dioxide photocatalysis to decompose organic film in the photo-irradiated region. We show that it can be used to create microdomains of scaffolding proteins, both ex situ and in situ.

Zusammenfassung

Organische Verunreinigungen auf der Oberfläche eines Titandioxid _(TiO 2), adsorbiert durch Photokatalyse unter ultraviolettem Licht (UV) zerlegt werden. Hier beschreiben wir eine neuartige Protokoll unter Verwendung des _TiO 2 Photokatalyse zur Zellaffinität der Substratoberfläche lokal zu verändern. Für dieses Experiment wurde eine dünne TiO _{2 -Schicht} wurde durch Sputtern beschichtet auf einem Deckglas, und die _TiO 2 -Oberfläche wurde anschließend mit einem Organosilan Monoschicht aus Octadecyltrichlorsilan (OTS) ableitet, die die Zelladhäsion hemmt modifiziert. Die Probe wurde in einem Zellkulturmedium eingetaucht ist, und konzentrierte UV-Licht wurde auf einem achteckigen Bereich bestrahlt. Wenn eine neuronale Zelllinie PC12-Zellen wurden auf der Probe überzogen, Zellen, die nur auf die UV-bestrahlte Fläche haftet. Wir zeigen weiter, daß diese Oberflächenmodifikation kann auch in situ erfolgen, das heißt, auch wenn die Zellen auf dem Substrat wächst. Korrekte Modifikation der Oberfläche benötigt eine extrazelluläre Matrix protein Kollagen in dem Medium zum Zeitpunkt der UV-Bestrahlung vorliegen. Die hier vorgestellte Methode kann potenziell in Strukturierung mehrere Zelltypen für den Bau von Co-Kultur-Systeme oder willkürlich zu manipulieren Zellen unter Kultur eingesetzt werden.

Einleitung

Halbleiter-Lithographieverfahren und seine Derivate - wie Photolithographie ^1,2, Elektronenstrahllithographie ^3-6 und ^7-10 Mikrokontaktdruck - sind mittlerweile ein etabliertes Werkzeug in der Zellbiologie, lebende Zellen in einer definierten Position und Geometrie wachsen. Die Musterungsverfahren beruht auf der Verwendung von mikro Substrate, bestehend aus Mikro-Insel Zelle permissive Beschichtung in einem nicht-permissiven Hintergrund. Ein solches Substrat dient als Vorlage, um Muster der Zellen. Diese Technologien haben uns zur Verfügung gestellt, die die neuen Methoden, um Zellen und ihre Funktion Ingenieur bei einem Ein- und Mehrzellebene, um die inhärenten Eigenschaften von Zellen zu extrahieren, und um den Durchsatz von zellbasierten ^{Wirkstoff-Screening-11} zu erhöhen.

Der Grad Freiheits in Zellmusterungs würde erheblich zunehmen, wenn die Schablonenmustergeometrie in situ verändert werden, das heißt, während die Zellen auf den n kultivierturface. Die herkömmlichen Verfahren zur Musterbildung kann hier nicht direkt angewendet werden, da sie Verfahrensproben in der Atmosphäre oder im Vakuum. Deshalb werden verschiedene neue Oberflächenmodifikationstechniken sind vorgeschlagen worden, die basieren, zB auf photoreaktiven Verbindungen ^12,13 oder Laserablation ^5,14, um nur einige zu nennen. Die vorgeschlagenen Verfahren sind gut durch Robertus et al von Choi et al. ^{16 und} Nakanishi ¹⁷ überprüft. ^15, und in jüngerer Zeit.

Hier in diesem Artikel beschreiben wir eine neue Methode der in-situ-Oberflächenmodifizierung, die Vorteile der photokatalytischen Zersetzung von organischen Molekülen auf einem Titandioxid nimmt _(TiO 2) Fläche ^18,19. In diesem Verfahren wird ein TiO _{2 -Film} zwischen dem Glassubstrat und dem organischen Film, der die Zellen eine Schnittstelle eingeführt und der organische Film in situ durch lokales Bestrahlen mit ultravioletten (UV) zerlegtLicht in einem interessierenden Bereich (λ <388 nm). Wir zeigen, dass das neue Protokoll kann verwendet werden, um Mikrostrukturen der extrazellulären Matrixproteinen und lebenden Zellen sowohl ex situ und in situ zu erzeugen. _TiO 2 ist biokompatibel, chemisch stabil und optisch transparente, Features, von denen macht es freundlich in Zellkulturexperimenten einzuführen. Dieses Protokoll stellt eine Materialwissenschaften basierte Alternative zur Modifizierung von Zellkultur-Gerüsten in Zellkulturumgebung.

