Polygraphic Recording Verfahren zur Messung von Schlaf bei Mäusen

Zusammenfassung

The recording of electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in freely behaving mice is a critical step to correlate behavior and physiology with sleep and wakefulness. The experimental protocol described herein provides a cable-based system for acquiring EEG and EMG recordings in mice.

Zusammenfassung

Recording of the epidural electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in small animals, like mice and rats, has been pivotal to study the homeodynamics and circuitry of sleep-wake regulation. In many laboratories, a cable-based sleep recording system is used to monitor the EEG and EMG in freely behaving mice in combination with computer software for automatic scoring of the vigilance states on the basis of power spectrum analysis of EEG data. A description of this system is detailed herein. Steel screws are implanted over the frontal cortical area and the parietal area of 1 hemisphere for monitoring EEG signals. In addition, EMG activity is monitored by the bilateral placement of wires in both neck muscles. Non-rapid eye movement (Non-REM; NREM) sleep is characterized by large, slow brain waves with delta activity below 4 Hz in the EEG, whereas a shift from low-frequency delta activity to a rapid low-voltage EEG in the theta range between 6 and 10 Hz can be observed at the transition from NREM to REM sleep. By contrast, wakefulness is identified by low- to moderate-voltage brain waves in the EEG trace and significant EMG activity.

Einleitung

Technische Fortschritte haben oft im Verständnis der neurobiologischen Prozessen gefällte Quantensprünge. Zum Beispiel Hans Berger Entdeckung im Jahre 1929, daß elektrische Potentiale aus der menschlichen Kopfhaut aufgezeichneten die Form von Sinuswellen, deren Frequenz direkt auf das Niveau der Wachsamkeit des fachbezogenen, führte zu raschen Fortschritten im Verständnis der Schlaf-Wach- Regulierung, in Tieren und Menschen gleichermaßen. ¹ Bis heute ist das electroencephlogram (EEG), in Verbindung mit dem Elektromyogramm (EMG), dh., elektrische Aktivität von der Skelettmuskulatur produziert, stellt die Daten "Rückgrat" fast jeder experimentellen und klinischen Einschätzung, die das Verhalten und die Physiologie mit der Aktivität der kortikalen Neuronen in benimmt Tieren, einschließlich Menschen korrelieren sucht. Im einfachsten Schlafforschungslaboratorien diese EEG-Aufzeichnungen werden unter Verwendung einer kabelgebundenen System (1), wobei d erworbenen geführtata off-line, um Muster und Spektrumsanalyse unterzogen [z. B. die Anwendung einer schnellen Fouriertransformation (FFT) -Algorithmus] zum Bestimmen der Wachsamkeit des Subjekt aufgezeichnet. ^{2, 3} Schlaf besteht aus S-Augenbewegung (REM) und Nicht-REM (NREM) schlafen. REM-Schlaf wird durch einen raschen Niederspannungs-EEG, zufällige Augenbewegung und Muskelatonie, einem Zustand, in dem die Muskeln effektiv gelähmt ist. REM-Schlaf ist auch als paradoxer Schlaf bekannt, weil die Aktivität des Gehirns ähnelt der Wachheit, während der Körper ist weitgehend getrennt vom Gehirn und scheint in tiefen Schlaf. Im Gegensatz dazu werden Motoneuronen während der NREM-Schlaf stimuliert aber es gibt keine Augenbewegung. 4 Hz im EEG - Human NREM-Schlaf kann in 4 Stufen, wobei Stufe 4 wird als Tiefschlaf oder Tiefschlaf und wird von großen, langsamen Gehirnwellen mit Delta-Aktivität zwischen 0,5 identifiziert aufgeteilt werden. Auf der anderen Seite, eine Unterteilung zwischen den Phasen des NREM-Schlaf in kleinere Tiere, wie Ratten einnd Mäusen, wurde nicht untersucht, vor allem, weil sie nicht über lange Konzernschlafperioden, wie in den Menschen gesehen.

Im Laufe der Jahre, und auf der Basis von EEG Auslegung, mehrere Modelle von Schlaf-Wach-Regelung, sowohl leitungs- als auch humorale-basierte, wurden vorgeschlagen. Das neuronale und zelluläre Grundlage des Schlafbedürfnis oder alternativ "Schlaf-Antrieb," bleibt ungelöst, aber wurde als homöostatischen Druck, der während der Wachperiode baut und wird durch Schlaf abgeführt konzipiert worden. Eine Theorie ist, dass endogene somnogenic Faktoren im Wachzustand und ihre allmähliche Ansammlung ist der Unterbau des Schlafes homöostatischen Druck aufzubauen. Während die erste formelle Hypothese, dass durch humorale Faktoren Schlaf reguliert hat Rosenbaum Arbeit veröffentlicht im Jahre 1892 ⁴ gutgeschrieben ist, war es Ishimori ^{5, 6 und} Pieron ^7, die unabhängig voneinander und vor über 100 Jahren, zeigte die Existenz von schlaffördernde Chemikalien. Beide Forscher vorgeschlagen, und in der Tat bewiesen, dass Hypnogenic Stoffe oder 'hypnotoxins' in der Rückenmarksflüssigkeit (CSF) von übermüdeten Hunde anwesend waren. ⁸ Im Laufe des letzten Jahrhunderts einige zusätzliche mutmaßliche Hypnogenic Substanzen im Schlaf homöostatischen Prozess verwickelt sind identifiziert worden (für eine Übersicht siehe ref. 9), einschließlich Prostaglandin (PG) D _{^2, 10} Cytokine, ¹¹ Adenosin, ¹² Anandamid, ^{13 und dem} Urotensin-II-Peptid. ¹⁴

Experimentelle Arbeiten von Economo ^{15, 16,} Moruzzi und Magoun ^17, und andere in den frühen und mittleren ^20. produziert Erkenntnisse Jahrhundert, das zu einem gewissen Grad inspiriert leitungsbasierten Theorien von Schlaf und Wachsein, und, überschattete die dann herrschenden humorale Theorie Schlaf. Bis heute mehrere "Schaltungsmodelle" wurden vorgeschlagen, die jeweils von Daten unterschiedlicher Qualität und Quantität informiert (zur Übersicht siehe Ref. 18). Ein ModellBeispielsweise schlägt vor, langsame Wellen Schlaf wird durch Adenosin-vermittelte Hemmung der Acetylcholin-Freisetzung aus cholinergen Neuronen im basalen Vorderhirn, eine Fläche hauptsächlich consisiting des Kerns des horizontalen Schenkels des diagonalen Bandes von Broca und Substantia inominata generiert. ¹⁹ Ein weiteres beliebtes Modell der Schlaf- / Wach-Regulation wird eine Flip-Flop-Schaltmechanismus auf der Grundlage von gegenseitig hemmenden Wechselwirkungen zwischen einschläfernde Neuronen im ventrolateralen präoptischen Bereich und Wake-Induktion Neuronen im Hypothalamus und Hirnstamm. ^{18, 20, 21} Außerdem wird für die Umschaltung in die und aus der REM-Schlaf eine ähnliche ineinander inhibitorische Wechselwirkung wurde für Bereiche im Hirnstamm vorgeschlagen worden sind, ist, dass die ventralen periaqueductal grau, seitlichen Brückenhaube und sublaterodorsal Kern. ^22. Zusammengenommen haben diese Modelle nützlich erwiesen Heuristik und lieferte wichtige Interpretationsrahmen für die Studien in der Schlafforschung; jedoch ein yet besseren Verständnis der molekularen Mechanismen und Schaltungen Regulierung des Schlaf-Wach-Zyklus wird eine vollständigere Kenntnis seiner Komponenten. Das System für die Druck- und Papierschneide Aufnahme unten detailliert sollte in diesem Ziel zu unterstützen.

Protokoll

Ethics Statement: Verfahren, die Tier Themen wurden von der Institutional Animal Experiment Ausschusses an der Universität Tsukuba genehmigt.