Protokoll

1. Herstellung von TiO _{2 beschichtetes} Deckglas

1. Anzahl die Deckgläser mit einem Diamantreißnadel. Dies trägt nicht nur zur Spur jedes Deckgläschen zu halten, sondern auch um sicherzustellen, dass die richtige Seite der Probe nach oben weist. Reinigen der Deck zunächst unter fließendem ddH _{2 O,} dann mit dem in Piranha-Lösung eingetaucht werden (H _{2 SO 4:} H _{2 O 2} = 4: 1). Nach 10 Minuten, spülen Sie die Deckgläser gründlich, 8-mal in _ddH 2 O. Trocknen Sie die Deckgläser _unter N 2 fließen.
2. Eingestellt TiO _{2 -Target} in der Radiofrequenz (RF) Sputtersystem. Bringen Sie die Deckgläser auf einem Probenhalter der Sputteranlage mit einem Polyimid-Band. Setzen Sie den Probenhalter in der Sputterkammer. Kammer evakuieren bis der Druck 2,0 ^× 10 -4 Pa.
3. Einzuführen Ar-Gas in die Kammer und den Abscheidungsdruck auf 4,0 mTorr. Während der Verschluss geschlossen ist, schrittweise zu erhöhendie HF-Leistung bis 70 W.
4. Öffnen des Verschlusses und Sputter für 15 min, um eine Folie mit einer Dicke von 120-150 nm (Abbildung 1: Schritt A) zu erhalten. Wachstumsrate des Films muss für jede einzelne Maschine abgeleitet werden.

2. Oberflächenbeschichtung mit Handy abweisenden Film

1. Hydrophilisierung _der TiO 2 -Oberfläche durch Behandeln der Probe mit _O 2 -Plasma, nach Anweisungen des Herstellers des Plasmareaktors bereitgestellt. Wir behandeln die Probe für 5 Minuten bei 200 W _mit O 2 Fluß von 100 sccm. Tauchen Sie die Probe in _ddH 2 O und bestätigen, dass die Oberfläche superhydrophil ist. Trocknen Sie die Oberfläche gründlich unter N _{2 -Strom.}
2. Vorbereitung 1 mM Octadecyltrichlorsilan (OTS) Lösung durch Zugabe von 39,6 ul OTS zu 100 ml Toluol gegeben. Eintauchen der Probe in die Lösung für 1 h bei RT. Führen Sie diesen Schritt innerhalb _einer N 2 -gefüllten Handschuhbeutel (Abbildung 1: Schritt B).
3. Um physisorbierte Moleküle zu entfernen, sonicate die Probe in Toluol, Aceton, Ethanol und _ddH 2 O für 5 Minuten jeden, in dieser Reihenfolge. Spülen Sie die Proben vier Mal in frischem _ddH 2 O und trocknen Sie die Oberfläche unter _einem N 2 -Strom. Sollte die Oberfläche hydrophob mit einem Kontaktwinkel von 100-110 ° betragen.