1. Herstellung der Elektroden und Kabel für EEG / EMG Recordings

1. Vorbereitung EEG / EMG-Aufzeichnung Elektrode nach dem folgenden Verfahren.
   Hinweis: Die Elektroden wegwerfbar und kann nur für 1 Tier verwendet werden. Planen Sie sorgfältig die Verdrahtung für alle Anschlüsse. Zeigen Markierungen an den Anschlüssen für die richtige Ausrichtung.
   1. Löten Sie jeden Stift von einem 4-Pin-Header an eine 2-cm Edelstahldraht. Kurz gesagt, halten Sie das eine Ende des Drahtes an den Stift, legen Sie einen heißen Lötkolben auf den Draht-Bolzengelenk und schmelzen etwas Lötzinn zu gewährleisten, dass gerade genug Lot läuft reibungslos in das Gelenk. Seien Sie vorsichtig, nicht zu viel Wärme an das Stift anzuwenden; andernfalls wird der Kunststoff um die Stifte zu schmelzen.
   2. Löten Sie das freie Ende von jedem der 2 Drähte an die Stiftleiste am Kopf befestigtaus einem rostfreien Stahlschraube 1.0 mm Durchmesser. Kurz gesagt, halten Sie das freie Ende des Drahtes an den Thread unter dem Schraubenkopf, legen Sie einen heißen Lötkolben auf den Draht-Verschraubung und schmelzen etwas Lötzinn zu gewährleisten, dass gerade genug Lot läuft reibungslos in das Gelenk. Die 2 Adern mit Schrauben dienen als EEG-Aufzeichnungselektroden, während die 2 Adern ohne Schrauben dienen als EMG Aufzeichnungselektroden.
   3. Mit einer Schere abzustreifen 1 mm der Isolierung am Ende der EMG-Elektroden, um die Qualität des EMG-Signals zu erhöhen.
   4. Alle verlötet Pins mit Epoxid-Klebstoff vollständig zu bedecken, indem Sie einen dünnen Holzstab oder Zahnstocher, um die elektrische Geräusche während des EEG / EMG-Aufnahmen zu reduzieren.
2. Bereiten Sie ein Kabel für die Verbindung der Elektrode mit dem Schleifring, wie unten beschrieben. Dieses Kabel kann wieder verwendet werden.
   1. Löten Sie jeden Stift von einem 4-poligen FFC / FPC-Steckverbinder mit einem Draht aus einem 30-cm-Flachkabel. Kurz gesagt, halten Sie die abisolierten Ende des Drahtes an den Stift, legen Sie einen heißen Lötkolbenauf den Draht-Bolzengelenk und schmelzen etwas Lötzinn zu gewährleisten, dass gerade genug Lot läuft reibungslos in das Gelenk.
      Hinweis: Wählen Sie die Länge des Flachkabels, die für die Höhe des Versuchstieres Käfig für EEG / EMG-Aufnahmen verwendet angemessen ist.
   2. Lötmittel Crimpbuchsen zu einer Spitze der Adern am anderen Ende des Flachkabels. Kurz gesagt, halten eine Crimp-Buchse mit dem abisolierten freien Ende des Drahtes, legen Sie einen heißen Lötkolben auf den Draht Gelenk und schmelzen etwas Lötzinn zu gewährleisten, dass gerade genug Lot läuft reibungslos in das Gelenk.
   3. Legen Sie jeweils Crimp Buchse in eine 4-Position Crimp-Gehäuse.
   4. Vollständig zu bedecken den Crimp-Buchsen mit Epoxid-Klebstoff mit Hilfe eines dünnen Holzstab oder Zahnstocher.

2. Die Implantation von Elektroden in der Maus-Kopf (Dauer: ca. 20 Min.)

1. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Werkzeugen in eine heiße Perle Sterilisator vor der Operation. Betäuben männlichen Maus (10 - 20 Wochen alt, 20 bis 30 g)mit einer intraperitonealen Injektion von Pentobarbital (50 mg / kg). Nach der Überprüfung, dass die Maus tief durch Kneifen eine Zehe betäubt, rasieren Sie die Haare auf dem Kopf und Hals mit Klipper.
2. Bewegen Sie die Maus an den stereotaktischen Rahmen, und befestigen Sie den Kopf zwischen den 2 Ohr-Bars. Vaseline auf die Augen bis zur Trockenheit zu verhindern. Reinigen Sie die rasierte Haut mit Alkohol und schneiden Sie es entlang der Mittellinie mit einem Skalpell, um den Schädel freizulegen. Clip der Haut, um das Operationsfeld offen zu halten.
3. Durch die Verwendung eines Hartmetallfräser (Bohrergröße: 0,8 mm Durchmesser), 2 Löcher in den Schädel, einen über den frontalen kortikalen Bereich (1 mm anterior Bregma, 1,5 mm lateral der Mittellinie) und die andere über den Scheitelbereich ( 1 mm anterior lambda, 1,5 mm lateral zur Mittellinie) der rechten Hemisphäre nach stereotaktischen Koordinaten des Paxinos und Franklin. ²³
4. Durch die Verwendung von Schraubendreher ein Juwelier, Ort, Edelstahl EEG-Aufzeichnung Schrauben in den Löchern und 2 - 2,5 Umdrehungen pro screw für die epidurale Positionierung über dem Kortex.
   Hinweis: Schrauben zu tief, um Schäden am Hirngewebe zu verhindern, stecken. Überprüfen Sie, dass die Schrauben fest am Schädel befestigt. Dies ist wichtig, um eine stabile EEG-Signale über einen langen Zeitraum von mehreren Aufnahmen (typischerweise mehr als 1 Monat) zu haben. Wiggly Schrauben produzieren EEG Artefakten und kann sich lösen, bevor das Ende des Versuchsplan.
5. Befestigen Sie den Elektroden-Einheit (siehe Abschnitt 1.1, wandte Stifte nach oben) mit Sekundenkleber auf den Schädel und Abdeckung mit Zahnzement. Stellen bilateral kleine Löcher mit einer Pinzette in den trapezius (Hals) Muskeln und legen Sie die Drähte aus rostfreiem Stahl, die als EMG-Elektroden in die Löcher zu dienen. Naht der Haut mit einem Seidenfaden (0,1 mm Durchmesser), um die Exposition des Muskels zu vermeiden.
6. Entfernen Sie die Maus von der stereotaktischen Rahmen. Verabreichen Ampicillin (100 mg / kg) und Meloxicam (1 mg / kg) intraperitoneal an der Maus, um eine bakterielle Infektion zu verhindern und postoperativen Schmerzen zu verringern sind. Keep der Maus auf ein Heizkissen und zu überwachen, bis es ausreichend, das Bewusstsein wiedererlangt, um Brustlage zu halten. Haus der Maus einzeln während der Wiederherstellung, um das Entfernen von Elektroden zu vermeiden, von anderen Tieren, und zu verwalten, Meloxicam (1 mg / kg) intraperitoneal am ersten Tag nach der Operation.