3. Ex-situ-Oberflächenstrukturierung

1. Arbeiten in einer Sterilbank, zu ziehen mehrere Kratzspuren mit einer Diamant-Reißnadel auf der Oberfläche. Die Markierungen helfen bei der Verfolgung der bearbeiteten Regionen und bringt auch Mikroskope in den Fokus. Sterilisieren der OTS-beschichteten _TiO 2 durch Eintauchen der Probe in 70% Ethanol für 5 min. Dann zweimal spülen Sie die Probe in sterilisierte ddH _{2 O}
2. Legen Sie die Probe in einem 35-mm-Schale, und 2 ml PC12 Wachstumsmedium (siehe Schritt 4.2). Inkubation für mehr als 3 Stunden in _einem CO 2 -Inkubator (37 ° C). Diese Vorgehensweise soll Serumalbumine absorbiert auf der Oberfläche zu lassen. Adsorbiert Albumine hemmen anschließende Adsorption von anderen proteIns und Zellen (1: Schritt C).
3. Während der Wartezeit, die Einrichtung des invertierten Fluoreszenzmikroskop.
   1. Schalten Sie die Bogenlampe, die UV-Filterwürfel einzufügen, und stellen Sie die Objektivlinse zu 20X.
   2. Messen der Lichtintensität I (W ^cm -2) unter Verwendung eines UV-Intensitätsmesser, und berechnen Bestrahlungszeit t (in Sekunden) für eine Dosis von d (in J ^cm -2) als: t = d / I.
      Um zum Beispiel bei einer Dosis von 200 J cm ^-2 bestrahlt unter Verwendung einer Lichtquelle von 600 mW ^cm -2, beträgt 333 sec Bestrahlung erforderlich.
   3. Verwenden Sie eine Objektmikrometer und schließen Sie die Feldblende zum Einstellen der Größe der Region zu bestrahlenden, beispielsweise 200 & mgr; m.
4. Nach 3 Stunden Inkubation ergänzen das Medium mit 200 ul 3,0 mg ^{ml-1-Typ-IV-Kollagen} (Col-IV; Endkonzentration von 300 & mgr; g ml ^-1).
5. Übertragen Sie die 35-mm-Schale auf den Mikroskoptisch. Finden Sie den Kratzer mLade Fokus des Mikroskops auf die Probenoberfläche und Bestrahlen mit UV-Licht bei einer Dosis von 200 J ^cm -2 (Abbildung 1: Schritt D). Der Bereich der UV-Bestrahlung kann entweder durch Einstellen der Öffnung der Leuchtfeldblende oder durch Ersetzen der Feldblende mit einer Metallmaske Schiedsgeometrie verändert werden.
6. Ersetzen Sie das Medium mit frischem Wachstumsmedium (ohne Col-IV), und legen Sie die Probe wieder in den Inkubator.

4. Cell Culture

1. Routinekultur von PC12-Zellen wird auf einem kollagenbeschichteten Plastikschale durchgeführt.
   1. Zur Beschichtung eines 60-mm-Gewebekulturschale mit Col-IV, zuerst die Oberfläche nass mit _ddH 2 O und saugen alle _ddH 2 O.
   2. Bereiten 300 & mgr; g ml ^-1 Col-IV durch Verdünnen der ursprünglichen Lösung (3 mg ml ^-1) 10x mit _ddH 2 O.
   3. Fügen Sie 200 ul von 300 & mgr; g ml ^-1 Col-IV pro 60-mm-Schale. Lassen Sie die durch die Oberfläche verteilt Lösung.
   4. Dry-Ter in einer Laminarströmungshaube Teller für ca. 1 Std.
   5. Die Oberfläche zweimal gründlich mit 4 ml Dulbecco-phosphatgepufferter Kochsalzlösung (D-PBS). Bei Nichtgebrauch des beschichtete Schale sofort, spülen Sie die Teller einmal mit 4 ml _ddH 2 O. Nach Absaugen _ddH 2 O, speichern Sie die Schüssel in den Inkubator. Versuchen Sie nicht, halten Sie es für mehr als zwei Wochen gelagert.
2. PC12-Zellen werden in einem Wachstumsmedium, das besteht aus gewachsen: Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (low glucose) + 10% fötales Rinderserum + 5% Pferdeserum + 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung. Inkubieren Sie die Zellen _in einem CO 2 Inkubator (37 ° C, 5% _CO 2), und ersetzen Sie jeden zweiten Tag die Hälfte des Mediums. Passage-Zellen, bevor sie zu erreichen Fluss.
   1. Saugen Sie das Wachstumsmedium, und fügen Sie 2 ml PBS ^{+ (D-PBS} + 10 mg ml ^-1 Rinderserumalbumin (BSA) + 10 mM EDTA) vorgewärmt auf 37 ° C. Inkubation für 5 min bei 37 ° C. Klopfen Sie leicht das Gericht auf alle Produkte zu lösenlls.
   2. Sammeln Zellen in einem 15 ml konischen Röhrchen. Spülen Sie die Schale mit 3 ml frischem D-PBS, auf 37 ° C vorgewärmt.
   3. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 150 · g für 4 min.
   4. Den Überstand aspirieren, und fügen Sie 1 ml des Wachstumsmediums.
   5. Für Routinekultur, teilen Sie die Zellen 1: 3 bis 1: 5.
3. Um Zellen Platte auf dem UV-modifizierte OTS _/ TiO 2 Probe zu zählen Zelldichte und fügen Sie 3,0 ^x 10 5 Zellen in einer 35-mm-Schale (Abbildung 1: Schritt E). Inkubiere die Schale in den befeuchteten Inkubator (37 ° C, 5% _CO 2) für 1-2 Tage. Naiven und der Nervenwachstumsfaktor (NGF) -differentiated PC12-Zellen können für die Strukturierung Experimente eingesetzt werden. NGF Differenzierung werden 100 ng ml ^{-1 von} 7S-NGF in das Wachstumsmedium mehrere Tage vor Ausplattieren der Zellen auf die Probe gegeben. NGF-Differenzierung scheint die Haftfähigkeit der PC12-Zellen zu erhöhen und erleichtert die Handhabung, insbesondere bei der in-situ Strukturierungs eXperimente.