3. Aufnahme und den Erwerb von EEG / EMG Daten

1. Nach einer 1-wöchigen Erholungsphase, Haus jede Maus einzeln in einem Versuchskäfig in einem schalldichten Aufnahmekammer angeordnet. Pflegen Sie eine Umgebungstemperatur von 23 ± 1 ° C und automatisch zu steuern Zyklen von 12 Stunden Licht / 12 Stunden Dunkelheit (Licht an um 08:00 Uhr, Beleuchtungsstärke ~ 100 lux).
2. Schließen Sie das EEG / EMG-Elektroden-Einheit auf der Maus Kopf auf ein Aufzeichnungskabel. Sicherzustellen, dass der Aufnahmekabel ist mit einem Schleifring (die so ausgelegt ist, dass Bewegungen der Maus werden durch Verdrehen des Kabels eingeschränkt) und einen EEG / EMG-Signalverstärker verbunden ist. Filter EEG / EMG-Signale (EEG, 0,5-64 Hz; EMG, 16-64 Hz), Digitalisieren bei einer Abtastrate von 128 Hz durch einen Analog-Digital-Umsetzer (A / D) und schließlich auf einem Computer läuft EEG / EMG Aufnahmesoftware (4 ^th Eintragstabelle "Materialien", aufzeichnen von unten).
3. Gewöhnen Sie die Maus für 2 - 3 Tage im Aufnahmeraum. Wenn das EEG / EMG Aufzeichnung enthält intraperitoneale Drogen Verwaltungen, vorsichtig handhaben Sie die Maus auf jeder Gewöhnung Tag zum Zeitpunkt der Verabreichung des Arzneimittels.
4. Anschließend starten EEG / EMG-Recording-Software (Tabelle ^{"Materialien",} 4. Eintritt von unten).
   1. Wählen Sie die "Daten Datei-Informationen" und klicken Sie das Kontrollkästchen neben dem Dateinamen. Geben Sie einen Dateinamen ein und klicken Sie auf "Speichern".
   2. Wählen Sie die Registerkarte "Aufnahmebedingungen", und wählen Sie alle EEG / EMG-Kanäle, die aufgezeichnet werden sollen.
   3. Wählen Sie die Sampling-Frequenz (128 Hz) auf der Registerkarte "Aufnahmezustand".
   4. Überprüfen Sie, ob die ausgewählten Kanäle richtig in th angezeigt'Kanalinformation "Tab e.
   5. Wählen Sie die Registerkarte "Timer-Einstellung" und klicken Sie auf "Monitor", um EEG- und EMG-Anzeige.
   6. Überprüfen Sie, ob EEG / EMG-Signale werden korrekt angezeigt.
   7. Wählen Sie die Registerkarte "Timer-Einstellung" und stellen Sie die Uhrzeit für den Beginn und das Ende der Aufnahme in die "Haupt Timer 'Bereich.
   8. Klicken Sie auf "Monitor" in der Registerkarte "Timer-Einstellung", um die Aufnahme zu starten.
5. Nehmen EEG / EMG-Signale im Basislinie (dh., Schlaf / Wach-Verhalten eines frei verhalten Maus) und verschiedenen Behandlungsbedingungen (z. B. Koffein Verwaltung oder Scheinbehandlung) über mehrere Tage. Euthanize die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Pentobarbital (200 mg / kg) nach der letzten Versuchstag.

4. Bewertung der Verhaltenszustand Basierend auf EEG / EMG Daten

1. Starten Sie die Software für EEG / EMG-Analyse (Tabelle ^{"Materialien",} 4. Eintritt von unten). Öffnen Sie die EEG / EMG Rohdaten (.kcd-Datei) unter dem Schritt 3 hergestellt Klicken Sie auf die Registerkarte "Schlaf" und wählen Epoch Zeit. Wählen Sie 10 Sek.
2. Klicken Sie auf die Registerkarte "Schlaf" und wählen Sie "Multi-Screening", um alle 10-sec Epochen automatisch ein Tor in 3 Stufen (dh., NREM und REM-Schlaf und Wachzustand) auf der Grundlage der Amplituden der EEG- und EMG-und Power-Spektralanalyse des EEG. ³
3. Klicken Sie auf 'FFT Bedingung für EEG ".
4. Stellen Sie die Parameter für die Strom Spektralanalyse [256 Bezugspunkte (entspricht 2 sec der EEG), Hanning-Fensterfunktion, und der Durchschnitt von 5 Spektren pro Epoche]. ^{3 Klicken Sie auf} "OK".
5. Klicken Sie auf "Start Screening", um die automatische Screening beginnen. Öffnen Sie die erzielte Daten (.raf Datei).
6. Überprüfen Sie die Ergebnisse der automatischen Screening und, falls erforderlich, korrigieren Sie diese manuell auf der Grundlage der Standardkriterien (siehe Repräsentative Ergebnisse, 1B und Tabelle 1 ). ^{2, 3} kurz, klicken Sie mit gedrückter linker Maustaste auf ein falsch bewertet Epoche und ziehen Sie den Cursor über die Kette von falsch bewertet Epochen. Lassen Sie die linke Maustaste und wählen Sie den richtigen Verhaltenszustand im Popup-Fenster.
   Hinweis: Gelegentlich gibt Epochen am Übergang zwischen zwei Zuständen wachsam schwierig, eindeutig einem Zustand punkten. In solchen Fällen sollte die Zeit zum scheinbaren Zustand erzielt werden, und die gleichen Kriterien sollten ähnliche Epochen während des Experiments angewandt werden, um Daten Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.

Ergebnisse

1B veranschaulicht Beispiele der Maus EEG in den verschiedenen Wachsamkeit Staaten. Wie in Tabelle 1 gezeigt, sind Epochen NREM-Schlaf klassifiziert, wenn das EEG zeigt große, langsam Gehirnwellen mit einem Delta Rhythmus unterhalb von 4 Hz und die EMG nur eine schwache oder kein Signal. Epochen wie REM-Schlaf klassifiziert, wenn das EEG zeigt schnellen Niederspannungs-Gehirnwellen in Theta-Bereich zwischen 6 und 10 Hz und die EMG zeigt eine geringe Amp...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt ein Set-up für EEG / EMG-Aufnahmen, die die Bewertung von Schlaf und Wachsein unter geräuscharme, kostengünstige und Hochdurchsatzbedingungen ermöglicht. Aufgrund der geringen Größe des EEG / EMG Elektrodenkopfanordnung kann dieses System mit anderen Implantaten zur intra-Hirn Versuche einschließlich Optogenetik (Glasfaser-Implantation) oder in Verbindung mit gleichzeitiger Kanüle Implantation Mikroinfusion von Medikamenten in die Maus kombiniert werden Gehirn. ^31. Darüber...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-pin header	Hirose	A3B-4PA-2DSA(71)
Ampicillin	Meiji Seika
Analog-to-digital converter	Contec	AD16-16U(PCIEV)
Caffeine	Sigma	C0750
Carbide cutter	Minitor	B1055
Crimp housing	Hirose	DF11-4DS-2C
Crimp socket	Hirose	DF11-30SC
Dental cement (Toughron Rebase)	Miki Chemical Product
Epoxy adhesive	Konishi	#16351
FFC/FPC connector	Honda Tsushin Kogyo	FFC-10BMEP1(B)
Flat cable	Hitachi Cable	20528-ST LF
Instant glue (Aron Alpha A)	Toagosei	N/A
Meloxicam	Boehringer Ingelheim	N/A
Pentobarbital	Kyoritsu Seiyaku	N/A
Signal amplifier	Biotex	N/A
Sleep recording chamber	APL	N/A
SleepSign software	Kissei Comtec	N/A	for EEG/EMG recording/analysis
Slip ring	Biotex	N/A
Stainless steel screw	Yamazaki	N/A	φ1.0 × 2.0
Stainless steel wire	Cooner Wire	AS633