5. In-Situ Oberflächenstrukturierung

1. Nach 1-2 Tagen Kultur auf die ex-situ modifizierten Oberfläche, zu bestätigen, dass die Zellen für die Befestigung und wächst nur auf dem UV-Bestrahlungsbereich. Richten Sie das Mikroskop, wie in Schritt 3.4 beschrieben.
2. Übertragung der Probe auf eine neue 35-mm-Gewebekulturschale, die das Wachstumsmedium, 100 ng ml ^-1 NGF (in dem Fall der Verwendung NGF-differenzierten Zellen) und 100 & mgr; g ml ^-1 Col-IV.
3. Die Schale auf dem Mikroskoptisch. Finden Sie die passende Position, und strahlen UV-Licht bei einer Dosis von 200 J ^cm -2 (Abbildung 1: Schritt F, G). Die neu erstellte permissive Bereich ist mit einem Sternchen in Figur 1 angegeben: Schritt G.
4. Versuchen, die Verarbeitung einer einzelnen Probe innerhalb von 30 Minuten zu vervollständigen. Nach der Bestrahlung, übertragen Sie die Probe wieder in das Medium ohne Col-IV.
5. Seien Sie besonders vorsichtig bei der Durchführung die Schale mit cultured Zellen und Überführung der Probe vom Gericht, austeilen Ablösen der strukturierten Zellen zu verhindern.

Abbildung 1. Schematische Darstellung des gesamten Prozesses. Siehe Text für Details. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Ergebnisse

2A zeigt eine Querschnittsrasterelektronenmikroskopie (SEM) -Bild der durch Sputtern abgelagerten TiO _{2 -Films.} Aus der Beobachtung wurde Dicke des Films auf ungefähr 150 nm zu sein. Hier fällt auf, die Flachheit des abgeschiedenen TiO _{2 -Films.} Weiteren Analyse durch Rasterkraftmikroskopie (AFM) ergab, dass die Wurzel aus dem mittleren quadratischen (RMS) Rauheit der Oberfläche betrug 0,2 nm (2B).

Wenn der _TiO 2 -Oberflä...

Diskussion

In unserem aktuellen Protokoll wurde _TiO 2 Film von RF-Magnetron-Sputtern gebildet. Wir bevorzugen diese Methode der Abscheidung, da es uns erlaubt, reproduzierbare Herstellung einer photokatalytischen _TiO 2 -Schicht mit einer sub-nm Rauheit. Obwohl Sputter-Abscheidungsverfahren vertraut Materialwissenschaftler und Elektronik-Ingenieure sind, kann es nicht ganz zugänglich Biologen sein. In diesem Fall würde spinnbeschichteten TiO _{2 -Films} ²³ eine Alternative sein. Bei diesem...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass coverslip	Warner Instruments	CS-15R15	15 mm diameter, #1.5 thickness
Diamond scriber	Ogura Jewel Industry	D-Point Pen
RF sputtering system	ANELVA	SPC350
TiO2 sputtering target	Kojundo Chemical Lab	Titanium (IV) oxide, target	Purity, 99.9%
Plasma reactor	Yamato	PR301
n-octadecyltrichlorosilane (OTS)	Aldrich	104817
Toluene	Wako	204-01866
Tissue-culture dish (35 mm)	Greiner	627160
Tissue-culture dish (60 mm)	BD Falcon	353002
Type-IV collagen	Nitta Gelatin	Cellmatrix Type IV
D-PBS	Gibco	14190-144
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)	Gibco	11885-084
Fetal bovine serum	Gibco	12483-020	Heat-inactivate and pass through a 0.22 μm filter before use
Horse serum	Gibco	26050-088	Pass through a 0.22 μm filter before use
Penicillin-streptomycin (100x)	Nacalai tesque	26253-84
7S nerve growth factor (NGF)	Alomone Labs	N-130
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A2153
EDTA	Dojindo	N001	Stock solution in 0.5 M
TiO2 nanoparticle	Tayca	TKD-701